董春龍 黃顏青 鄧春紅

肺癌是目前世界各國(guó)癌癥發(fā)病率和死亡率均較高的惡性腫瘤，排列在前三位甚至首位，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）在肺癌中占比高達(dá)85%[1]。傳統(tǒng)的化療及放療手段由于缺乏特異性，僅獲取的短期療效，同時(shí)亦給患者帶來(lái)較大的副作用，且研究[2]發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)治療非小細(xì)胞肺癌的5年生存率低于20%。近年來(lái)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）日漸成為NSCLC的一種新型治療靶點(diǎn)。EGFR基因檢測(cè)包含4個(gè)外顯子（18、19、20、21），當(dāng)其中任一個(gè)發(fā)生突變，均可應(yīng)用EGFR受體抑制劑即酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療[3]。本研究旨在探討NSCLC患者的EGFR基因情況，并分析其與NSCLC患者的臨床病因的關(guān)系，以明確靶向治療的臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取茂名市中醫(yī)院病理科2012年1月—2018年6月期間經(jīng)肺穿刺及外科手術(shù)切除的50例非小細(xì)胞肺癌患者作為研究對(duì)象，所有標(biāo)本穿刺或切除前均未進(jìn)行放療、化療。50例患者中男29例，女21例，年齡34～79歲，平均年齡（61.9±14.5）歲，吸煙18例，TNM分 期（tumor node metastasis classification），Ⅰ期14例，Ⅱ期8例，Ⅲ期24例，Ⅳ期4例，病理類型：腺癌40例，鱗癌8例，肉瘤樣癌2例。50份標(biāo)本均為合格標(biāo)本，患者標(biāo)本采集前均未接受化療、放療或其他抗癌治療。

1.2 EGFR基因突變檢測(cè)

1.2.1 石蠟標(biāo)本的采集 經(jīng)病理證實(shí)腫瘤細(xì)胞含量≥10%，使用一次性刀片連續(xù)切取石蠟包埋組織5 μm厚，共8～10張，使用二甲苯脫蠟、無(wú)水乙醇置換二甲苯、金屬浴40℃，10 min蒸干無(wú)水乙醇。

1.2.2 細(xì)胞學(xué)DNA提取 將石蠟標(biāo)本8～10片置入1.5 mL的Ep PendorF管中，添加適量的二甲苯脫蠟處理，后加入乙醇清洗脫二甲苯，30℃～40℃溫度下晾干，直至乙醇揮發(fā)完全，后添加30 μL的蛋白酶及180 μL的Buffer ATL震蕩混合均勻后過(guò)夜，直至樣本完全裂解，采用QIAamp DNA試劑盒提取細(xì)胞學(xué)DNA，具體操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說(shuō)明書。將獲取的目標(biāo)DNA在紫外光分光光度計(jì)下進(jìn)行DNA濃度及純度的檢測(cè)，保證DNA濃度在100～1 500 ng/μL，-20℃～4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 EGFR基因突變檢測(cè) 采用應(yīng)用ARMS法檢測(cè)非小細(xì)胞肺癌的EGFR基因突變情況。試劑盒為人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒（上海源奇公司研發(fā)），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），檢測(cè)EGFR基因的18～21號(hào)外顯子的突變情況。詳細(xì)操作步驟嚴(yán)格執(zhí)行試劑盒說(shuō)明書。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，計(jì)量資料采用（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因檢測(cè)結(jié)果

50例非小細(xì)胞肺癌患者均采用ARMS檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示共28例非小細(xì)胞肺癌出現(xiàn)外顯子18～21基因突變（其中1例患者出現(xiàn)外顯子19及外顯子21雙位點(diǎn)突變），外顯子18基因突變率為4.0%（2/50），外顯子19基因突變率為22.0%（11/50），外顯子20基因突變率為8.0%（4/50），外顯子21基因突變率為24.0%（12/50）,總突變率56.0%（28/50）。詳見(jiàn)表1。

表1 50例NSCLC EGFR基因檢測(cè)分析

2.2 基因突變與臨床病理的關(guān)系

不同年齡、TNM分期患者的基因突變率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05；女性EGFR基因突變率顯著高于男性，非吸煙人群EGFR基因突變率顯著高于吸煙人群。腺癌EGFR基因突變率顯著高于鱗癌，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移EGFR基因突變率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P＜0.05。詳見(jiàn)表2。

表2 EGFR基因突變與臨床病例特征的關(guān)系[例（%）]

3 討論

肺癌常見(jiàn)的基因突變包括EGFR、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）基 因 和kirsten大 鼠 肉 瘤（kirsten rat sarcoma，KRAS）基因等，可出現(xiàn)突變共存的狀態(tài)，最常見(jiàn)的是EGFR突變及ALK融合突變[4]，鑒于檢測(cè)的經(jīng)濟(jì)性，往往首先檢測(cè)EGFR，必要時(shí)行多種基因突變檢測(cè)。其中EGFR共包含有28個(gè)外顯子，其中18、19、20、21四個(gè)外顯示子的突變是最有代表意義的，從而作為鞘向藥物EGFR受體抑制劑即酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的用藥依據(jù)。Maemondo M等[5]的研究發(fā)現(xiàn)對(duì)EGFR表現(xiàn)敏感的NSCLC患者經(jīng)EGFR抑制劑治療后的無(wú)瘤進(jìn)展期要顯著高于采用放療治療手段。2011年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（national comprehensive cancer network，NCCN）指南對(duì)非小細(xì)胞肺癌治療強(qiáng)調(diào)，對(duì)于復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者的選擇一線治療方案前，必須進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)[6]。我國(guó)華西醫(yī)學(xué)研究表明，EGFR陽(yáng)性相較于陰性或未知的有明顯改善的5年生存率[2]，該研究同時(shí)表明，EGFR狀態(tài)未知甚至陰性的患者很難從鞘向治療中獲益。

ARMS法是一種非小細(xì)胞肺癌患者EGFR基因檢測(cè)敏感度高的方法之一[7]?；驒z測(cè)除了ARMS法外，尚有更先進(jìn)的二代測(cè)序基因檢測(cè)，但需要更專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和設(shè)備，多在國(guó)家級(jí)、省級(jí)醫(yī)院或第三方機(jī)構(gòu)應(yīng)用，本研究采用ARMS法如上方法所述，可適用地市級(jí)醫(yī)院。檢測(cè)結(jié)果顯示共28例非小細(xì)胞肺癌出現(xiàn)外顯子18～21基因突變（其中1例患者出現(xiàn)外顯子19及外顯子21雙位點(diǎn)突變），外顯子18基因突變率為4.0%（2/50），外顯子19基因突變率為22.0%（11/50），外顯子20基因突變率為8.0%（4/50），外顯子21基因突變率為24.0%（12/50）。提示非小細(xì)胞肺癌患者的基因突變點(diǎn)位主要集中在外顯子19及21，總計(jì)占比46.0%（23/50），外顯子18及20所占的比例較小，總計(jì)為12.0%（6/50）。雙位點(diǎn)突變出現(xiàn)了1例，為外顯子19+21，其他研究亦見(jiàn)其他雙位點(diǎn)突變，但為散發(fā)病例，所占比例不高[8]。雙位點(diǎn)突變多發(fā)于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和以乳頭狀生長(zhǎng)方式為主的肺腺癌中[9]。根據(jù)最新世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的肺腺癌生長(zhǎng)方式，本研究尚未能對(duì)貼壁樣、腺泡狀、乳頭狀、微乳頭狀及實(shí)性這五種生長(zhǎng)方式各自的EGFR突變情況加以分析。

本研究旨在進(jìn)一步探究EGFR基因突變與臨床病理之間的意義?；颊叩哪挲g、TNM分期基因突變率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。但關(guān)于臨床病理分期與EGFR基因突變發(fā)生率的研究非常值得深究，國(guó)內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)[8]，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期患者的EGFR突變陽(yáng)性率高于TNM分期Ⅰ～Ⅱ期非小細(xì)胞肺癌患者，本組的研究顯示前者亦略高于后者，雖差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍提示高分期的非小細(xì)胞肺癌患者存在較高的EGFR突變率。癌癥的組織類型與EGFR突變有一定的關(guān)系，非小細(xì)胞肺癌包括腺癌、鱗癌、腺鱗癌、肉瘤樣癌、涎腺樣癌、大細(xì)胞癌等，以上數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)腺癌EGFR基因突變率顯著高于鱗癌[10]，一項(xiàng)大樣本的臨床研究[11]發(fā)現(xiàn)，超過(guò)1/3的腺癌患者再采用EGFR TKI治療后，疾病獲得了有效控制，以上腺癌的突變比例與本研究的基本符合，盡管鞘向治療不是萬(wàn)能，但聯(lián)合傳統(tǒng)治療一定可能讓患者獲益匪淺，應(yīng)更深入研究以提供充足的鞘向治療依據(jù)，本次研究例數(shù)偏少，如條件許可下一步可收集更多病例進(jìn)行研究。

本研究發(fā)現(xiàn)女性患者EGFR基因突變率高于男性患者，P＜0.05，提示非小細(xì)胞肺癌的EGFR突變率與性別有關(guān)，推測(cè)原因可能與雌性激素的表達(dá)有關(guān)，對(duì)比研究表明EGFR突變多發(fā)于女性、無(wú)吸煙史人群，而KRAS突變好發(fā)于男性、有吸煙史的人群，尚無(wú)同時(shí)檢測(cè)出EGFR和KRAS基因突變的病例出現(xiàn)[12]。本組研究中非吸煙人群的基因突變率為64.9%，顯著高于吸煙人群30.8%，亦與上述研究相符。另外，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移EGFR基因突變率顯著高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，P＜0.05。EGFR突變?cè)谠l(fā)腫瘤及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中可見(jiàn)，且伴有淋巴轉(zhuǎn)移的非小細(xì)胞肺癌患者往往出現(xiàn)較高的EGFR陽(yáng)性率[13]，提示在肺穿刺活檢困難時(shí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶可行EGFR基因檢測(cè)。

綜上所述，EGFR基因突變以19及21外顯子突變?yōu)橹?，其中在女性、腺癌、非吸煙、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移人群中EGFR表達(dá)陽(yáng)性率較高，而在年齡、TNM分期上未見(jiàn)有明顯的相關(guān)性，但可能影響非小細(xì)胞肺癌患者的預(yù)后。伴有EGFR基因突變的患者對(duì)TKI治療敏感度較高，通過(guò)EGFR檢測(cè)可為鞘向藥物治療提供有力的依據(jù)，因而對(duì)EGFR常規(guī)的18、19、20、21四個(gè)外顯子的突變檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)臨床治療方案有重要的意義。