李萬芹,何鵬飛,吳毅歆,何鵬搏,Shahzad Munir,孔寶華,李興玉,何月秋

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué),云南 昆明 650201)

香蕉是世界上生產(chǎn)最多的一種水果,為全球4億人口的主食[1]；香蕉的生產(chǎn)和種植面積也在逐年增加[2]。氣候變化將會推動香蕉種植范圍的擴(kuò)大,估計到2070年,適合香蕉種植的面積將會增加50%[3]。然而全球香蕉生產(chǎn)受尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariumoxysporumf.sp.cubense, Foc)引起的枯萎病嚴(yán)重威脅。為了防治該病害,人們大量施用化學(xué)農(nóng)藥,但后者對環(huán)境以及安全方面的負(fù)面影響一直引起人們擔(dān)憂與對生物防控的關(guān)注和興趣[4]。

內(nèi)生菌是指對宿主植物無明顯傷害,在生命周期或某一階段于植株里生活的一類微生物[5]。一些內(nèi)生菌表現(xiàn)出植物促生特性以及良好的植物病原拮抗效果,從而得到了應(yīng)用[6-7]。然而,盡管科學(xué)家們期望通過努力能采用生物防治的辦法有效地控制香蕉枯萎病,但至今生物防治商品真正能得到大量應(yīng)用的事例比化學(xué)農(nóng)藥少得多[8]。因此,篩選有效防控香蕉枯萎病的生防菌株仍然具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

巴西蕉(MusaAAA, cv.Baxi)來自云南省紅河州經(jīng)作站。培養(yǎng)基包括LB培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、Ashby無氮培養(yǎng)基、Pikovskaya培養(yǎng)基和解鉀培養(yǎng)基,分別用于細(xì)菌、真菌分離培養(yǎng),內(nèi)生菌的固氮、溶磷和解鉀能力的測定。所用病原菌包括尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種Fusariumoxysporumf.sp.cubenserace 4, FOC4、玉米穗腐病菌Fusariumgraminearum、煙草疫霉菌Phytophthoraparasitica、小麥雪腐病菌Typhulaincarnata、玉米頂腐病菌KlebsiellapneumoniaeKpC4、煙草赤星病菌Alterariaalternata、玉米小斑病菌Bipolarismaydis、草莓灰霉病Botrytiscinerea、石榴干腐病菌Coniellagranati、三七黑斑病菌Alternariapanax,它們都為本實(shí)驗(yàn)分離和保存的菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 香蕉內(nèi)生菌的分離 從云南省香蕉產(chǎn)地采集香蕉葉片,稱取葉片1 g,用清水沖洗干凈，然后置于75%酒精中30 s及20%次氯酸鈉中4 min，做表面消毒,再用無菌水漂洗5次,將最后一次漂洗液涂板作對照，以檢測消毒是否徹底。將消毒后的香蕉葉片用無菌濾紙吸干表面水分后轉(zhuǎn)入無菌研缽中,加入9 mL無菌水研磨至勻漿狀,得到濃度為10-1的母液；按10倍梯度將母液依次稀釋成濃度為10-2、10-3、10-4的稀釋液；取不同濃度的稀釋液200 μL涂布于LB培養(yǎng)基,重復(fù)3次,在28 ℃下培養(yǎng)3～7 d。

1.2.2 內(nèi)生菌的純化 用肉眼觀察分離出的菌落,挑取形態(tài)各異的菌落于相應(yīng)的培養(yǎng)基上，劃線純化得到單菌落；用無菌牙簽挑取單菌落，接入液體LB中，在37 ℃、160 r/min條件下振搖培養(yǎng)2～4 d;然后按1∶1的體積比加入40%的無菌甘油,混合均勻后保存于-80 ℃，備用。

1.2.3 拮抗內(nèi)生菌的初篩 以FOC4為靶標(biāo)菌，將其接種于PDA平板上,在28 ℃下倒扣培養(yǎng)3～5 d。待其菌落長出后,使用直徑為5 mm的無菌打孔器從菌落邊緣打取菌餅,用無菌接種針將菌餅轉(zhuǎn)接至PDA平板中央。用無菌牙簽挑取內(nèi)生菌株的單菌落,點(diǎn)接于距離菌餅中心2.5 cm處,每皿接種4株內(nèi)生菌,以只接種病原菌為對照。在28 ℃下倒扣培養(yǎng)5 d,觀察抑菌圈大小。將初篩有抑菌效果的菌株納入復(fù)篩。

1.2.4 拮抗內(nèi)生菌的復(fù)篩 將每株內(nèi)生細(xì)菌點(diǎn)接4個PDA平板,以未接生防菌的PDA平板為對照,重復(fù)復(fù)篩試驗(yàn)3次。定期取出觀察有無抑菌圈,在7 d后,用十字交叉法測定病原真菌菌落的直徑；將按照上述方法得到的抑菌效果較好的若干株內(nèi)生細(xì)菌傳代5次以上，持續(xù)觀察其對香蕉枯萎病的抑菌效果,按如下公式計算出香蕉內(nèi)生菌對FOC4的抑制率：抑制率(%)=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100。

1.2.5 生理生化特性的鑒定 參照東秀珠等[9]的方法進(jìn)行內(nèi)生菌生理生化特性的鑒定,以解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2(下稱Y2)為陽性對照。

1.2.6 分子鑒定 分離獲得的內(nèi)生菌株經(jīng)反復(fù)純化后,參考Cheng等[10]的方法提取細(xì)菌的基因組DNA。利用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR體系為20 μL,其中滅菌ddH2O 13.7 μL,10× EasyTaq buffer(+Mg2+)2.0 μL,dNTPs 1.6 μL,1 mmol/L上下游引物各1.0 μL,EasyTaq DNA聚合酶 0.2 μL(1 U),基因組DNA模板0.5 μL(50 ng)。PCR擴(kuò)增程序:94 ℃預(yù)變性4.5 min;94 ℃變性30 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸1.5 min,共30個循環(huán);72 ℃延伸10 min；于16 ℃保存。將PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物公司測序。將測得的序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫中做BLAST分析,鑒定內(nèi)生菌的種屬。

1.2.7 溶磷、解鉀及固氮活性的測定 用無菌牙簽蘸取內(nèi)生細(xì)菌，分別點(diǎn)接于無氮Ashby、PVK溶磷或解鉀固體平板上,置于28 ℃恒溫箱中倒扣培養(yǎng)7 d,觀察菌落周圍是否有水解圈出現(xiàn)；選擇有水解圈的菌落，測量菌落直徑d和水解圈直徑D,計算出比值D/d,選擇比值較大的菌株反復(fù)驗(yàn)證其功能活性。

1.2.8 內(nèi)生細(xì)菌的抑菌作用測定 參照1.2.4部分,將已鑒定的內(nèi)生菌與10種病原真菌做對峙培養(yǎng),并測定其抑制作用。

1.2.9 內(nèi)生細(xì)菌對盆栽香蕉植株促生作用的測定 對內(nèi)生菌YX-11與其他幾株內(nèi)生菌做盆栽試驗(yàn),測定各菌株促進(jìn)香蕉生長的效果,以澆清水和稀釋同樣倍數(shù)的LB為對照,每組6株,每株為1個重復(fù)。將內(nèi)生菌發(fā)酵液稀釋成107CFU/mL,單次每盆灌施200 mL,每周1次,處理4次,30 d后測量株高、莖粗、葉寬、葉長等指標(biāo)。

1.2.10 拮抗菌株的田間防效驗(yàn)證 將無菌香蕉組培苗移栽到育苗盆里,每周用拮抗菌株YX-11按107CFU/mL的菌量噴施1次；在移到大田的前1 d,再以同樣的菌量噴施,使育苗盆完全濕潤。在移栽時,再澆定根水400 mL左右。同時,每株施用5 kg生物有機(jī)肥做底肥。試驗(yàn)設(shè)施用生物有機(jī)肥、施用有機(jī)肥(無YX-11)、不施有機(jī)肥三個施肥條件。在生長期間,每月噴淋107CFU/mL的YX-11菌液1次。在香蕉收獲前,調(diào)查發(fā)病株率。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 22軟件進(jìn)行處理,差異顯著性分析利用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生菌YX-11的分離

采用稀釋法和平板拮抗試驗(yàn),分離獲得抑制香蕉枯萎病菌能力強(qiáng)的菌株,經(jīng)過初篩、復(fù)篩，最終確認(rèn)1株來自云南省云縣巴西蕉葉片的菌株,被命名為YX-11。

2.2 YX-11菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 將菌株YX-11在LB培養(yǎng)基平板上置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,菌落乳白色、不透明,表面粗糙無光澤,邊緣不規(guī)則形,有的呈鋸齒狀,中間有火山口狀小突起,表面干燥呈現(xiàn)褶皺,質(zhì)地易被挑起(圖1A)。菌體短桿狀(圖1B),產(chǎn)芽孢,呈橢圓形(圖1C)。

A:菌落。B:菌體。C:芽孢。

2.2.2 生理生化特征 采用生理生化試驗(yàn)鑒定了菌株YX-11和Y2的12個生理生化特征,這些特征在兩個菌株間無差異。它們的革蘭氏染色、芽孢染色、淀粉水解、V-P反應(yīng)、明膠液化、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原、葡萄糖利用均呈陽性,KOH反應(yīng)、甲基紅試驗(yàn)、丙二酸利用為陰性,不產(chǎn)生吲哚(表1),YX-11被初步鑒定為與Y2同屬的芽孢桿菌。

表1 菌株YX-11的生理生化特征鑒定結(jié)果

2.2.3 分子鑒定 將YX-11的16S rDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對,選取同源性較高的菌株的序列,利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果(圖2)表明,YX-11菌株與BacillusvelezensisEB14(CP065473.1)聚在一支。依據(jù)形態(tài)特征、生化指標(biāo)和分子聚類分析結(jié)果,YX-11屬于貝萊斯芽孢桿菌B.velezensis。

圖2 菌株YX-11的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 YX-11的溶磷、解鉀和固氮能力

將YX-11接種在Ashby無氮培養(yǎng)基、Pikovskaya培養(yǎng)基和解鉀培養(yǎng)基上,以Y2作為標(biāo)準(zhǔn)對照,以同為香蕉內(nèi)生菌的I-2和M-1為同類來源菌株對照,結(jié)果表明YX-11能夠在相應(yīng)的培養(yǎng)基上生長,具有一定的溶磷、解鉀、固氮能力(表2),但它的能力低于3個對照菌株的能力。

表2 菌株YX-11的溶磷、解鉀、固氮能力測定結(jié)果

2.4 YX-11對病原真菌的抑菌活性

YX-11菌株對香蕉枯萎病等10種病原真菌皆有較好的抑制作用,其中對煙草疫霉的抑制率最高,達(dá)72.77%；對香蕉枯萎病菌的抑制率次之，為71.30%；對煙草赤星、石榴干腐病菌、小麥雪腐病菌、草莓灰霉病菌的抑制率分別為72.19%、67.00%、66.11%、64.44%;對玉米穗腐病菌、玉米頂腐病菌、玉米小斑病菌、三七黑斑病菌的抑制率分別為63.33%、58.52%、68.80%和47.00%。結(jié)果表明該菌株有廣譜的抑菌作用(表3、圖3)。

表3 YX-11菌株抑制植物病原真菌的效果

上排為對峙試驗(yàn),下排為對照。a:煙草赤星病菌。b:煙草疫霉病菌。c:香蕉枯萎病菌。

2.5 YX-11對香蕉植株的促生長作用

以清水和同樣稀釋倍數(shù)的LB培養(yǎng)基為對照,以香蕉內(nèi)生菌I-2為陽性對照,每次每株灌施YX-11的107CFU/mL懸浮液200 mL,每周1次,連續(xù)4次。在30 d后進(jìn)行測量，結(jié)果(表4)表明,YX-11對香蕉的莖粗、株高有顯著的促進(jìn)作用,其中莖粗較LB對照增粗近1倍,較清水對照增加2倍多；YX-11處理的株高亦顯著地高于兩個空白對照,高于香蕉內(nèi)生菌I-2,但差異未達(dá)顯著水平；YX-11處理的葉長、葉寬與各對照差異不顯著,葉片數(shù)與LB處理有顯著差異,顯著地多于清水對照及I-2處理?？傮w來說,菌株YX-11對香蕉盆栽苗有較好的促生長效果,具有用于制備生物功能有機(jī)肥的潛力。

表4 不同內(nèi)生菌促進(jìn)香蕉生長的效果

2.6 YX-11菌株在田間的應(yīng)用效果

本田間試驗(yàn)設(shè)置施用生物有機(jī)肥、施用有機(jī)肥、施用無機(jī)肥三種施肥條件，在每種施肥條件下又設(shè)噴施和不噴施YX-11菌液兩種處理。對于前一種處理，在生長期間每月噴淋YX-11的107CFU/mL菌液1次。在收獲前,調(diào)查各小區(qū)的發(fā)病株率。以傳統(tǒng)苗、不施有機(jī)肥和不噴施生防菌的處理為對照,計算各處理防治香蕉枯萎病的效果。結(jié)果(表5)表明,施用有機(jī)肥處理的發(fā)病株率明顯地低于施用無機(jī)肥的；施用有機(jī)肥配合每月噴施1次YX-11,對帶菌苗香蕉枯萎病的防效達(dá)57.78%，而在相同條件下施用無機(jī)肥的防效僅有42.22%。在移栽時,配合施用帶YX-11的生物有機(jī)肥5 kg/株,種植帶菌苗,配合每月噴施1次YX-11,防效可達(dá)75.56%,極顯著地高于其他處理。不用帶菌苗,而是直接使用傳統(tǒng)香蕉苗,施用生物有機(jī)肥,配合每月噴施1次YX-11,對香蕉枯萎病的防效亦達(dá)到68.89%。當(dāng)每月不噴施YX-11時,僅用帶菌苗和施用生物有機(jī)肥,則防病效果劣于每月噴施1次YX-11的處理,僅有55.56%。當(dāng)僅用傳統(tǒng)香蕉苗時,由于生物有機(jī)肥中的YX-11可以進(jìn)入香蕉植株體內(nèi),因此即使在生長期間不噴施YX-11,施用生物有機(jī)肥對香蕉枯萎病的防效也達(dá)48.89%。值得特別指出的是,即使不噴施YX-11,不施用生物有機(jī)肥和常規(guī)有機(jī)肥,僅用帶菌苗也能減輕枯萎病的發(fā)生程度,防效達(dá)22.22%。綜上所述,施用有機(jī)肥可以減輕香蕉枯萎病,施用生物有機(jī)肥的防效更好,特別是與帶YX-11菌苗結(jié)合使用效果最好。每月噴施YX-11,防治枯萎病的效果達(dá)20%左右。

表5 不同處理對大田香蕉枯萎病的生物防控效果(發(fā)病株率) %

3 討論

所有植物都攜帶大量不同類型的有益或中性的微生物,后者棲息于植物內(nèi)部而沒有引起寄主的不良反應(yīng)[11]。由于有益內(nèi)生菌能通過一系列不同機(jī)制(如植物激素合成、固氮、溶磷、防衛(wèi)應(yīng)答誘導(dǎo)以及通過減少乙烯水平減輕非生物脅迫等)促進(jìn)植物對環(huán)境的適應(yīng)性和生長[12],它們擁有農(nóng)業(yè)應(yīng)用潛力,但目前仍未被完全地解析清楚[13]。已有源于香蕉植株的內(nèi)生細(xì)菌和真菌作為防御香蕉枯萎病和其他生物限制因子的報道[14]。健康的植株與健康的土壤有著更高的微生物多樣性和更為豐富的有益微生物,而這些微生物能改善營養(yǎng)吸收、促進(jìn)植株生長以及防控土傳病害[15-19]。在本研究中,通過廣泛地分離云南省各地香蕉內(nèi)生菌,通過綜合評價,獲得了YX-11菌株,通過形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和16S rDNA片段分析，鑒定其為貝萊斯芽孢桿菌。該菌具有解磷、固氮和解鉀能力,能抑制多種植物病原真菌,特別是對煙草疫霉有很好的抑制作用,而對疫霉等卵菌病害的生防非常困難。YX-11菌株是否能用于其他植株的卵菌病防控有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。本研究發(fā)現(xiàn)，噴淋、追噴YX-11或者將其制作成生物有機(jī)肥后加以應(yīng)用，對田間香蕉枯萎病均有一定的防治效果,且使用的方式越多,其防治效果越好,如使用帶菌苗、生物有機(jī)肥和在香蕉生長期間追噴YX-11處理的防效達(dá)75.56%,不追噴的防效僅為55.56%,因此,要取得很好的防病效果,必須多次補(bǔ)施該菌株。這種多次施用才能取得更好的防效，可能與香蕉枯萎病菌可以通過風(fēng)雨、灌溉及農(nóng)事操作傳播,病原菌基數(shù)大,香蕉生長周期長,在香蕉植株內(nèi)定殖的YX-11數(shù)量不足以抑制過多的病菌有關(guān)。本研究將內(nèi)生菌YX-11與有機(jī)肥結(jié)合使用,明顯提高了防病效果,這可能與有機(jī)肥為YX-11和其他有益微生物提供了營養(yǎng)物質(zhì),增加了它們的種群數(shù)量有關(guān),也可能與有機(jī)肥為香蕉提供了較全面的營養(yǎng),提高了其抗病性有關(guān)。但YX-11在田間有機(jī)肥中的適宜比例及在植株內(nèi)的定殖量等還有待進(jìn)一步研究。