華智銳，李小玲

(商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西 商洛 726000)

黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)為唇形科黃芩屬的多年生草本植物，根部入藥，有調(diào)節(jié)血脂、抗病毒、抗菌、消炎、除熱安胎、涼血、止血等功效，是常用大宗中藥材之一[1]。近年來，黃芩在黃酮類提取物和中藥生產(chǎn)等方面具有很高的應用價值，其在藥材市場需求量巨大。由于野生黃芩資源的人工采集過于嚴重，市場上黃芩生產(chǎn)的主要來源仍然依賴于人工引種、馴化、田間栽培，土壤鹽漬化的加劇對黃芩的生產(chǎn)構(gòu)成了很大的危害[2]。

當今世界，土地鹽漬化和水資源短缺嚴重影響了農(nóng)作物的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境的改善。在我國大部分黃芩產(chǎn)區(qū)，黃芩的生長過程均會遇到程度不同的鹽脅迫傷害，干濕變化造成鹽分在土壤中逐漸積累。水分是重要的生態(tài)環(huán)境因子，短期的鹽脅迫條件在一定程度上能改變藥用植物中必要代謝過程產(chǎn)物的積累與合成[3]。鹽脅迫會使植物的生理生化特性發(fā)生明顯改變，打破植物中活性氧的正常產(chǎn)生，導致細胞內(nèi)積累過多的活性氧，從而影響植物的正常生長發(fā)育過程，比如細胞膜系統(tǒng)受到損壞、丙二醛(MDA)含量升高、抗氧化能力、滲透調(diào)節(jié)能力下降等。為了緩解和消除植物受到的氧化脅迫，植物細胞內(nèi)出現(xiàn)了包括由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等組成的抗氧化酶防御系統(tǒng)。植物體抵抗鹽等脅迫的機制之一就是增加脯氨酸含量，其作為一種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，可以防止水分外流，使作物體內(nèi)的水勢下降，同時起到對細胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)的保護作用。利用添加外源物對植物進行處理，是目前一種普遍用于提高植物抗逆性的簡便方式。

油菜素內(nèi)酯(BR)是一種甾體類化合物，又稱蕓苔素或蕓苔素內(nèi)酯，具有調(diào)控植物的根莖伸長、種子萌發(fā)、葉片伸展等功能，其生理生化活性已明顯超過現(xiàn)有的乙烯、生長素和細胞分裂素等5大激素，被國際上譽為第6大激素[4]，它被認為是一種高活性的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。它屬于甾醇類植物激素，在植物對非生物或生物脅迫的反應中發(fā)揮著重要的作用。它在極低濃度下對植物表現(xiàn)出強烈的生理和生化作用。有研究表明，BR可以提高作物在各種不利因素生長下的抗性，比如干旱[5]、低溫[6]、鹽害[7]、低氧[8]等，可有力地促使鹽脅迫下植物種子的萌發(fā)和幼苗生長，提高植物葉片光合能力，增強抗氧化酶的活性，降低質(zhì)膜通透性和膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量[9]，且BR的不同處理方式和不同處理濃度對鹽脅迫下植物的處理結(jié)果不盡相同[10-11]。BR在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應用于促進植物生長、改善植物的生理代謝及提高植物抗逆性等[12]。在鹽脅迫條件下，施用外源BR可以增加可溶性糖和脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，從而保持植物細胞膨壓，起到降低和緩解植株在鹽脅迫條件下遭受的迫害程度。

迄今為止，有關(guān)對黃芩生產(chǎn)和栽培的研究主要集中在生理生化方面[13-15]，但通過添加BR緩解黃芩鹽脅迫傷害的研究未見報道。本研究通過查閱文獻，參考前人研究基礎(chǔ)，以盆栽商洛一年生黃芩幼苗作為試驗材料，開展通過添加適宜外源物濃度增強黃芩抗鹽性和降低鹽脅迫對黃芩的脅迫研究，探究不同濃度的油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫條件下商洛黃芩幼苗生理生化指標的影響，以期為地方黃芩的合理栽培和抗逆性生理方面的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采自商洛商山中藥材種植基地的商洛一年生黃芩幼苗。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃芩的盆栽育苗 先將4月中旬采回的一年生黃芩幼苗移栽到20 cm直徑的花盆中，育苗培養(yǎng)15 d，再選取長勢均勻一致的黃芩幼苗進行試驗處理。

1.2.2 黃芩的鹽脅迫處理 配置0.5% NaCl溶液[2]；先取無水乙醇少量溶解油菜素內(nèi)酯，再加適量蒸餾水稀釋配制成濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L的油菜素內(nèi)酯處理溶液；設(shè)置蒸餾水為CK1,以添加0.5% NaCl處理為CK2。每天10:00時，采用葉面噴施的方法對黃芩幼苗葉片進行處理，正反兩面葉片按要求均勻噴施。

本試驗設(shè)置7個處理。處理1(CK1)：蒸餾水；處理2(CK2)：蒸餾水+0.5% NaCl；處理3(T3)：0.1 mg/L BR+0.5% NaCl；處理4(T4)：0.2 mg/L BR+0.5% NaCl；處理5(T5)：0.3 mg/L BR+0.5% NaCl；處理6(T6)：0.4 mg/L BR+0.5% NaCl；處理7(T7)：0.5 mg/L BR+0.5% NaCl。重復3次，每處理為一盆3株苗。處理15 d后，選取長勢均勻一致的良好植株，測定其幼苗的SOD、POD、CAT酶活性，以及MDA和脯氨酸含量，以篩選在鹽脅迫下黃芩幼苗生長的適宜BR處理濃度。

1.3 指標測定

1.3.1 丙二醛(MDA)含量的測定 MDA含量采用TBA(硫代巴比妥酸)法[2]。

MDA含量的計算公式：

MDA含量/(μmol/g)=[6.45×(D532-D600)-0.56D450]×0.015/W

式中：D450表示在450 nm波長下測得的吸光值，D532表示在532 nm波長下測得的吸光度值，D600表示在600 nm波長下測得的吸光度值，W為樣品鮮重(g)。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定 SOD活性測定采取氮藍四唑(NBT)法[2]。

SOD活性的計算公式：

SOD總活性/(U/g FW)=(ACK-AE)×V/(W×0.5×ACK)

SOD總活性以每克樣品鮮質(zhì)量的酶單位表示(U/g)，式中ACK為光照對照管中反應液的吸光值，AE為樣品管中反應混合液的吸光值，V為樣品液總體積(mL)，W為黃芩幼苗的鮮重(g)。

SOD比活性的計算公式：

SOD比活性/(U/mg)=SOD總活性/蛋白質(zhì)濃度

1.3.3 過氧化物酶(POD)活性的測定 POD活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法[2]，酶液20 μL+反應液3 mL于比色皿中，在470 nm波長下每隔1 min讀數(shù)吸光度1次，共讀3次，以1 min內(nèi)△A470變化0.01為1個POD酶活性單位(U)。

POD活性的計算公式：

POD活性/[U/(min·g)]= △A470×V/Va/W=△A470×5/0.02/0.5=△A470×500

式中△A470為反應時間內(nèi)OD的變化值，V為提取酶液總體積(mL)，W為黃芩葉片的鮮重(g)，Va為測定指標時所取用酶液的體積(mL)。

1.3.4 過氧化氫酶(CAT)活性的測定 CAT反應液：H2O25 mL+pH值7.0的磷酸緩沖液20 mL(按1∶4的比例)混勻。

CAT活性的測定：0.1 mL酶液+2.5 mL反應液，在波長240 nm下用石英比色皿比色，每隔1 min讀數(shù)1次，共讀數(shù)3次,以1 min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個CAT酶活性單位(U)。

CAT活性的計算公式:

CAT活性/[U/(min·g)]=△A240×V/Va/W=△A240×5/0.05/0.5=△A240×200

式中△A240為反應時間內(nèi)OD的變化值，V為提取酶液總體積(mL)，W為黃芩葉片的鮮重(g)，Va為測定指標時所取用酶液的體積(mL)。

1.3.5 脯氨酸含量的測定 脯氨酸含量的測定采用水合茚三酮法[2]：取鮮樣0.3 g葉片加入5 mL 3%磺基水楊酸，沸水浴10 min后，冷水浴，吸取上清液2 mL、空白管加入2 mL蒸餾水、2 mL冰乙酸、3 mL酸性茚三酮，沸水浴40 min。將溶液進行冷水浴，各管加入5 mL甲苯，充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)，靜置液體分層后吸取上層甲苯層，然后用分光光度計測定A520。

脯氨酸含量的計算公式：

脯氨酸含量/(μg/g)=C×V/Va/W

式中C為脯氨酸濃度，V為提取酶液總體積(mL)，W為黃芩葉片的鮮重(g)，Va為測定指標時所取用酶液的體積(mL)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2016和SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下黃芩幼苗MDA含量的影響

細胞內(nèi)MDA含量的高低可以有效地反映脅迫引起的植物細胞膜損傷程度。從圖1可知，在0.5% NaCl脅迫下，CK2的黃芩幼苗葉片中MDA含量高于CK1，增加了50.00%。與CK2相比，外施0.1 mg/L BR處理能有效降低MDA含量，但未達顯著差異水平；而外施0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L BR處理的MDA含量分別比CK2降低了4.76%、29.76%、36.90%、23.81%，且存在顯著性差異(P<0.05)。說明外施不同濃度的BR處理都能不同程度地降低植物細胞的MDA含量，且在0.1～0.5 mg/L BR濃度梯度中，0.4 mg/L BR的處理效果最好。

小寫字母表示在0.05水平上的差異顯著性，字母不同則差異顯著，字母相同則不顯著。下同。

2.2 油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下黃芩幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響

從圖2可見，與CK1相比，CK2的黃芩葉片的SOD、POD、CAT酶活性分別提升了43.94%、14.24%和23.05%，說明黃芩幼苗能承受濃度比較低的鹽脅迫。與CK2相比，采用不同濃度的BR處理均能不同程度地提高黃芩幼苗葉片中的SOD活性，其中以0.5 mg/L BR處理的效果為最佳，顯著提高了63.95%(P<0.05)。與CK2相比，不同濃度的BR處理均能適量提升黃芩幼苗葉片中的CAT活性，其中以0.4 mg/L BR處理的效果最好，CAT酶活性提升了35.39%。在相同的試驗處理條件下，黃芩幼苗POD活性的變化規(guī)律與SOD類似，即隨著BR濃度的上升，酶活性呈現(xiàn)出上升的趨勢。

圖2 0.5% NaCl脅迫下不同濃度BR對黃芩幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

綜上所述，3種保護酶可能一起協(xié)同緩解了鹽脅迫所造成的活性氧傷害程度，它們的活性均隨著外源BR濃度的增加而呈上升趨勢的變化，其中CAT活性在0.4 mg/L BR處理時達到最大值，而SOD和POD活性在0.5 mg/L BR濃度處理時達到最大值，可能還需要更高濃度BR處理才能達到峰值，說明在抗氧化酶系統(tǒng)中CAT對BR比較敏感，與SOD和POD活性峰值相比，提前達到CAT峰值。

2.3 油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下黃芩幼苗脯氨酸含量的影響

由圖3可知，與CK1相比，CK2的黃芩幼苗植株的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸含量呈增長趨勢，但差異未達到顯著性水平。在經(jīng)過不同濃度的BR處理后，脯氨酸含量與CK2相比均得到了進一步的提高，其中濃度為0.2、0.3、0.4 mg/L BR處理與CK2相比，差異達顯著水平，其脯氨酸含量分別比CK2增加了41.92%、64.14%、65.15%。說明外施不同濃度的BR均能不同程度地增加脯氨酸含量，且在0.1～0.5 mg/L BR濃度梯度中，以0.4 mg/L BR的處理效果最好。

圖3 0.5% NaCl脅迫下不同濃度BR對黃芩幼苗葉片脯氨酸含量的影響

3 討論

植物遭遇逆境脅迫時，活性氧在細胞中不斷地積累，膜脂過氧化作用增強，丙二醛含量急劇積累，導致植物體內(nèi)自由基代謝的平衡被打破，從而傷害植物細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[16]。油菜素內(nèi)酯是一類重要的外源激素，其生理活性較強，若對其較好應用則可有效提升植物的抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)能力，調(diào)控植物生長發(fā)育，以及降低外界因素對植物的迫害可提高植物生理生化特性，保持植物體內(nèi)的水平衡，有效地緩解鹽脅迫造成的損害，促進植株生長和改善植物品質(zhì)[17]。

在正常條件下，植物體內(nèi)的活性氧生成與消除一般處于一定的平衡狀態(tài)中，不易產(chǎn)生膜脂過氧化反應。植物細胞膜脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一是MDA，質(zhì)膜透性的大小和MDA含量是膜損傷和膜過氧化的重要指標[18]。在本研究中，黃芩MDA含量在0.5% NaCl脅迫下增長，說明黃芩幼苗葉片中活性氧急劇產(chǎn)生，超出了細胞自身對活性氧的清除能力，從而導致活性氧在細胞體內(nèi)累積，膜脂過氧化作用增強，細胞膜系統(tǒng)受到嚴重破壞。研究表明，BR作用后可以使低氧條件下黃瓜體內(nèi)的丙二醛含量下降，有效地降低低氧脅迫對黃瓜植株的迫害程度[19]。還有研究表明：在鹽脅迫下，BR作用可使水稻體內(nèi)的丙二醛含量下降[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，在0.5% NaCl脅迫下，采用葉面噴施濃度為0.4 mg/L BR可顯著降低黃芩體內(nèi)的MDA含量，這與前人[18-20]的研究結(jié)論相似。說明外施BR能不同程度地降低植物細胞膜脂的過氧化作用，維持并保護細胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而保證了黃芩植株正常的生長和代謝。

鹽脅迫可促使植物細胞體內(nèi)ROS的產(chǎn)生，加劇了植物體內(nèi)發(fā)生氧化反應，產(chǎn)生具有強氧化性質(zhì)的各種小分子降解物和膜氧化物，導致膜過氧化和破壞細胞膜完整性，大大降低了保護酶活性[16]。植物在長期進化過程中逐漸形成了包括SOD、POD、CAT等抵抗活性氧傷害的保護酶體系，從而保持植物細胞內(nèi)活性氧離子代謝處于適量生成與有效清除的動態(tài)平衡[21]。其中SOD酶具有較強的氧自由基的消除能力，是植物細胞體內(nèi)保護酶防御體系的重要組成部分，同時其活性的高低還直接影響了逆境下蛋白質(zhì)和葉綠素的降解速度與葉片功能的發(fā)揮。POD酶在植物細胞體內(nèi)可將H2O2分解為O2和H2O，保護細胞免受過多過氧化氫的毒害，從而達到清除過氧化氫的作用。CAT酶作為植物細胞體內(nèi)主要的消除活性氧的酶類，它主要負責去除脂肪酸氧化或光呼吸過程中產(chǎn)生的H2O2，其活性增加有助于有效去除細胞代謝過程中形成的H2O2。植物細胞膜損傷的主要因素是植物活性氧增加引起的不可逆膜脂過氧化。SOD、POD、CAT酶通過協(xié)同互作可以高效地消除植物細胞體內(nèi)多余的自由基，從而提升了植物體適應外界不利因素的能力[22]。

本研究結(jié)果與前人[16]的類似：在鹽脅迫下，黃芩幼苗的SOD、POD、CAT酶活性上升，噴施不同濃度的BR后，3種酶活性都表現(xiàn)出逐步上升的趨勢。對鹽脅迫下的黃芩添加BR，不同濃度的BR處理后均可適當提升其抗氧化酶的活性，而本試驗中添加BR處理后細胞膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢，這可能與BR保護作用的發(fā)揮和增強抗氧化酶活性的作用而進一步高效消除ROS緊密相關(guān)。

在鹽脅迫逆境條件下，伴隨植物的進化反應，逐步產(chǎn)生了相關(guān)的抗逆性生理調(diào)節(jié)機制，滲透調(diào)節(jié)是其中一種重要的生理反應，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的水平直接決定了其滲透調(diào)節(jié)能力的大小[23]。脯氨酸是植物中積累的主要滲透調(diào)節(jié)劑，其含量的增加有利于提高植物細胞汁的濃度，降低細胞水勢，增強植物的吸水能力。同時，脯氨酸也可用作儲存的氮源，當植物的脅迫壓力減輕時，它也可以參與葉綠素的合成。一旦植物受到脅迫壓力，植物體就可以通過積累脯氨酸來增加細胞的滲透調(diào)節(jié)，當細胞組織的水勢降低時，能夠維持細胞膨脹壓力[24]。

本試驗表明：在鹽脅迫下，經(jīng)過BR處理過后的黃芩幼苗葉片細胞內(nèi)脯氨酸含量與鹽脅迫對照相比較呈現(xiàn)上升的趨勢，表明BR處理后促進了黃芩體內(nèi)脯氨酸的積累，進而保持植物細胞體內(nèi)比較低的滲透勢，達到提高植物細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度和降低組織水勢的作用，能明顯地緩解鹽脅迫對黃芩植株所造成的損害程度。

4 結(jié)論

適當濃度的BR可減輕鹽脅迫對黃芩幼苗造成的迫害，與BR能夠減輕膜質(zhì)過氧化作用強度，維持較高濃度的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，保護細胞膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能等生理生化特性關(guān)系密切。綜上所述，在0.5% NaCl脅迫下，黃芩植株葉片中MDA含量、脯氨酸及抗氧化酶活性都增加；添加適宜濃度的BR能提高葉片SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)、CAT(過氧化氫酶)保護酶的活性及其脯氨酸含量，并降低MDA含量；在0.1～0.5 mg/L BR濃度梯度中，以0.4、0.5 mg/L BR濃度的處理效果較好。

本試驗只初步探究了盆栽條件下添加油菜素內(nèi)酯對鹽脅迫下黃芩生理生化特性的影響；且部分生理指標在BR最大設(shè)置濃度才出現(xiàn)峰值，變化規(guī)律不是很明顯，還有待進一步合理優(yōu)化BR濃度梯度的設(shè)置，并結(jié)合黃芩大田生產(chǎn)實踐開展不同生育期生理生化變化規(guī)律的探討，以及更深入地研究其生理機制。