王菁 王博 江斌 鄭坤木 肖乃安

腦卒中目前排在人類致死病因的第二位[1]，缺血性腦卒中是其主要組成部分，不斷探索其治療方案意義重大。TRPC6是一種非選擇性陽離子通道蛋白，廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中[2]。有研究表明在神經(jīng)元中活化的TRPC6可以磷酸化環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB），從而起到神經(jīng)元保護(hù)作用[3-4]。然而，當(dāng)腦缺血性卒中引起的腦缺血再灌注損傷發(fā)生時(shí)，異常激活的鈣蛋白酶（calpain）大量降解TRPC6，加重腦缺血再灌注損傷[5]。而增加TRPC6的表達(dá)可以保護(hù)缺血神經(jīng)元[6-11]。三七通舒膠囊的主要活性成分三七三醇皂苷（panaxtriol saponins，PTS）臨床上具有改善腦缺血功能障礙的作用，然而，其中機(jī)制尚未明確[12-14]。在本研究中，我們假設(shè)三七通舒膠囊可以抑制TRPC6降解，減輕腦缺血再灌注損傷，并在大鼠模型中得到驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 一般材料

三七通舒膠囊是由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)提供的，基于藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（good manufacture practice of medical products，GMP）生產(chǎn)的一種膠囊形式中成藥。在本研究中，我們使用膠囊內(nèi)黃棕色粉末，以方便大鼠灌胃給藥。三七通舒膠囊是五加科人參屬植物三七[Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen]的根及根莖精制加工而成的干燥提取物，已收載入《歐洲藥典》和《德國(guó)藥典》，制備方案編入新版《德國(guó)藥品法典/新處方規(guī)范》（Deutscher Arzneimittel-Codex/ Neues Rezeptur-Formulation，DAC/NRF）中 的“精制三七干燥提取物”專論（方案編號(hào)：N-185）。制備方法：以三七為原料，經(jīng)過60%的乙醇提取，再經(jīng)適宜的離子交換樹脂（注：即指《中國(guó)藥典》三七三醇皂苷標(biāo)準(zhǔn)中所述的大孔吸附樹脂）精制而成。鑒別方法及結(jié)果：我們采用薄層色譜法（thin-layer chromatography，TLC）分析提取物，結(jié)果顯示與標(biāo)準(zhǔn)PTS相比，純度達(dá)0.997（圖1）。主要成分為：人參皂苷Rg1（C42H72O14；Mr:837），約占60%；人參皂苷Re（C48H82O18；Mr:947），約占6%；三七皂苷R1（C47H81O18；Mr:934），約占15%，總量按干品計(jì)算不低于54.0%。

圖1 三七通舒膠囊的指紋圖譜（A）和高液相色譜法分析（B）注：（A）三七通舒膠囊與標(biāo)準(zhǔn)PTS的指紋圖譜，S2（5）代表三七通舒膠囊，R（5）代表標(biāo)準(zhǔn)PTS；（B）人參皂苷Rg1（保留時(shí)間=20.580 min），人參皂苷Re（保留時(shí)間=22.315 min），三七皂苷R1（保留時(shí)間=15.014 min）。

1.2 動(dòng)物處理

所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均嚴(yán)格遵守哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的倫理標(biāo)準(zhǔn)安全有效進(jìn)行。健康清潔級(jí)Wistar雄性大鼠由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分組：將54只大鼠（250～300 g）隨機(jī)分成兩組（手術(shù)后3 d組及7 d組），每一組再分成三個(gè)亞組（n=9）：（1）假手術(shù)組（Sham 3和Sham 7）；（2）腦缺血再灌注損傷組（I/R injury 3和I/R injury 7）；（3）三七通舒膠囊治療組（PTS+I/R injury 3和PTS+I/R injury 7）。給藥：將三七通舒膠囊與生理鹽水混合成懸濁液，配比為166 mg∶1 mL，新鮮配置。三七通舒膠囊治療組大鼠術(shù)后每天灌胃給藥劑量為4 mL/kg。同時(shí)相同體積的生理鹽水作為空白對(duì)照給予假手術(shù)組和腦缺血再灌注損傷組大鼠。第一次給藥時(shí)間為造模成功后即刻，最后一次給藥時(shí)間為實(shí)驗(yàn)終止（處死）前6 h[15]。

1.3 局部腦缺血再灌注損傷造模

大鼠局部腦缺血模型采用線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈（MCAO）。方法：將大鼠用3%戊巴比妥鈉腹膜下注射麻醉（40 mg/kg）后，經(jīng)大鼠頸中間切口，依次鈍性分離右頸總動(dòng)脈，頸外動(dòng)脈及頸內(nèi)動(dòng)脈。離斷頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端。將線栓（生產(chǎn)廠家：廣州佳靈生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：L3600）從離斷的頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端緩慢插入頸內(nèi)動(dòng)脈，直至感到阻力停止插入（此時(shí)預(yù)示線栓已抵達(dá)大腦中動(dòng)脈近端)。放置線栓2 h，完成腦缺血造模。2 h后移除大鼠腦內(nèi)線栓。假手術(shù)組大鼠需完成除線栓插入外以上所有步驟。大鼠麻醉蘇醒后需立即采用Zea-Longa法評(píng)估神經(jīng)功能[16]。大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分在2～3分時(shí)，被認(rèn)為造模成功，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

使用大鼠改良的神經(jīng)功能評(píng)分（modified neurological severity score,mNSS）法對(duì)各組大鼠造模前及造模后每天同一時(shí)間（0～7 d）進(jìn)行雙盲評(píng)分[17]，且評(píng)分人員不參與本研究其他部分。神經(jīng)功能缺損程度從0～18分進(jìn)行標(biāo)識(shí)（0分為正常，18分為最嚴(yán)重）。每增加一分代表實(shí)驗(yàn)不成功或?qū)嶒?yàn)中神經(jīng)功能的低反應(yīng)性。

1.5 相對(duì)腦梗死體積檢測(cè)

每組大鼠終止實(shí)驗(yàn)（處死）后，即刻取出大腦并迅速置于-80℃冰箱冰凍15分鐘。隨后將新鮮冷凍大腦冠狀位切成6片約2 mm厚的薄片。將切片至于1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenylterazolium chloride，TTC）（生產(chǎn)廠家：Sigma-Aldrich；批號(hào)：T8877）中37℃孵育20分鐘染色，取出后至于4%多聚甲醛（生產(chǎn)廠家：上海生工生物工程股份有限公司；批號(hào)：A500684-0500）中固定過夜。第2天將切片取出排序并拍照。梗死部分的腦組織因無法染色呈現(xiàn)白色。使用Image J（美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）軟件對(duì)切片照片進(jìn)行分析。為了規(guī)避梗死組織腦水腫對(duì)于腦體積的影響，我們采用相對(duì)腦梗死體積百分比（I%）來表示梗死范圍。計(jì)算公式為：I%=（左側(cè)腦切片體積-右側(cè)腦切片正常部分體積）/左側(cè)腦切片體積×100%。

1.6 免疫熒光

每組大鼠終止實(shí)驗(yàn)（處死）前進(jìn)行深度麻醉后經(jīng)心臟依次灌注150 mL生理鹽水和4%多聚甲醛60 mL。灌注成功后迅速斷頭取腦，將大鼠腦組織至于4%多聚甲醛中固定過夜。將固定后的腦組織置于梯度蔗糖溶液中脫水處理。之后用O.C.T（opti-mum cutting temperature compound，OCT）包埋劑（生產(chǎn)廠家：SAKURA Tissue-Tek；批號(hào)：4583）將脫水腦組織進(jìn)行包埋處理。將包埋后的腦組織置于冰凍切片機(jī)（美國(guó)Leica公司）中冠狀位切片（8 μm），用5% BSA（生產(chǎn)廠家：上海生工生物工程股份有限公司；批號(hào)：E661003）封閉10分鐘，PBS（生產(chǎn)廠家：上海生工生物工程股份有限公司，批號(hào)：E607008）沖洗1遍，滴加一抗：TRPC6多克隆抗體（生產(chǎn)廠家：Millipore；批號(hào)：AB5574）1：100和NeuN單克隆抗體（生產(chǎn)廠家：Millipore；批號(hào)：MAB377）1:200放入濕盒內(nèi)4℃封閉過夜，PBS沖洗后滴加二抗：Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（生產(chǎn)廠家：ThermoFisher Scientific；批號(hào)：A-10680）1:500和Texas Red-X 山羊抗鼠IgG（生產(chǎn)廠家：ThermoFisher Scientific；批號(hào)：T-862）1:500，室溫孵育1小時(shí)。待腦片干燥后加入熒光抗淬滅封片液封片。使用倒置熒光顯微鏡（美國(guó)ZEISS公司）觀察，Nikon E800相機(jī)拍片。

1.7 Western Blot檢測(cè)腦組織中TRPC6蛋白水平

按照Ashwal方法準(zhǔn)備待測(cè)大鼠腦組織[18]。將大鼠病變側(cè)腦皮質(zhì)置于RIPA裂解液（按1:100加入蛋白酶抑制劑混合物）（生產(chǎn)廠家：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：P0013B）中裂解后放入高速組織研磨儀（雷蒙生物科技）勻漿1分鐘。樣本放置于水平搖床（美國(guó)VWR公司）上在4℃條件下充分裂解過夜后置于離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）內(nèi)，1 3500 r/分鐘，4℃離心15分鐘。小心留取上清液，并使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（生產(chǎn)廠家：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：P0012S）測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣本經(jīng)聚丙烯凝膠電泳后用PVDF膜（生產(chǎn)廠家：Millipore）進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將膜置于TRPC6抗體（生產(chǎn)廠家：美國(guó)Signalway Antibody公司；批號(hào)：24445）1：1000及α-tubulin（生產(chǎn)廠家：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：AT819）1:1 000抗體中4℃孵育過夜后分別置于事先配好的辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（生產(chǎn)廠家：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：A0208）1:5 000及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠IgG抗體（生產(chǎn)廠家：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；批號(hào)：A0192）1:10 000中。最后使用ChemiDocXRS+Chemiluminescence圖像系統(tǒng)（Bio-Rad）檢測(cè)樣本中標(biāo)記的蛋白，并使用Image Labimage Acquisition and Analysis軟件分析各條帶的灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)都用GraphPad Prism 5（美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并以（±s）表示。mNSS使用雙因素方差分析和Bonferroni correction進(jìn)行后處理。其余組間比較均使用單因素方差分析和Tukey's post hoc test進(jìn)行后處理。P＜0.05則差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三七通舒膠囊治療對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能缺損程度的作用

首先使用mNSS評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估大鼠術(shù)前（0 d）及術(shù)后每天（1～7 d）的神經(jīng)功能，如圖2所示。隨著術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)，與腦缺血再灌注損傷組（I/R injury）相比，三七通舒膠囊治療組（PTS+I/R injury）的神經(jīng)功能評(píng)分下降幅度更大，二者評(píng)分在術(shù)后第4天開始呈現(xiàn)顯著差異，第7天最為顯著。說明三七通舒膠囊治療組的大鼠神經(jīng)功能缺損程度降低，且距離術(shù)后時(shí)間越長(zhǎng)相較越顯著。

圖2 模型大鼠的mNSS評(píng)分結(jié)果（n=9）

2.2 三七通舒膠囊治療對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠相對(duì)腦梗死體積的影響

術(shù)后3 d和術(shù)后7 d模型大鼠的大腦切片TTC染色結(jié)果如圖3 A和B所示。與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注損傷組和三七通舒膠囊治療組的相對(duì)腦梗死體積均顯著增加。而無論術(shù)后3 d還是7 d，三七通舒膠囊治療組大鼠的相對(duì)腦梗死體積均較腦缺血再灌注損傷組顯著減少。

圖3 術(shù)后3 d（A）和7 d（B）模型大鼠的相對(duì)腦梗死體積（n=3）

2.3 三七通舒膠囊治療對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠皮層神經(jīng)元中TRPC6的表達(dá)水平的調(diào)控

術(shù)后3 d和7 d大鼠病變區(qū)域神經(jīng)元中TRPC6表達(dá)的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果見圖4A和B：與假手術(shù)組相比，腦缺血再灌注損傷組及三七通舒膠囊治療組的病變區(qū)域神經(jīng)元中TRPC6的表達(dá)均顯著減少；術(shù)后第7天時(shí)三七通舒膠囊治療組的神經(jīng)元中TRPC6的表達(dá)量較腦缺血再灌注損傷組顯著增加（圖4B），而術(shù)后第3天時(shí)二者并無顯著差異（圖4A）。免疫印跡檢測(cè)結(jié)果如圖4C和D所示：在術(shù)后第7天，三七通舒膠囊治療組病變側(cè)腦組織中的TRPC6蛋白水平較腦缺血再灌注損傷組顯著增加（圖4D），而術(shù)后第3天二者并無顯著差異（圖4C）。因此，我們認(rèn)為三七通舒膠囊治療可以提高腦缺血再灌注損傷大鼠皮層神經(jīng)元中TRPC6的表達(dá)。

圖4 模型大鼠皮層神經(jīng)元中TRPC6的表達(dá)水平

3 討論

缺血再灌注損傷是缺血性腦卒中病理生理過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，針對(duì)這一過程是缺血性腦卒中治療措施研究中的焦點(diǎn)。我們的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明三七通舒膠囊治療大鼠腦缺血再灌注損傷可以顯著改善神經(jīng)功能，特別是缺血再灌注損傷3 d以后。相對(duì)應(yīng)的，我們同時(shí)也發(fā)現(xiàn)三七通舒膠囊治療的大鼠在腦缺血再灌注損傷3 d和7 d后，相對(duì)梗死體積均較腦缺血再灌注損傷組減少，這與神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)果相互印證，說明三七通舒膠囊治療可以降低大鼠腦缺再灌注引起的神經(jīng)功能損傷。隨后，我們通過實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討了其作用的可能機(jī)制。在大鼠腦切片的免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷7 d后，三七通舒膠囊治療組大鼠腦梗死區(qū)神經(jīng)元的TRPC6蛋白表達(dá)較腦缺血再灌注損傷組明顯增加，而Western Blot結(jié)果也表明，在術(shù)后第7天，三七通舒膠囊治療組梗死區(qū)腦組織中的TRPC6蛋白水平較腦缺血再灌注損傷組顯著增加。因此，我們認(rèn)為三七通舒膠囊可能的作用機(jī)制之一是通過提高腦缺血再灌注損傷神經(jīng)元中TRPC6的表達(dá)，從而提高機(jī)體對(duì)腦缺血的耐受程度。

綜上所述，我們的結(jié)果證明了三七通舒膠囊可以降低大鼠腦缺再灌注損傷，并探究了其中可能的機(jī)制之一是三七通舒膠囊可以通過提高缺血再灌注損傷神經(jīng)元中的TRPC6表達(dá)水平，從而起到保護(hù)神經(jīng)元的作用。這將為三七通舒膠囊在臨床治療缺血性腦卒中提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。