才忠民，趙曉勇

（南方醫(yī)科大學(xué)附屬花都醫(yī)院骨科，廣東 廣州 510800）

骨質(zhì)疏松癥（OP）是一種骨代謝性疾病，常見于中、老年人，也是促進(jìn)其他骨科疾病惡化的誘因［1］.Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在人體普遍存在，Wnt與存在于細(xì)胞膜上的相關(guān)蛋白受體結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄共活化因子β-catenin是該信號通路的核心部分和最終目標(biāo).NPY是氨基酸組成的一種特異性神經(jīng)遞質(zhì)，分布于多處的神經(jīng)系統(tǒng)中，在調(diào)節(jié)各種基本生理功能中起著至關(guān)重要的作用.Y1R是第一個被發(fā)現(xiàn)為孤兒受體，位于人類染色體4q31.3-q32上［2］.本研究中應(yīng)用低氧處理成骨細(xì)胞株，構(gòu)建骨質(zhì)疏松癥體外細(xì)胞模型，然后采用Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑DKK1處理，進(jìn)一步深入分析DKK1對體外骨質(zhì)疏松癥模型的C518、MC3T3-E1成骨細(xì)胞株的作用機(jī)制和影響結(jié)果，為闡明骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制和靶向治療策略的研究提供了新的方向.

1 材料與方法

1.1 材料

選擇C518、MC3T3-E1成骨細(xì)胞株，C518細(xì)胞株購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心.MC3T3-E1細(xì)胞株購自ATCC.C518細(xì)胞的培養(yǎng)液是RPMI 1640，MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)液是DMEM/F12.

1.2 研究方法

1.2.1 NPY-Y1基因過表達(dá)和沉默

取一半各細(xì)胞株，分為：空載體組、空白對照組、NPY-Y1過表達(dá)組、NPY-Y1基因沉默組，分別加入特異慢病毒（NPY-Y1-cDNA）和空載慢病毒各20 μL，進(jìn)行孵育過夜處理.

1.2.2 細(xì)胞分組

未予任何處理的C518、MC3T3-E1細(xì)胞株為空白對照組（Con組）、NPY-Y1基因沉默組及過表達(dá)處理的C518、MC3T3-E1細(xì)胞株分為NPY-Y1基因沉默組（sh NPY-Y1組）、NPY-Y1過表達(dá)組（NPY-Y1OE組）.

1.2.3 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑 DKK1處理細(xì)胞和Western blot驗(yàn)證

接種4×105各組細(xì)胞于六孔板中，加入含5 μM DKK1（Stem RD，USA）的新鮮培養(yǎng)基，72小時后收獲細(xì)胞.取提取蛋白的細(xì)胞，棄上清，PBS洗2次.孵育后電泳分析結(jié)果.

1.2.4 Real time PCR檢測細(xì)胞中的NPY-Y1、Runx-2和Osterix的mRNA

細(xì)胞置入1.5 mL EP管內(nèi)，加入1.0 mL的Trizol溶液，4℃，12 000 rmp離心15 min.RNA的再溶解，棄去上層懸液，適度干燥RNA沉淀，再在管中加20 μL的DEPC水溶解.引物見表1.

表1 Real time-PCR檢測NPY-Y1、Runx-2和Osterix的引物結(jié)果Tab.1 Primers of NPY-Y1，Runx-2 and Osterix used in Real time-PCR and detection results

1.2.5 Western blot檢測細(xì)胞中的NPY-Y1、Runx-2和 Osterix蛋白差異

蛋白樣本進(jìn)行電泳，NPY-Y1、Runx-2中加入山羊抗兔二抗處理.然后依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、孵育二抗.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值進(jìn)行專業(yè)軟件分析結(jié)果.

1.2.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)

細(xì)胞用Lipofectamine 2 000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，每組3個復(fù)孔數(shù)據(jù)取平均值，而后計算各組的Luciferase熒光值/Renilla熒光值，得到校正后的Luciferase表達(dá)強(qiáng)度值.

1.2.7 Rescue實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種于24孔板，分組設(shè)置：pcDNA3+pcDNA3（0.6 μg+0.4 μg）；pcDNA3+pNPY-Y1（0.6 μg+0.4 μg）；p NPY-Y1+p sh Runx-2（0.6 μg+0.4 μg）.沉淀孵育，采用溶液置換后進(jìn)行蛋白半定量驗(yàn)證.

1.2.8 RNA-seq測序及分析

取1 μL RNA溶液進(jìn)行濃度及純度測定.構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)文庫，嚴(yán)格設(shè)定入庫條件，質(zhì)檢后進(jìn)行用RNA-seq測序，然后運(yùn)用SOAPaligner/SOAP2將其與參考序列進(jìn)行比對分析.

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用Prism 9軟件分析，多組間的比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1處理細(xì)胞和Western blot驗(yàn)證

在C518、MC3T3-E1細(xì)胞中，利用Wnt/β-catenin 抑制劑 DKK1（30 μmol/L）孵育細(xì)胞24 h.Western blot檢測，結(jié)果顯示DKK1對NPY-Y1、Runx-2和 Osterix顯著下調(diào)，差異明顯，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2和圖1-圖4.

表2 Wnt/β-catenin抑制劑DKK1處理細(xì)胞后蛋白變化（±s）Tab.2 Protein changes in cells after being treated with Wnt/β-catenin inhibitor DKK1（± s）

表2 Wnt/β-catenin抑制劑DKK1處理細(xì)胞后蛋白變化（±s）Tab.2 Protein changes in cells after being treated with Wnt/β-catenin inhibitor DKK1（± s）

項(xiàng)目NPY-Y1 Runx-2 Osterix t值P值C518MC3T3-E1 DKK1（-）12.20±1.57 10.55±1.47 11.24±1.39 2.779 0.027 DKK1（+）10.14±1.61 6.25±1.02 6.33±1.05 2.971 0.022 DKK1（-）11.96±1.81 10.43±1.35 11.24±1.33 2.995 0.020 DKK1（+）9.13±1.94 6.58±1.59 6.19±1.28 2.977 0.021

圖1 Wnt信號通路抑制劑DKK1作用C518細(xì)胞株后蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.1 Protein expression of C518 cell line after being treated with Wnt signaling pathway inhibitor DKK1

圖2 Western blot驗(yàn)證信號通路抑制劑DKK1作用C518細(xì)胞株后蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.2 Verification of protein expression of C518 cell line treated with signaling pathway inhibitor DKK1 by Western blot

圖3 Western blot檢測信號通路抑制劑DKK1作用MC3T3-E1細(xì)胞株后蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.3 Detection of protein expression of MC3T3-E1 cell line treated with signaling pathway inhibitor DKK1 by Western blot

圖4 Western blot驗(yàn)證信號通路抑制劑DKK1作用MC3T3-E1細(xì)胞株后蛋白表達(dá)結(jié)果Fig.4 Verification of protein expression of MC3T3-E1 cell line treated with signaling pathway inhibitor DKK1 by Western blot

2.2 Real time PCR 檢測細(xì)胞中的Wnt、NPY-Y1、Runx-2 和 Osterix的mRNA

DKK1未處理時sh NPY-Y1組和NPY-Y1OE組Wnt的mRNA明顯高于Con組，DKK1處理后sh NPYY1組和NPY-Y1OE組Wnt的mRNA顯著下調(diào).shNPY-Y1組和NPY-Y1OE組的NPY-Y1 mRNA差異顯著.Runx-2和 Osterix mRNA較DKK1未處理時顯著下調(diào)，P＜0.05，見表3和圖5.

表3 Real time PCR 檢測C518細(xì)胞Wnt、NPY-Y1、Runx-2 和 Osterix mRNA（±s，ng·mL-1）Tab.3 Detection of Wnt，NPY-Y1，Runx-2 and Osterix mRNA in C518 cells by Real time PCR（± s，ng·mL-1）

表3 Real time PCR 檢測C518細(xì)胞Wnt、NPY-Y1、Runx-2 和 Osterix mRNA（±s，ng·mL-1）Tab.3 Detection of Wnt，NPY-Y1，Runx-2 and Osterix mRNA in C518 cells by Real time PCR（± s，ng·mL-1）

Wnt 9.27±1.55 11.46±1.38 13.48±1.36 2.730 0.031項(xiàng)目Con sh NPY-Y1 NPY-Y1OE t值P值DKK1（－）DKK1（＋）NPY-Y1 5.19±1.32 6.05±1.17 10.31±1.55 2.763 0.030 Runx-2 5.88±1.43 7.04±1.21 14.59±1.33 2.799 0.029 Osterix 6.76±1.21 8.05±1.20 14.58±1.34 2.788 0.028 Wnt 5.26±1.45 6.29±1.43 7.28±1.44 2.872 0.024 NPY-Y1 5.20±1.31 11.88±1.36 13.38±1.57 2.997 0.023 Runx-2 3.89±1.42 4.15±1.68 5.42±1.33 2.996 0.023 Osterix 3.75±1.22 5.17±1.62 6.50±1.19 2.866 0.025

圖5 Real time PCR 檢測C518細(xì)胞Wnt、NPY-Y1、Runx-2和 Osterix mRNA差異Fig.5 Differences detection of Wnt，NPY-Y1，Runx-2 and Osterix mRNA in C518 cells by Real time PCR

2.3 Western blot檢測細(xì)胞中的Wnt、NPY-Y1、Runx-2 和 Osterix蛋白差異

DKK1未處理時sh NPY-Y1組和NPY-Y1OE組Wnt的蛋白明顯高于Con組，DKK1處理后sh NPY-Y1組和NPY-Y1OE組Wnt的蛋白顯著下調(diào).NPY-Y1組和NPY-Y1OE組的NPY-Y1蛋白與DKK1處理前差異顯著.Runx-2和Osterix mRNA較DKK1未處理時顯著下調(diào)，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表4和圖6.

表4 Western blot檢測C518細(xì)胞Wnt、NPY-Y1、Runx-2 和 Osterix 蛋白（±s，μg·mL-1）Tab.4 Detection of Wnt，NPY-Y1，Runx-2 and Osterix proteins in C518 cells by Western blot（± s，μg·mL-1）

表4 Western blot檢測C518細(xì)胞Wnt、NPY-Y1、Runx-2 和 Osterix 蛋白（±s，μg·mL-1）Tab.4 Detection of Wnt，NPY-Y1，Runx-2 and Osterix proteins in C518 cells by Western blot（± s，μg·mL-1）

Con sh NPY-Y1 NPY-Y1OE t值P值DKK1（－）DKK1（＋）項(xiàng)目Wnt 9.18±1.32 14.79±2.52 15.83±2.48 2.885 0.023 NPY-Y1 8.33±1.47 12.21±1.33 16.78±1.69 2.897 0.022 Runx-2 7.69±1.52 13.74±1.68 15.87±1.05 2.871 0.024 Osterix 8.57±1.30 14.25±1.69 16.97±1.32 2.875 0.024 Wnt 6.17±1.34 10.23±1.65 12.27±1.63 2.963 0.022 NPY-Y1 8.34±1.48 12.30±1.28 16.93±1.97 2.715 0.028 Runx-2 7.71±1.50 8.02±1.46 9.63±1.25 2.693 0.030 Osterix 8.58±1.29 10.17±1.62 12.39±1.20 2.557 0.032

圖6 Western blot檢測C518細(xì)胞Wnt、NPY-Y1、Runx-2和 Osterix蛋白差異Fig.6 Differences detection of Wnt，NPY-Y1，Runx-2 and Osterix protein in C518 cells by Western blot注：組間比較，*P＜0.05

2.4 雙熒光素酶報告基因

驗(yàn)證NPY-Y1直接結(jié)合靶基因Runx-2，根據(jù)載體構(gòu)建的基本步驟得到啟動子報告載體.嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)試劑盒操作，組間比較，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5和圖7、圖8.

表5 細(xì)胞中雙熒光素酶報告系統(tǒng)對質(zhì)粒luciferase熒光強(qiáng)度表達(dá)結(jié)果（±s）Tab.5 Fluorescence expression intensity of luciferase plasmid in cells in dual-luciferase reporter system（± s）

表5 細(xì)胞中雙熒光素酶報告系統(tǒng)對質(zhì)粒luciferase熒光強(qiáng)度表達(dá)結(jié)果（±s）Tab.5 Fluorescence expression intensity of luciferase plasmid in cells in dual-luciferase reporter system（± s）

項(xiàng)目pGL3-Control-luc+pGL3-Basic-luc+pGL3-Runx-2-luc t值P值C518 31.56±3.67 8.64±1.25 22.45±2.23 3.125 0.019 MC3T3-E1 27.59±2.46 6.31±1.34 18.57±2.01 3.330 0.016

圖7 C518細(xì)胞中雙熒光素酶報告系統(tǒng)對質(zhì)粒luciferase熒光強(qiáng)度表達(dá)Fig.7 Fluorescence expression intensity of luciferase plasmid in C518 cells in dual-luciferase reporter system

圖8 MC3T3-E1細(xì)胞中雙熒光素酶報告系統(tǒng)對質(zhì)粒luciferase熒光強(qiáng)度表達(dá)Fig.8 Fluorescence expression intensity of luciferase plasmid in MC3T3-E1 cells in dual-luciferase reporter system

NPY-Y1OE組Runx-2的啟動子活性高于Con組，sh NPY-Y1組Runx-2的啟動子活性低于Con組.結(jié)果見表6和圖9、圖10.

表6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子NPY-Y1調(diào)控Runx-2啟動子活性（±s）Tab.6 Verification of transcription factor NPY-Y1 regulating promoter activity of Runx-2 by dual-luciferase reporter system（± s）

表6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子NPY-Y1調(diào)控Runx-2啟動子活性（±s）Tab.6 Verification of transcription factor NPY-Y1 regulating promoter activity of Runx-2 by dual-luciferase reporter system（± s）

D K K 1（－）組別C o n s h N P Y-Y 1 N P Y-Y 1 OE t值P值C 5 1 8 6.5 4±1.0 5 3.2 9±0.6 7 9.6 7±1.4 7 2.8 7 1 0.0 2 4 M C 3 T 3-E 1 6.2 1±1.0 1 3.1 4±0.5 3 9.3 2±1.3 6 2.8 7 5 0.0 2 3 D K K 1（＋）C 5 1 8 6.5 8±1.0 3 5.3 1±0.6 9 1 3.3 6±1.6 8 2.8 5 3 0.0 2 5 M C 3 T 3-E 1 6.1 8±1.0 2 5.1 9±0.5 2 1 2.2 8±1.5 1 2.8 1 2 0.0 2 6

圖9 C518細(xì)胞NPY-Y1調(diào)控Runx-2啟動子活性結(jié)果Fig.9 Regulation of NPY-Y1 on promoter activity of Runx-2 in C518 cells

圖10 MC3T3-E1細(xì)胞NPY-Y1調(diào)控Runx-2啟動子活性結(jié)果Fig.10 Regulation of NPY-Y1 on promoter activity of Runx-2 in MC3T3-E1 cells

2.5 C518細(xì)胞中敲減Runx-2能挽救NPY-Y1對Runx-2表達(dá)的促進(jìn)作用

在外源敲減Runx-2后，能夠被順利的調(diào)整回復(fù)原來的表達(dá)水平，說明敲減Runx-2能挽救NPY-Y1對Runx-2表達(dá)的促進(jìn)作用.結(jié)果見表7和圖11、圖12.

表7 挽救實(shí)驗(yàn)中Real time PCR檢測C518細(xì)胞Runx-2的mRNA水平（±s）Tab.7 Detection of Runx-2 mRNA level in C518 cell by Real time PCR in rescue experiment（± s）

表7 挽救實(shí)驗(yàn)中Real time PCR檢測C518細(xì)胞Runx-2的mRNA水平（±s）Tab.7 Detection of Runx-2 mRNA level in C518 cell by Real time PCR in rescue experiment（± s）

DKK1（－）DKK1（＋）項(xiàng)目Con sh NPY-Y1 NPY-Y1OE t值P值pcDNA3+pcDNA3 0.78±0.05 0.57±0.06 0.89±0.04 3.250 0.017 pcDNA3+p NPY-Y1 7.32±1.25 5.54±1.36 7.76±1.49 3.365 0.016 p NPY-Y1+p sh Runx-2 0.39±0.06 0.28±0.03 0.45±0.05 3.152 0.018 pcDNA3+pcDNA3 0.79±0.04 0.68±0.05 0.97±0.02 3.412 0.015 pcDNA3+p NPY-Y1 7.33±1.26 7.02±1.33 9.58±1.26 3.553 0.014 p NPY-Y1+p sh Runx-2 0.40±0.06 0.34±0.02 0.48±0.04 3.114 0.019

圖11 挽救實(shí)驗(yàn)中Real time PCR檢測不同組C518細(xì)胞Runx-2的mRNA結(jié)果Fig.11 Detection of Runx-2 mRNA in different groups of C518 cells by Real time PCR in rescue experiment

圖12 挽救實(shí)驗(yàn)中Western blot檢測不同組C518細(xì)胞Runx-2的蛋白水平Fig.12 Detection of protein level of Runx-2 in different groups of C518 cells by Western blot in rescue experiment

2.6 RNA-seq對C518細(xì)胞不同組別差異表達(dá)基因測序

RNA-seq對C518細(xì)胞不同組別差異表達(dá)基因測序中，NPY-Y1與Runx-2和Osterix差異比較分析、熱圖及分層聚類見表8，圖13.

表8 RNA-seq的NPY-Y1與Runx-2和Osterix差異表達(dá)結(jié)果Tab.8 Differential expression of NPY-Y1，Runx-2 and Osterix in RNA-seq

圖13 RNA-seq差異表達(dá)mRNA的熱圖及分層聚類Fig.13 Thermal diagram and hierarchical clustering of differential expression mRNA in RNA-seq

3 討論

骨質(zhì)疏松癥目前發(fā)病率日益增多，已經(jīng)不局限于中老年人，甚至在青年人群中也常有發(fā)病［3］.骨質(zhì)疏松癥可以誘發(fā)其他骨代謝性疾病的發(fā)生，目前骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確［4］.介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控與骨質(zhì)疏松癥發(fā)病中的成骨細(xì)胞靶向分化過程密切相關(guān)，Wnt基因按照其生物學(xué)功能差異可以劃分為各自具有不同生物學(xué)功能的亞群［5］.在促進(jìn)骨成熟的生成方面，接受胞外信息后與LRP/Fz相結(jié)合，通過系列傳導(dǎo)將信息傳遞給下游的β-catenin，進(jìn)而發(fā)揮重要作用［6］.Runx-2基因和Osterix基因是成骨細(xì)胞在細(xì)胞分化前期重要基因，是促進(jìn)骨發(fā)育中的成骨細(xì)胞靶向分化成熟的特異性基因，兩者各自在成骨分化不同時期起到調(diào)控作用［7-9］.Osterix是Runx-2下游作用靶點(diǎn)，對成骨細(xì)胞具有高度特異性，影響多種成骨基因表達(dá)［10］.本文研究運(yùn)用Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑DKK1，阻斷信號蛋白的傳遞［11-13］.NPY在骨質(zhì)疏松癥中表達(dá)增加，作用可能是通過與Y1R結(jié)合而發(fā)揮的，在骨質(zhì)疏松癥模型中，內(nèi)源性和外源性NPY都可以發(fā)揮抗成骨細(xì)胞作用［14］.

筆者應(yīng)用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1處理細(xì)胞并用Western blot驗(yàn)證，研究結(jié)果為，DKK1對NPY-Y1、Runx-2和Osterix顯著下調(diào)，差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義.通過研究表明DKK1處理使各組中Wnt/β-catenin通路抑制，結(jié)果顯示，NPY-Y1、Runx-2和Osterix mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著下降.這就明顯說明信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的阻斷，完全抑制了轉(zhuǎn)錄因子NPY-Y1對靶基因Runx-2和Osterix的調(diào)控，考慮轉(zhuǎn)錄因子NPY-Y1與靶基因Runx-2和Osterix是直接結(jié)合作用.

研究結(jié)果證實(shí)，DKK1未處理時sh NPY-Y1組和NPY-Y1OE組Wnt的mRNA和蛋白明顯高于Con組，DKK1處理后sh NPY-Y1組和NPY-Y1OE組Wnt的mRNA和蛋白顯著下調(diào).shNPY-Y1組和NPY-Y1OE組的NPY-Y1 mRNA和蛋白差異顯著.Runx-2和Osterix mRNA和蛋白較DKK1未處理時明顯下調(diào).NPY-Y1OE組Runx-2的啟動子活性高于Con組，sh NPY-Y1組Runx-2的啟動子活性低于Con組.DKK1處理后結(jié)果差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.在外源敲減Runx-2后，Runx-2蛋白定量上調(diào)，說明敲減Runx-2能挽救NPY-Y1對Runx-2表達(dá)的促進(jìn)作用.DKK1處理后結(jié)果差異顯著，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）.

不同組別的RNA-seq研究中的結(jié)果顯示，C518和MC3T3-E1成骨細(xì)胞株測序?yàn)轱@著差異基因?yàn)?5個，其中定量上調(diào)的基因?yàn)?5個，定量下調(diào)的基因?yàn)?9個，NPY-Y1、Runx-2和Osterix基因?yàn)樽顬槊黠@的特異性基因.通路分析為Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.

綜上所述，通過DKK1處理，抑制 Wnt/β-catenin信號通路活性，抑制NPY-Y1、Runx-2和 Osterix基因表達(dá).揭示了NPY-Y1介導(dǎo)的Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控可能在骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的分子機(jī)制中起著重要作用.