焦健，夏炎，武雪莉，王苗苗，宋春暉，龐宏光，白團(tuán)輝，宋尚偉，黃松,2，鄭先波

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州，450002； 2.信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽，464006)

蘋果(Malusdomestica)是中國種植面積最大，產(chǎn)量最高的果樹樹種之一，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-2]，但蘋果生長中很容易發(fā)生由病毒和類病毒引起的病害[3]。目前世界上報(bào)道的蘋果病毒病有39種，包括非潛隱性病毒25種，潛隱性病毒14種[4-5]，其中蘋果壞死花葉病毒(apple mosaic virus，ApNMV)、蘋果褪綠葉斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋果莖痘病毒(apple stem pitting virus，ASPV)、蘋果莖溝病毒(apple stem grooving virus，ASGV)、蘋果銹果類病毒(apple scar skin viroid，ASSVd)在中國發(fā)生較為普遍[6]。蘋果病毒病已成為制約蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要生物因素，病毒侵入樹體后會在樹體內(nèi)迅速增殖，使其終生帶毒，不僅影響果樹正常的生理代謝和生長，而且會導(dǎo)致果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量的下降[7]。

蘋果樹主要通過無性繁殖，樹體一旦感病，將終生帶毒[8]，因此要想盡可能降低、避免病毒病造成的損失，只能通過繁殖無病毒種植材料以及在植物生長階段的早期進(jìn)行病毒檢測并及時(shí)處理感病植株，以避免產(chǎn)量的損失，防止病毒病的進(jìn)一步傳播[9]。因此，特異性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確快速的蘋果病毒檢測體系十分重要。隨著分子病毒學(xué)和生物技術(shù)的進(jìn)步，如今有許多方法已應(yīng)用于植物病毒的檢測：指示植物法、酶聯(lián)免疫法、電鏡觀測法、核酸分子雜交法[10-13]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)和新一代測序技術(shù)(next generation sequencing，NGS)[14-16]，但大多數(shù)分子檢測方法都存在操作復(fù)雜、設(shè)備要求高、檢測時(shí)間過長等缺陷。

重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification，RPA)是一種新型的等溫核酸擴(kuò)增和檢測技術(shù)，由英國TwistDx Inc公司于2006年成功開發(fā)[17]。其主要依賴于重組酶(recombinase)、鏈置換DNA聚合酶(polymerase)和單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA-binding protein)的酶促反應(yīng)[18]：首先兩條引物先與重組酶蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物；該復(fù)合物能夠侵入靶標(biāo)dsDNA，并將引物導(dǎo)向同源序列；隨后在37～42 ℃的條件下通過DNA聚合酶催化鏈置換、合成、連續(xù)擴(kuò)增[19]。與PCR熱變性不同的是，RPA利用酶促混合物進(jìn)行DNA變性，因此在等溫條件下即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。此外，在常規(guī)RPA體系中可加入逆轉(zhuǎn)錄酶，開發(fā)出逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA)。RT-RPA以RNA為檢測底物，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后再進(jìn)行擴(kuò)增，就可實(shí)現(xiàn)RNA的一步法擴(kuò)增，從而能夠更加方便快捷的進(jìn)行RNA病毒檢測。

RT-RPA操作簡單、靈敏度高、擴(kuò)增效率高、在相對較低的恒溫(25～43 ℃)下持續(xù)5～20 min即可完成擴(kuò)增反應(yīng)[20]，近兩年備受關(guān)注。目前關(guān)于植物病毒的RPA檢測方法在黃瓜綠斑駁花葉病毒、黃瓜花葉病毒、玉米褪綠斑駁病毒、山藥花葉病毒、番茄斑駁病毒、馬鈴薯Y病毒、番茄黃葉卷曲病毒和玫瑰花環(huán)病毒等[21-26]已有報(bào)道。KIM等[27]也根據(jù)蘋果莖溝病毒的CP基因高保守區(qū)域設(shè)計(jì)出了能夠靈敏快速檢測該病毒的RPA引物，但是，此引物是以梨中分離出ASGV病毒進(jìn)行設(shè)計(jì)的。此外，蘋果其他的病毒病如ASPV、ACLSV以及近年來最新報(bào)道的蘋果花葉病的主要病原物ApNMV，還未建立其RT-RPA檢測體系。

本研究以蘋果病毒ASGV、ASPV、ACLSV和ApNMV為主要研究對象，利用逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，建立RT-RPA新型快速檢測方法，為蘋果病毒病的早期快速診斷提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院河南省果樹瓜類分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。試驗(yàn)材料采集地點(diǎn)為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)毛莊科教園區(qū)果樹實(shí)驗(yàn)站蘋果資源圃，從不同品種的蘋果樹上采集20份葉片有明顯病癥的蘋果葉片樣品，采集時(shí)間為2020年8月。采集后的樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后放于-80 ℃冰箱貯藏用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 引物設(shè)計(jì)

下載NCBI數(shù)據(jù)庫中病毒全長序列，利用MEGA-X軟件[28]進(jìn)行比對分析，找尋病毒保守區(qū)域。隨后參照RPA等溫?cái)U(kuò)增試劑盒TwistAmpbasic kit(Twist DX，United Kingdom)的要求，采用NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具Primer-BLAST，設(shè)計(jì)檢測ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV的引物(表1)，并由生工生物(上海，中國)合成。RPA引物設(shè)計(jì)原則如下：(1)在保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，長度30～35 bp，GC含量20%～70%，單堿基重復(fù)序列<5；(2)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物長度為100～200 bp；(3)引物序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(nr/nt)進(jìn)行Blast比對，確保其種內(nèi)保守性和種間特異性。

1.3 RNA提取與RT-RPA反應(yīng)

將采集的蘋果葉片置于液氮中冷凍后研磨成粉末，使用植物總RNA提取試劑盒DP432(北京，天根)提取總RNA，隨后使用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)Nanodrop 2000(Thermo，USA)分別檢驗(yàn)RNA的完整性和質(zhì)量濃度(ng·μL-1)。

RT-RPA反應(yīng)體系參照TwistAmp?basic試劑盒(Twist DX，United Kingdom)說明書，按照上下游引物各2.5 μL、2.5 μL HiScript III reverse Transcriptase(200 U·μL-1)，2.5 μL RNase inhibitor(40 U·μL-1)，rehydration buffer 29.5 μL、RNase-free水7 μL、總RNA 1.0 μL配置RT-RPA反應(yīng)預(yù)混液，將47.5 μL預(yù)混液轉(zhuǎn)移至反應(yīng)沉淀中。通過上下移液混合，直到整個(gè)顆粒重新懸浮，37 ℃孵育5 min進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；隨后在反應(yīng)管蓋子上加入2.5 μL醋酸鎂，渦旋后離心；42 ℃溫育20～30 min。反應(yīng)產(chǎn)物使用質(zhì)量濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.4 反應(yīng)體系優(yōu)化

以10 ng·μL-1植物總RNA為模板，反應(yīng)體系及步驟參照1.3中RT-RPA反應(yīng)體系，反應(yīng)溫度分別設(shè)定為20、25、30、35、37、39、42、45及50 ℃進(jìn)行RT-RPA擴(kuò)增以確定RT-RPA最佳反應(yīng)溫度，在最佳溫度下將反應(yīng)時(shí)間分別設(shè)定為1、5、10、15、20、25及30 min進(jìn)行RT-RPA擴(kuò)增以確定RT-RPA最佳反應(yīng)時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后將5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入10 μL SDS loading buffer(5%甘油，10 mmol·μL-1EDTA，0.01%溴酚藍(lán)和0.25% SDS)中，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳并觀察結(jié)果。

1.5 RNA轉(zhuǎn)錄本制備與靈敏度檢測

以感病蘋果葉片的cDNA為模板，利用表1中的RPA特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將4種蘋果病毒的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，克隆到pGEM-T質(zhì)粒(Promega)并進(jìn)行測序驗(yàn)證。隨后使用pUC/M13通用引物(M13pUC-Fwd，5′-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3′；M13pUC-Rev，5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)擴(kuò)增出包含T7啟動子序列的病毒dsDNA片段。將上述PCR產(chǎn)物稀釋至100 ng·μL-1，使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis kit(New England Biolabs)，分別合成4種病毒的RNA片段。隨后采用RNA純化試劑盒(北京，天根)對體外轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行純化，使用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測量其濃度，并轉(zhuǎn)化為拷貝數(shù)。拷貝數(shù)的計(jì)算方法[29]：

拷貝數(shù)(copies·μL-1)=

以4種病毒片段的RNA轉(zhuǎn)錄本為模板，以9.63×109copies·μL-1為初始濃度，以10為倍數(shù)依次進(jìn)行稀釋，同時(shí)設(shè)置陰性對照，分別進(jìn)行RT-RPA和RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，RT-PCR反應(yīng)體系為2×Taq酶25 μL，RPA-F、R引物(10 μmol·L-1)各2.5 μL，cDNA 2 μL，模板2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μL，RT-RPA擴(kuò)增方法及體系參照1.3。RT-RPA和RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察結(jié)果。

1.6 RPA引物特異性分析

分別挑選ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV復(fù)合侵染不同類型的蘋果葉片為材料，使用RT-PCR法和特異性引物(表1)對4對RPA引物進(jìn)行特異性分析，反應(yīng)體系參照1.5中RT-PCR反應(yīng)體系。此外，其他幾種蘋果中常見病毒病，如ASSVd(NCBI登錄號EU031466)，ApMV(RNAs 1-3，NCBI登錄號NC003464，NC003465和NC003480)以及李壞死環(huán)斑病毒(prunus necrotic ring spot virus，PNRSV；RNAs 1-3，NCBI登錄號NC004362，NC004363和NC004364)，人工合成后(南京，金斯瑞)作為底物，進(jìn)行RPA擴(kuò)增特異性分析，‘嘎啦’蘋果脫毒苗的cDNA(CK)作為陰性對照。

表1 蘋果病毒檢測所用引物Table 1 Primers used to detect apple viruses

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-RPA反應(yīng)體系優(yōu)化

首先對RT-RPA反應(yīng)的時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化。相同反應(yīng)時(shí)間，在15～50 ℃區(qū)間進(jìn)行RT-RPA反應(yīng)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。當(dāng)RPA反應(yīng)溫度高于25 ℃時(shí)，開始有少量擴(kuò)增；35～43 ℃時(shí)，擴(kuò)增效果無明顯差異；25 ℃以下以及50 ℃以上，無擴(kuò)增。由于要兼顧逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)所推薦的最佳溫度(37 ℃)，綜合考慮，本試驗(yàn)選擇37 ℃為RT-RPA最適反應(yīng)溫度。

M：DNA marker(bp)；A：蘋果莖溝病毒；B：蘋果壞死花葉病毒；C：蘋果褪綠葉斑病毒；D：蘋果莖痘病毒；N：陰性對照。M：DNA marker(bp)；A：ASGV；B：ApNMV；C：ACLSV；D：ASPV；N：Negative control.圖1 不同反應(yīng)溫度對4種蘋果病毒RPA擴(kuò)增的影響Fig.1 Effect of different reaction temperatures on RPA amplification of four apple viruses

隨后在37 ℃條件下，優(yōu)化RT-RPA反應(yīng)時(shí)間，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。反應(yīng)在10 min后，開始有可觀測到的擴(kuò)增條帶；反應(yīng)時(shí)間在20～30 min時(shí)，擴(kuò)增效果較好。因此，本試驗(yàn)將30 min作為最適宜反應(yīng)時(shí)間。綜上，最終確定在37 ℃條件下，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，RT-RPA反應(yīng)可達(dá)到有效的目標(biāo)病毒片段擴(kuò)增。

M：DNA marker(bp)；A：蘋果莖溝病毒；B：蘋果壞死花葉病毒；C：蘋果褪綠葉斑病毒；D：蘋果莖痘病毒；N：陰性對照。M：DNA marker(bp)；A：ASGV；B：ApNMV；C：ACLSV；D：ASPV；N：Negative control.圖2 不同反應(yīng)時(shí)間對4種蘋果病毒RPA擴(kuò)增的影響Fig.2 Effect of different reaction time on RPA amplification of four apple viruses

2.2 RT-RPA靈敏度檢測

靈敏度檢測結(jié)果如圖3所示，4種蘋果病毒的RT-RPA檢測靈敏度下限均為9.63×101copies，遠(yuǎn)高于RT-PCR檢測靈敏度，其中ACLSV和ASPV的RT-RPA檢測靈敏度比RT-PCR檢測靈敏度高100倍，而ASGV、ApNMV的RT-RPA檢測靈敏度比RT-PCR檢測靈敏度高1 000倍。

M：DNA marker(bp)；N：陰性對照。M：DNA marker(bp)；N：Negative control.圖3 4種蘋果病毒的RT-PCR(A)與RT-RPA(B)檢測靈敏度比對Fig.3 Comparison of detection sensitivity for four apple viruses between RT-PCR(A)and RT-RPA(B)

2.3 RT-RPA引物特異性分析

由于自然樣本中，蘋果病毒多為復(fù)合侵染，在使用RT-RPA檢測病毒之前，事先采用RT-PCR技術(shù)對田間樣本的病毒進(jìn)行檢測，挑選出不同的病毒復(fù)合感染類型葉片。隨后以不同病毒感染類型的蘋果葉片cDNA以及人工合成的ASSVd、ApMV和PNRSV病毒為模板，對ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV 4種蘋果病毒的RT-RPA引物特異性進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，4對蘋果病毒的RPA引物均能夠準(zhǔn)確檢測出該病毒，與RT-PCR檢測結(jié)果一致，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增(圖4)。證明所設(shè)計(jì)的RPA引物特異性良好，能夠?qū)Ｒ徊《具M(jìn)行檢測。

M：DNA marker(bp)；A：ASPV檢測；B：ASGV檢測；C：ACLSV檢測；D：ApNMV檢測；CK：空白對照；√：陽性；×：陰性。M：DNA marker(bp)；A：Detection of ASPV；B：Detection of ASGV；C：Detection of ACLSV；D：Detection of ApNMV；√：Positive；×：Negative.圖4 4種蘋果病毒RPA引物特異性檢測Fig.4 Specific detection of RPA primers of four apple viruses

3 結(jié)論與討論

目前，植物病毒診斷大多基于PCR法，這就需要將樣品運(yùn)送到專業(yè)機(jī)構(gòu)通過大型、昂貴的儀器進(jìn)行檢測，并且PCR技術(shù)往往依賴高質(zhì)量的核酸提取，這就使得整個(gè)檢測流程過于復(fù)雜。RPA技術(shù)不需要高質(zhì)量的模板，其反應(yīng)條件簡單，不需要復(fù)雜的變溫儀器，通過合理的特異性引物設(shè)計(jì)，即可在常溫下進(jìn)行靶標(biāo)病毒檢測[34-36]。本研究針對ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV 這4種病毒，設(shè)計(jì)了特異性的RPA擴(kuò)增引物，通過對溫度、反應(yīng)時(shí)間以及檢測靈敏度等方面的系統(tǒng)優(yōu)化，建立了特異性強(qiáng)，靈敏度高的RT-RPA新型快速檢測方法，能夠適用于在條件簡陋的情況下快速檢測蘋果病毒。

在反應(yīng)時(shí)間上，本研究采用的RT-RPA技術(shù)比常規(guī)RT-PCR在檢測時(shí)間上縮短了1 h；在靈敏度上，RT-RPA比RT-PCR高102～103倍；在反應(yīng)溫度上，37 ℃條件下即可很好地進(jìn)行擴(kuò)增。這表明RPA擴(kuò)增技術(shù)可以很好檢測低濃度病毒載量，在病毒感染初期或者苗木病毒檢測中，具有明顯的優(yōu)勢，隨著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用可以完美替代RT-PCR檢測。此外，RPA反應(yīng)組分以凍干粉末的形式提供，這提高了檢測試劑的穩(wěn)定性，使得該過程易于遵循，并防止檢測被污染。

目前，采用RPA技術(shù)檢測蘋果病毒病的研究相對較少，KIM等[27]根據(jù)梨樹中ASGV病毒分離物的CP區(qū)域設(shè)計(jì)出了能夠檢測ASGV的RPA引物，但經(jīng)過序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，該引物設(shè)計(jì)區(qū)域保守性較差，可能無法滿足變異ASGV病毒的檢測。本研究針對ASGV、ASPV、ApNMV和ACLSV 4種病毒，通過不同病毒分離物的序列比對，設(shè)計(jì)出了特異性RPA引物，可以滿足這4種病毒的特異性檢測，效果顯著。雖然本研究采用的是瓊脂糖電泳檢測陽性結(jié)果，但設(shè)計(jì)的引物也可以結(jié)合側(cè)向流動試紙條或者熒光檢測技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用。

綜上所述，RT-RPA有可能在田間直接進(jìn)行病毒檢測，有助于及時(shí)根除感病植株，從而最大限度地降低病毒傳播相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。鑒于RT-RPA檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，建議進(jìn)一步加大RT-RPA技術(shù)在蘋果病毒檢測方面的研發(fā)。