賀丹， 曹健康， 何松林， 張明星， 華超， 張佼蕊， 劉藝平,3

(1.河南農業(yè)大學風景園林與藝術學院，河南 鄭州 450002；2.河南科技學院園藝園林學院，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.河南省優(yōu)質花卉蔬菜種苗工程研究中心，河南 鄭州 450002)

牡丹(Paeoniasuffruticosa)和芍藥(Paeonialactiflora)同屬于芍藥科芍藥屬植物，其花色艷麗、品類繁多，深受人們的喜愛[1-2]。遠緣雜交可以打破種屬之間的界限，擴大遺傳變異，是改良作物品質和創(chuàng)造新物種的重要手段[3-5]。牡丹、芍藥遠緣雜交種‘Itoh’因具有更強的抗性、觀賞性，獲得更多學者的關注[6-7]。但芍藥屬遠緣雜交存在著嚴重的不親和問題，這導致了其育種工作進展緩慢[8-10]。有研究表明，激素在遠緣雜交不親和中起著重要的作用[11]。在百合[12]、楊樹[13]的相關研究中發(fā)現(xiàn)，自交親和樣本中ABA含量低于雜交不親和樣本，這表明內源激素ABA對于雜交親和性起著重要的作用。ABC蛋白作為植物細胞膜蛋白的重要組成成分，參與植物細胞生命活動的諸多過程[14]。其中ABCG蛋白作為ABC八大家族蛋白之一，在植物的花器官發(fā)育、次生代謝產物運輸、激素的運輸、胚發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用[15]。已有研究報道，ABCG家族基因可以調控花粉外壁形成，從而影響花粉的發(fā)育，如在擬南芥中AtABCG26、AtABCG1、AtABCG16通過影響花粉外壁形成所需物質的運輸，影響花粉的育性[16-17]；在水稻中OsABCG3、OsABCG11與OsABCG15亦通過影響花粉外壁的形成進而對花粉的育性產生影響[18-22]。ABCG部分家族基因可以參與細胞間ABA信號通路，控制氣孔的開關，在擬南芥響應外界脅迫中起著重要作用[23-24]。河南農業(yè)大學牡丹資源與育種學課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，芍藥ABC家族基因PlABCF3在芍藥屬遠緣雜交過程中與內源激素有著密切關系，為研究芍藥屬遠緣雜交不親和提供了一個新的思路。在芍藥轉錄組基礎上克隆出一個芍藥ABC家族中ABCG基因，將其命名為PlABCG15，通過對該基因進行生物信息學分析、表達特性分析及亞細胞定位，以期為進一步研究PlABCG15基因的功能以及在芍藥屬遠緣雜交不親和中的作用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用材料均取自于河南省優(yōu)質花卉蔬菜種苗工程研究中心，以芍藥‘粉玉奴’為母本，牡丹‘鳳丹白’為父本。根據前期研究得到不親和的關鍵時期，選取‘粉玉奴’自交、‘粉玉奴’與‘鳳丹白’雜交1～12、24、36 h的柱頭以及‘粉玉奴’的根、莖、葉、花、芽為試驗材料，將獲得的材料液氮速凍后放入-80 ℃冰箱進行保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA的提取與反轉錄 RNA提取采取改良的CTAB法[25]， RNA的反轉錄參照HiScript?II1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)試劑盒(南京諾威贊)，3次生物學重復，于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2PlABCG15基因的克隆 利用軟件peimer 5進行PlABCG15基因的特異性引物設計PlABCG15-F和PlABCG15-R(表1)。以cDNA為底物進行PCR擴增，反應體系20 μL：2xfast pfu master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，cDNA1 μl，最后補充ddH2O到20 μL。反應程序為：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，53 ℃退火30 s，72 ℃擴增延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸15 min；12 ℃保存。PCR產物經質量分數(shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收。

將回收產物同Takara的pMDTM18-T進行載體連接并轉化到大腸桿菌TOP10中，37 ℃倒置培養(yǎng)8～12 h，選取陽性菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。將測序正確的菌株擴大培養(yǎng)后提取質粒。

1.3 PlABCG15基因的生物信息學分析

通過在線網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對芍藥PlABCG15基因的ORF區(qū)進行查詢；利用在線工具推導PlABCG15蛋白理化性質、信號肽、跨膜結構、結構域及二級結構[26-27]。同源氨基酸序列比對用DNAMAN9.0；利用MEGA7.0程序，按照鄰近法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 PlABCG15基因的實時熒光定量

通過生工生物工程上海(股份)有限公司用PlABCG15基因的cDNA序列設計熒光定量引物，內參基因為β-Tubulin(表1)。以芍藥‘粉玉奴’自交1～12 、24 、36 h的柱頭cDNA、芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交1～12 、24 、36 h的柱頭cDNA以及芍藥‘粉玉奴’的根、莖、葉、花、芽的cDNA為模板；操作步驟參照SYBRPremixExTaq TM試劑盒(寶日醫(yī)生物技術有限公司)。反應結果采取2-ΔΔCt法計算目的基因表達量。

表1 PlABCG15擴增引物與熒光定量引物Table 1 Amplification primers and fluorescent quantitative primers of PlABCG15

1.5 PlABCG15基因的亞細胞定位

將獲得的質粒與pcambia 2300載體質粒用QuickCut Sal Ⅰ和QuickCutKpnⅠ(Takara)進行雙酶切，用ClonExpress II One Step Cloning Kit試劑盒(南京諾威贊)進行基因重組構建GFP融合表達載體。將GFP融合表達載體通過熱擊法轉入大腸桿菌Top 10中，挑菌檢測后將序列正確的菌落進行質粒提取。將獲得的質粒與農桿菌GV3101按熱擊法進行轉化，將測序正確的菌落與空載菌液加入含有50 mg·L-1Kan、50 mg·L-1Str和50 mg·L-1Rif的3種抗生素的LB液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后進行煙草葉片注射，將處理后的葉片黑暗處理24 h再正常光照培養(yǎng)2 d后進行亞細胞定位。

1.6 ABA激素的提取與測定

對自交柱頭(1～12，24 ，36 h)及雜交柱頭(1～12 ，24 ，36 h)利用酶聯(lián)免疫法進行ABA含量的測定。具體的實驗材料處理及操作步驟參照植物激素脫落酸(ABA)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)生物)。運用 Microsoft Excel 2016 軟件對數(shù)據進行統(tǒng)計整理制圖，用 SPSS 22.0 軟件進行PlABCG15基因與 ABA激素之間的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 PlABCG15基因的克隆

以芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交24 h柱頭的cDNA為底物，獲得一條1 098 bp的條帶(圖1)。將條帶切下后送生工生物工程上海(股份)有限公司進行測序，測序結果與目的基因序列比對顯示完全一致。

注：泳道M表示DL 2 000 Marker；泳道1表示PlABCG15基因的CDS全長。Note: Lane M represents DL 2 000 marker; Lane 1 represents the full length of CDS of the PlABCG15 gene.圖1 PlABCG15的電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of PlABCG15

該基因的ORF區(qū)共編碼366個氨基酸序列，通過NCBI比對發(fā)現(xiàn)，該基因與葡萄中的VvABCG15同源性最高，故命名為PlABCG15，GenBank登錄號為MZ374449。利用NCBI中blast對芍藥PlABCG15基因氨基酸比對，選取同源性較高的10種植物，利用MEGA 7.0軟件進行構樹。系統(tǒng)進化樹(圖2)顯示，芍藥與海棠分為一支。

圖2 PlABCG15基因的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比對圖Fig.2 Amino acid sequence alignment of PlABCG15 with other species

從NCBI數(shù)據庫中下載與PlABCG15基因氨基酸序列同源性較高的胡桃、櫻桃、獼猴桃、蘋果、海棠5種植物的ABCG15氨基酸序列，用DANMAN9.0進行氨基酸序列比對(圖3)，結果顯示,其相似性為73.90%～74.79%，其中與胡桃的相似度最高。MEME在線軟件共鑒定出5個相同的保守結構區(qū)域(圖3)。

圖3 PlABCG15基因的氨基酸序列與其他物種氨基酸序列比對圖Fig.3 Amino acid sequence alignment of PlABCG15 gene with other species

2.2 PlABCG15基因的蛋白理化性質

通過在線工具ProtParam分析可知PlABCG15基因的理論相對分子質量約為41.4，原子總數(shù)5 849個，預測分子式C1917H2931N483O495S23，理論等電點(pI)為9.71。開放閱讀框共1 098 bp，共編碼366個氨基酸，其中帶有負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)總電荷為20，正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)總電荷數(shù)39，總體呈正電荷。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)40.86，總親水性平均系數(shù)0.239，由此可推測這是一個帶正電荷的不穩(wěn)定疏水性蛋白。TMpred顯示該蛋白具有6個跨膜螺旋區(qū)，分別位于64～81，94～113，140～163，171～197，200～221，291～309位氨基酸。GOR4預測顯示該蛋白的二級結構中，α-螺旋(Alpha helix)為21.64%，延伸鏈(Extended strand)為31.23%，不規(guī)則卷曲(Random coil)為47.12%(圖4-a)。CD-search結果顯示，PlABCG15蛋白含有1個功能結構域，為在47～252位氨基酸殘基組成的ABC2功能結構域(圖4-b)。

注：a：PlABCG15蛋白的二級結構預測；b：PlABCG15蛋白的跨膜區(qū)域預測。Note: a:secondary structure prediction of PlABCG15 protein; b:Transmembrane region prediction of PlABCG15 protein.圖4 芍藥PlABCG15蛋白氨基酸序列的結構預測Fig.4 Structural prediction of amino acid sequence of herbaceous peony PlABCG15 protein

2.3 PlABCG15基因的實時熒光定量與激素測定

不同部位的熒光定量結果顯示，PlABCG15基因在莖中的表達量達到最高，在根、花、葉中表達量較低(圖5)。不同自、雜交時期的實時熒光定量結果顯示，自交時期的基因表達量高于雜交時期，均呈整體上升趨勢(圖6)。在自交柱頭中，自交1～8 h基因表達量持續(xù)上升，8～12 h表達量上升幅度較小，在36 h表達量達到最大。在雜交柱頭中，1～3 h基因表達水平較低，4 h表達量增加后隨即降低，5～12 h表達水平相持，在36 h表達量達到最大。自交與雜交柱頭在授粉后24 h后基因的表達量均出現(xiàn)了明顯的變化，且自交柱頭的變化量遠高于雜交柱頭。自交、雜交不同時期的柱頭中ABA含量如圖7所示，自交柱頭中ABA含量在4 h達到最高，在2、7、9、24、36 h含量相持且最低，其余時期含量相持且較高；雜交柱頭中在12 h含量最高，前7個時期含量持續(xù)下降(6 h上升)，8 h上升后隨即下降，直到12 h含量上升并達到最高，隨后ABA含量逐漸下降并在36 h達到最低。在同一時期的柱頭中，將同一處理柱頭的PlABCG15基因表達量與ABA含量數(shù)據導入SPSS 22.0，采用Bivariate correlations方法進行相關性分析，結果顯示，雜交柱頭中兩者呈顯著負相關關系，其Pearson相關系數(shù)為-0.474(P<0.01)；自交柱頭中兩者亦呈顯著負相關關系，其Pearson相關系數(shù)為-0.155(P<0.01)。

圖5 芍藥‘粉玉奴’不同部位中ABA含量與PlABCG15基因的表達分析Fig.5 Analysis of ABA content and expression of PlABCG15 gene in different parts of Paeonia lactiflora ‘fenyunu’

圖6 自交、雜交不同時期柱頭中PlABCG15基因的表達分析Fig.6 Expression analysis of PlABCG15 gene in stigma at different stages of inbreeding and hybridizations

圖7 自交、雜交不同時期柱頭中ABA含量分析Fig.7 Analysis of ABA content in stigma at different stages of inbreeding and hybridization

2.4 PlABCG15基因的亞細胞定位

將過表達載體注射進入煙草葉片細胞中后，制作切片在共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號。結果顯示，空載體定位在細胞膜上(圖8)，GFP融合表達載體定位與細胞的質膜上。

注：All、GFP、RFP、Bright分別表示紅色熒光和白光和綠色熒光疊加、綠色熒光、紅色熒光、白光D表示GFP融合蛋白在不同視野下的定位結果，比例尺為20 μm；E-H表示空載在不同視野下的定位結果，比例尺為50 μm。Note: All, GFP, RFP and Bright represents red fluorescence(RFP), white light and green fluorescence(GFP) superposition, green fluorescence(GFP), red fluorescence (RFP)and white light, respectively D showed the localization results of GFP fusion protein in different visual fields, with a scale of 20 μm; E-H refers to the positioning results of no-load in different fields of vision, with a scale of 50 μm.圖8 PlABCG15蛋白在煙草葉片中的亞細胞定位Fig.8 Subcellular localization of PlABCG15 protein in tobacco leaves

3 結論與討論

本研究從芍藥‘粉玉奴’與牡丹‘鳳丹白’雜交24 h柱頭中克隆出一個1 098 bp的ABCG家族基因，命名為PlABCG15(GenBank登錄號：MZ374449)，該基因共編碼366個氨基酸。生物學信息分析顯示PlABCG15的氨基酸序列與葡萄的VvABCG15氨基酸序列相似度最高，推測芍藥PlABCG15蛋白在次生代謝產物及激素的運輸方面扮演著重要角色[28]。qRT-PCR結果顯示，PlABCG15基因在芍藥‘粉玉奴’的根、莖、花、葉、芽中均有表達，在莖中表達量最高，這表明PlABCG15具有組成型表達的特點。

研究表明，ABCG基因與花粉的生長發(fā)育相關，水稻的OoABCG3與OoABCG15基因通過影響水稻花粉壁與絨氈層的形成，從而導致花粉失去活力，育性降低[19,21]。在擬南芥花粉壁形成的研究中發(fā)現(xiàn)，AtABCG1與AtABCG16基因主要是通過將花粉壁形成所需要的物質提前從絨氈層細胞運輸?shù)交ㄋ幨襾碛绊懟ǚ郾诘男纬蒣18]。河南農業(yè)大學牡丹資源與育種課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，雜交后24 h與36 h為不親和的關鍵時期[29]，在本研究中，PlABCG15基因在24、36 h時自交柱頭中的相對表達水平顯著高于雜交柱頭，因此推測PlABCG15可能通過影響花粉外壁形成和花粉發(fā)育來調控其遠緣雜交不親和性。ABA在植物的遠緣雜交中扮演著重要角色，ABA的產生與運輸由相關基因調控，ABCG家族中部分基因對ABA的運輸起著重要作用[30]。在楊樹[13]、虞美人[31]、南方棗[32]、鴨梨[33]、蘋果[34]的相關研究中發(fā)現(xiàn)，高含量的ABA對花粉識別、花粉萌發(fā)及花粉管的伸長起到了抑制作用。本研究中發(fā)現(xiàn)，雜交柱頭中ABA含量高于自交(除4、6、10、11 h外)，尤其在授粉后2 h，雜交柱頭ABA含量顯著高于自交柱頭。在之前的研究中觀察到授粉后2 h雜交柱頭上的花粉萌發(fā)較少，因此推測可能是由于高含量的ABA抑制了柱頭上花粉萌發(fā)，最終影響了遠緣雜交的親和性。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，自交與雜交不同時期柱頭ABA含量與PlABCG15基因的相對表達量呈顯著負相關關系，這一結果與張鵬[13]、朱瑋[31]等的研究結果一致，因此推測，PlABCG15基因可能通過對ABA的負調控來影響花粉的發(fā)育，進而影響了遠緣雜交不親和性。亞細胞定位顯示，PlABCG15編碼蛋白定位在質膜上，推測PlABCG15基因具有轉運功能，為進一步驗證PlABCG15基因在轉運激素方面的作用奠定基礎。