曹武璟，季 禾，譚 軍，栗延偉，秦全凱

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三臨床學院，河南 新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453003；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院功能檢查科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)的治療主要是通過阻止缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡來減輕腦缺血時腦損傷程度、縮小梗死體積。凋亡的發(fā)生主要通過促凋亡和抗凋亡蛋白的調(diào)控，在這一過程中微RNA(microRNA，miRNA)-信使RNA(messenger RNA,mRNA)軸發(fā)揮重要作用[1-2]。外界環(huán)境變化可使miRNA的表達發(fā)生變化，通過參與基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控實現(xiàn)對靶基因的表達調(diào)節(jié)，從而調(diào)控細胞分化、增殖、凋亡以及細胞信號傳導途徑，在腫瘤發(fā)生發(fā)展、生物發(fā)育、器官形成、病毒防御、表觀調(diào)控以及代謝等方面發(fā)揮調(diào)控作用[3]。在神經(jīng)系統(tǒng)中miRNA大量表達，參與神經(jīng)系統(tǒng)的生長、發(fā)育及病理損傷和修復[4]；miRNA可通過直接作用于靶基因促進或抑制細胞的凋亡來參與腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。有研究報道，在神經(jīng)系統(tǒng)中miR-124、miR-29b、miR-125表達水平較高[7]；高英英[8]研究報道，miR-29b可通過調(diào)控靶基因蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)磷酸化水平降低心肌細胞凋亡水平來保護心臟，探討miR-29b在CIRI及損傷修復過程中的調(diào)控模式，對推動腦血管疾病的防治和針對CIRI治療藥物的研發(fā)具有重大意義[9-10]。近年來在缺血性腦梗死治療的臨床實踐中，提出了腦缺血藥物預處理的治療理念，其中腺苷預處理(adenosine preconditioning，AP)被證實可減輕CIRI，減小腦梗死體積，起到神經(jīng)保護作用，但AP的確切機制仍存在爭議[11]。本研究通過觀察AP對腦缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)大鼠腦組織miR-29b表達水平的影響，探討miR-29b在CIRI中的作用及AP發(fā)生保護作用的機制，從基因組學層面上探討在大鼠腦IR過程中腺苷能否通過miR-29b對腦組織起到保護作用，以期發(fā)現(xiàn)靶向治療缺血性腦梗死的新思路、新途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康成年雄性Sprague Dawley大鼠135只由新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物中心提供，動物合格證號：SCXK(魯)20190003，體質(zhì)量250～280 g。將所有大鼠均分籠飼養(yǎng)于通風良好的動物房，室內(nèi)溫度控制在25 ℃左右，相對濕度40%～70%，設(shè)置12 h/12 h的光/暗周期，普通大鼠飼料喂養(yǎng)，可隨意獲得水和食物。

1.2 試劑與儀器大腦中動脈栓塞模型(middle cerebral artery occlusion model，MCAO)栓線(型號2636-A4)購自北京西濃科技有限公司，miR-29b、U6引物購自美國Invitrogen公司，腺苷、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)購自美國 Sigma 公司，蘇木精染料購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)單克隆抗體、兔抗小鼠磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)、Akt單克隆抗體、人髓細胞白血病1(myeloid cell leukemia-1，MCL-1)單克隆抗體購自美國Bcam公司，廣譜型miRNA 提取試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(Mir-X miRNA first-strand synthesis)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TB Green染料法定量試劑盒購自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，異丙醇購自上?；瘜W試劑公司，放射免疫沉淀測定(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)裂解液購自上海申能博彩生物科技有限公司；二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒購自上海易色醫(yī)療科技有限公司，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR)儀、電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司，Z216MK 型冷凍離心機購自德國HERMLE公司，全波長讀數(shù)儀購自美國Thermofisher公司，脫水機、包埋機、石蠟切片機購自上海徠卡儀器有限公司，正置光學顯微鏡、成像系統(tǒng)購自日本尼康株式會社。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及預處理將135只大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、IR組、AP組， 每組45只。AP組大鼠在手術(shù)前3 d腹腔注射2 mL腺苷注射液(1.5 mg·kg-1)，每日1次；假手術(shù)組和IR組大鼠在手術(shù)前3 d每日相同時間點腹腔注射2 mL生理鹽水。

1.3.2 大鼠CIRI模型制備及神經(jīng)功能損傷評分IR組和AP組大鼠參考LONGA等[12]方法，采用改良線栓法制備大鼠MCAO模型，具體步驟：大鼠術(shù)前禁食、水2 h，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)進行麻醉，當大鼠對疼痛刺激反應(yīng)遲鈍后，備皮切開頸部皮膚，鈍性分離皮下組織、神經(jīng)，暴露左側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)、頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)，用MCAO栓線依次結(jié)扎ECA分叉部和同側(cè)CCA近心端，在距離頸總動脈末端約5 mm的位置剪一約0.2 mm的小口，將直徑為0.2 mm的栓線沿CCA方向插入，直至MCA的起始部，深度由分叉部計算，至約(18.5±0.5)mm處即開始計時。栓塞2 h后由2名實驗者根據(jù)5分制神經(jīng)行為學評分標準[13]對大鼠進行神經(jīng)功能損傷評分。0分:無明顯神經(jīng)功能障礙；1分:左側(cè)前爪不能完全伸展；2分:行走時，大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈；3分:行走時，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒；4分:無自主活動能力；5分：死亡。將評分為 1～3分的大鼠納入后續(xù)實驗，輕輕向外拔栓線使大鼠大腦動脈Willis環(huán)和MCA恢復血供。假手術(shù)組大鼠不做ECA和CCA結(jié)扎，其余手術(shù)方法同IR 組和AP 組。手術(shù)過程中3只大鼠因線栓插入過深導致蛛網(wǎng)膜下腔出血剔除，5只大鼠因麻醉藥物劑量過大或者對麻醉藥物個體差異導致麻醉死亡，隨時補充各組大鼠保證每組大鼠造模數(shù)量一致。術(shù)后單籠飼養(yǎng)大鼠，給予充足的飲水和飼料。

1.3.3 TTC染色法觀察大鼠腦梗死體積手術(shù)后24 h，隨機選取每組造模成功大鼠3只，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)進行麻醉，麻醉成功后，斷頭器處死大鼠，剪開顱頂皮膚，將顱骨與頸椎交界處分開，用剪刀剪開顱骨，用組織鉗向兩側(cè)分離顱骨，最后用小彎鑷撥取腦組織，冰生理鹽水沖洗后-20 ℃冷凍20 min；將腦組織切成2 mm的冠狀切片，生理鹽水沖洗，加TTC 磷酸鹽緩沖液，37 ℃孵育30 min，每隔5 min翻動1次，30 min后鏡下觀察，正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈現(xiàn)白色，數(shù)碼相機拍照，計算各組大鼠腦梗死體積占比，腦梗死體積占比=(∑梗死面積×切片厚度)/(∑全腦面積×切片厚度)× 100%。

1.3.4 HE染色觀察大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元細胞存活情況每組大鼠手術(shù)后24 h隨機選取3只，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛溶液(3 mL·kg-1)進行麻醉，打開胸腔，撕去心包，腹主動脈及下腔靜脈用文氏鉗夾住，經(jīng)左心室給予200 mL生理鹽水灌注，40 g·L-1多聚甲醛液200 mL進行心臟灌流固定，隨即斷頭、開顱，于視交叉后1～4 mm冠狀切取腦組織，于40 g·L-1多聚甲醛固定液中固定24 h，行石蠟包埋，在海馬平面冠狀連續(xù)切片，厚度4 μm，在體積分數(shù)100%、95%、85%、75%的梯度乙醇溶液中分別脫水5 min，流水沖洗后，蘇木精染色10 min，伊紅液染色3 min，然后依次于體積分數(shù) 75%、85%、95%、100%梯度乙醇溶液中脫水2 min，二甲苯透明處理，中性樹膠封片，顯微鏡觀察大鼠海馬腦組織病理學變化。

1.3.5 qRT-PCR法測定大鼠腦海馬組織miR-29b的表達每組大鼠于手術(shù)后2、6、24、48 h隨機取4只，斷頭、開顱，取腦海馬組織，應(yīng)用廣譜型miRNA提取試劑提取總miRNA，用全波長讀數(shù)儀測定總miRNA濃度及純度，選取miRNA的光密度值(optical density，OD)260/OD280值在1.8～2.1之間的樣本。按cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，按qRT-PCR試劑盒說明書進行檢測，以U6為參照，引物設(shè)計如下: miR-29b上游引物序列為5′-TCCCTGAGACCCTAACTTGTGA-3′，下游引物序列為5′-AGCATGAATCGTACCGTGAGT-3′;U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為 5′- CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。配制總體積為25 μL的qRT-PCR反應(yīng)液:ddH2O 9.0 μL，TB Green Advantage Premix (2×) 12.5 μL，ROX Dye(50×)0.5 μL，上游引物 0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 2.0 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預變性30 s;95 ℃變性5 s;60 ℃變性20 s，62 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。擴增完畢后進行熔解曲線分析，每個樣本重復檢測3次，應(yīng)用2-△△Ct法計算miRNA-29b相對表達量。

1.3.6 靶基因預測軟件對miR-29b凋亡相關(guān)靶基因進行預測應(yīng)用TargetScan、miRDB、mirBase靶基因預測軟件進行交叉分析，尋找miRNA-mRNAs軸下游與miR-29b相關(guān)的凋亡蛋白，經(jīng)預測篩選出與miR-29b可能相關(guān)的凋亡蛋白為Bcl-2、Mcl-1和p-Akt蛋白，將此3種蛋白用于后續(xù)實驗。

1.3.7 Western blot法檢測大鼠海馬組織中Bcl-2、Mcl-1和p-AKt蛋白的表達每組大鼠于手術(shù)后2、6、24、48 h隨機取4只，斷頭、開顱，取腦海馬組織，充分研磨后，取80 mg研磨組織加入蛋白裂解液，在冰上反應(yīng)30 min，3 000 r·min-1離心10 min后取上清，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，制備質(zhì)量分數(shù)5%分離膠、質(zhì)量分數(shù)10%濃縮膠，取40 μg蛋白進行電泳，電泳開始時電壓設(shè)置為80 V，進入分離膠后，電壓調(diào)整為120 V，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移蛋白凝膠至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，電壓設(shè)置為260 mA，轉(zhuǎn)膜反應(yīng)90 min，加入三乙醇胺緩沖鹽水溶液(tris buffered saline + tween 20，TBST)清洗后，加入體積分數(shù)5%的脫脂牛奶，室溫下封閉1 h，TBST清洗PVDF膜，加入甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)(15 000)、p-Akt(11 000)、Akt(11 000)、Bcl-2(11 000)，4 ℃孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，應(yīng)用化學發(fā)光試劑顯影、曝光。以GAPDH 蛋白條帶作為內(nèi)參，應(yīng)用Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image J圖像軟件定量分析條帶灰度值，以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠神經(jīng)行為學評分及腦梗死體積比較假手術(shù)組、IR 組和AP組大鼠神經(jīng)行為學評分分別為0.000±0.000、2.158±0.431、1.249±0.539，腦梗死體積占比分別為(0.000±0.000)%、(0.352±0.041)%、(0.272±0.052)%；3組大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積占比比較差異有統(tǒng)計學意義(F=186.500、191.300，P<0.05)，IR 組和AP組大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積占比顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積占比顯著低于IR 組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 3組大鼠腦皮質(zhì)病理學表現(xiàn)假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常(圖1A)；IR組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂、數(shù)目明顯減少、結(jié)構(gòu)疏松，細胞體積變小，細胞核溶解、出現(xiàn)空泡，細胞膜完整性破壞，細胞呈三角形或梭形，間質(zhì)水腫(圖1B)；與IR組比較，AP組大鼠神經(jīng)元損傷顯著減輕(圖1C)。

A:假手術(shù)組；B:IR組;C:AP組。

2.3 3組大鼠海馬組織中 miR-29b相對表達量比較結(jié)果見表1。手術(shù)后2、6、24、48 h,IR組和AP組大鼠海馬組織中 miR-29b相對表達量顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠海馬組織中 miR-29b相對表達量顯著高于IR 組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。假手術(shù)組大鼠手術(shù)后2、6、24、48 h海馬組織中 miR-29b相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IR組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中 miR-29b相對表達量呈增高趨勢，手術(shù)后48 h開始降低(P<0.05)；AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中 miR-29b相對表達量呈增高趨勢，手術(shù)后48 h開始降低(P<0.05)。

表1 3組大鼠海馬組織中 miR-29b相對表達量比較

2.4 3組大鼠海馬組織中Bcl-2、Mcl-1及p-Akt蛋白表達水平比較結(jié)果見表2和圖2。假手術(shù)組大鼠手術(shù)后2、6、24、48 h海馬組織中Bcl-2、Mcl-1和p-Akt相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；IR組和AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中Bcl-2、Mcl-1和p-Akt相對表達量呈顯著增高趨勢(P<0.05)，手術(shù)后48 h開始降低。手術(shù)后2、6、24、48 h，IR組和AP組大鼠海馬組織中Bcl-2相對表達量顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠海馬組織中Bcl-2相對表達量顯著高于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IR組大鼠后手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中Mcl-1相對表達量顯著高于假手術(shù)組，手術(shù)后48 h顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中Mcl-1相對表達量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AP組與假手術(shù)組大鼠手術(shù)后48 h海馬組織中Mcl-1相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；AP組大鼠手術(shù)后2、6、24、48 h海馬組織中Mcl-1相對表達量顯著高于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IR組大鼠手術(shù)后2、6、24、48 h海馬組織中p-Akt相對表達量顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中p-Akt相對表達量顯著高于假手術(shù)組，手術(shù)后48 h海馬組織中p-Akt相對表達量顯著低于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AP組大鼠手術(shù)后2、6、24、48 h海馬組織中p-Akt相對表達量顯著低于IR組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 3組大鼠手術(shù)后海馬組織中Bcl-2、Mcl-1及p-Akt蛋白相對表達量比較

1:假手術(shù)組；2:IR組；3：AP組。

3 討論

目前，缺血再灌注仍然是缺血性腦梗死的主要治療措施，但是腦組織血液的再次供應(yīng)會啟動一系列復雜的信號級聯(lián)反應(yīng)，誘導遲發(fā)性神經(jīng)細胞凋亡，因此，如何減輕腦梗死后遲發(fā)性神經(jīng)細胞的凋亡是目前臨床CIRI防治中亟待解決的難題。在近年來缺血性腦梗死治療的臨床實踐中，逐漸提出了腦缺血預處理(cerebral ischemia preconception，CIP)的治療理念[13]，它是指腦組織在適應(yīng)了1次或多次短暫的缺血狀態(tài)后，腦組織被誘導產(chǎn)生多種內(nèi)源性保護機制，由此提高神經(jīng)元對較長時間缺血的耐受[14-15]；隨后又出現(xiàn)了藥物預處理，臨床實踐中在發(fā)生腦缺血之前給予患者短暫性缺血預處理是不合實際的，而藥物預處理更容易被患者接受，且使用范圍廣、成本低。AP被證實能夠從擴張腦部血管、抑制血小板聚集、降低細胞代謝等途徑等多方面來減輕CIRI，減小腦梗死體積，起到神經(jīng)保護作用[16]，但其確切機制仍然存在爭議[17]。

本研究結(jié)果顯示，IR組和AP組大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積占比顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠神經(jīng)行為學評分和腦梗死體積占比顯著低于IR 組。腦皮質(zhì)病理學檢查結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；IR組大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元排列紊亂、數(shù)目明顯減少、結(jié)構(gòu)疏松，細胞體積變小，細胞核溶解、出現(xiàn)空泡，細胞膜完整性破壞，細胞呈三角形或梭形，間質(zhì)水腫；與IR組比較，AP組大鼠神經(jīng)元損傷顯著減輕。這一結(jié)果與文獻[16-17]報道一致，進一步證實，IR可造成大鼠腦組織壞死、導致神經(jīng)功能損傷；AP預處理可顯著改善腦梗死大鼠的神經(jīng)行為學評分，提高梗死區(qū)腦細胞的存活率，減輕IR造成的神經(jīng)功能損傷。

miRNA是參與基因表達調(diào)控的短鏈RNA序列，其與靶基因結(jié)合后抑制mRNA的翻譯或促進mRNA的降解，對多種下游靶蛋白進行激活或抑制，從而調(diào)控細胞死亡過程[18-19]。EISENREICH等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在血管緊張素Ⅱ誘導的人足細胞損傷中，miR-29b可以通過降低Akt的磷酸化調(diào)控足細胞的凋亡。以往研究多關(guān)注miR-29b對腫瘤的調(diào)控作用。而有研究報道，miR-29b在CIRI患者神經(jīng)細胞中顯著上調(diào)，認為miR-29b可通過改變大腦皮層中通常高表達的關(guān)鍵信號元件參與CIRI[21-22]；激活的miR-29b在神經(jīng)元成熟過程中通過靶向BH3蛋白表達促進神經(jīng)細胞凋亡[23]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠術(shù)后各個時間點海馬組織中miR-29b相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義，說明在正常腦組織細胞內(nèi)，miR-29b的表達量較低，且維持在一個較穩(wěn)定的水平；IR組和AP組大鼠海馬組織中miR-29b相對表達量在術(shù)后各時間點均顯著高于假手術(shù)組，且AP組大鼠海馬組織中miR-29b相對表達量在術(shù)后各時間點均顯著高于IR組，IR組和AP組大鼠海馬組織中miR-29b的相對表達量在手術(shù)后2、6、24 h呈增高趨勢，之后緩慢降低。這說明，當正常腦細胞受到缺血再灌注損傷刺激時，會迅速引起細胞內(nèi)miR-29b的表達增加，參與到調(diào)控細胞凋亡的過程，在腦梗死發(fā)病24 h內(nèi)的miRNA-mRNA軸表達活躍，miR-29b的相對表達量持續(xù)增高，在發(fā)病24 h達到高峰；腺苷可能作為一種miR-29b誘導劑促使大鼠海馬組織miR-29b相對表達量顯著增高，進而通過降低細胞凋亡發(fā)揮腦保護作用。

Akt具有CIRI后抗神經(jīng)細胞凋亡的作用，并在多器官缺血再灌注損傷中均能發(fā)揮保護功能，是已被證實且廣泛存在的參與細胞凋亡信號通路的關(guān)鍵蛋白。Akt被激活后一方面本身能抑制多種不同凋亡傳遞物和神經(jīng)細胞死亡，另一方面，形成p-Akt后，能夠增強神經(jīng)細胞的抗凋亡能力，在神經(jīng)元損傷的再生和修復中起決定性作用[24-25]。Bcl-2作為Akt信號通路下游的關(guān)鍵物質(zhì)，是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)保護因子，與CIRI后神經(jīng)元的存活有著密切的聯(lián)系。Mcl-1是Bcl-2家族中重要的抗凋亡蛋白，可通過線粒體途徑發(fā)揮抗細胞凋亡作用，促進細胞的存活。陳浩等[26]研究表明，miR-29b通過靶向下調(diào)Mcl-1表達促進腦缺血缺氧時神經(jīng)細胞凋亡。本研究結(jié)果提示，假手術(shù)組大鼠手術(shù)后各時間點間海馬組織中Bcl-2、Mcl-1和p-Akt相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義，與海馬組織內(nèi)miR-29b的變化趨勢較為一致，說明在正常海馬組織細胞內(nèi)Bcl-2、Mcl-1、p-Akt維持在一個較穩(wěn)定的水平。IR組和AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中Bcl-2、Mcl-1和p-Akt相對表達量呈顯著增高趨勢，手術(shù)后24 h開始降低。手術(shù)后2、6、24、48 h，IR組和AP組大鼠海馬組織中Bcl-2相對表達量顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠海馬組織中Bcl-2相對表達量顯著高于IR組。IR組大鼠手術(shù)后2、6、24 h 海馬組織中Mcl-1相對表達量顯著高于假手術(shù)組，手術(shù)后48 h顯著低于假手術(shù)組；AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h 海馬組織中Mcl-1相對表達量高于假手術(shù)組，而2組大鼠手術(shù)后48 h海馬組織中Mcl-1相對表達量比較差異無統(tǒng)計學意義；AP組大鼠術(shù)后各時間點海馬組織中Mcl-1相對表達量均高于IR組。IR組大鼠手術(shù)后各時間點海馬組織中p-Akt相對表達量顯著高于假手術(shù)組，AP組大鼠手術(shù)后2、6、24 h海馬組織中p-Akt相對表達量顯著高于假手術(shù)組，而手術(shù)后48 h海馬組織中p-Akt相對表達量顯著低于假手術(shù)組；AP組大鼠手術(shù)后各時間點海馬組織中p-Akt相對表達量顯著低于IR組。以上結(jié)果說明，當正常腦細胞受到IR損傷時，由于細胞的自我保護機制，細胞內(nèi)抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表達量增加，參與到抗細胞凋亡的過程；而IR本身也會引起促凋亡蛋白p-Akt的上升；經(jīng)過AP后，梗死區(qū)海馬組織抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1相對表達量顯著升高，促凋亡蛋白p-Akt相對表達量降低。因此，推測腺苷可能作為一種miR-29b誘導劑使大鼠海馬組織miR-29b相對表達量顯著增高，而miR-29b可能通過降低腦細胞內(nèi)Akt磷酸化水平，促進Bcl-2、Mcl-1抗凋亡蛋白的表達，抑制IR后神經(jīng)細胞凋亡，縮小腦梗死體積，起到神經(jīng)保護作用，從而減輕CIRI。

綜上所述，AP能夠在再灌注早期增加miR-29b的表達，且與腦缺血的嚴重程度及再灌注時間相關(guān)，其通過抑制Akt磷酸化水平、促進抗凋亡蛋白Bcl-2和Mcl-1的表達調(diào)控細胞凋亡，從而發(fā)揮對CIRI的保護作用；因此，miR-29b可以作為缺血性卒中早期診斷的生物標志物和早期治療的有效靶標，且可以通過人工合成miR-29b模擬物和抑制劑改變內(nèi)源性miRNA水平。