◎ 施慧君,吳韻瑤,袁筱怡,吳小玲,鐘小紅
(廣東省食品安全學(xué)會(huì),廣東 廣州 510100)
靈芝,是多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體,三萜類化合物是靈芝的主要化學(xué)成分之一。靈芝孢子粉是靈芝在生長(zhǎng)發(fā)育后期從靈芝菌褶中噴射出來(lái)的極其微小的卵形生殖細(xì)胞,能夠?qū)㈧`芝的遺傳物質(zhì)全部保留下來(lái)。靈芝孢子內(nèi)含有靈芝子實(shí)體幾乎所有的活性物質(zhì),包含多糖類、三萜類、蛋白質(zhì)、甾醇類、核苷類、微量元素等,且部分活性物質(zhì)如總?cè)?、總多糖含量明顯高于靈芝子實(shí)體,同時(shí)在抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等方面表現(xiàn)出更加明顯的效果,因此靈芝孢子粉已成為當(dāng)前研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn),成為保健品市場(chǎng)上最受消費(fèi)者青睞的產(chǎn)品之一[1-2]???cè)莆镔|(zhì)的檢測(cè)多以熊果酸或齊墩果酸為對(duì)照品,采用分光光度法,應(yīng)用香草醛-高氯酸顯色法,測(cè)定其含量[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以破壁靈芝孢子粉為樣品,參照《中國(guó)藥典》三萜及甾醇檢測(cè)方法[5],進(jìn)行線性關(guān)系、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率的驗(yàn)證,確定一種應(yīng)用于靈芝孢子粉三萜及甾醇含量的簡(jiǎn)便、快速、科學(xué)的檢測(cè)方法。
分析天平:PTX-FA1004型,美國(guó)康州HZ電子科技有限公司;單孔水浴鍋:HH-2K1型,河南鞏義予華儀器有限公司;數(shù)控超聲波清洗器:KQ2200DE型,昆山市超聲儀器有限公司;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):UV-2600型,島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司。
齊墩果酸(91.7%,20 mg,中國(guó)食品藥品檢定研究院);乙醇;高氯酸;冰醋酸;香草醛;乙酸乙酯;甲醇(除非另有說(shuō)明,本方法所用試劑均為分析純)。
取齊墩果酸對(duì)照品10.00 mg至50 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成濃度為0.1834 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
精密量取對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、 0.4 mL、0.5 mL,分別置于15 mL具塞試管中,揮干,放冷,精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液(精密稱取香草醛0.5 g,加冰醋酸使溶解成10 mL,即得)0.2 mL,高氯酸0.8 mL,搖勻,在70 ℃水浴中加熱15 min,立即置冰浴中冷卻5 min,取出,精密加入乙酸乙酯 4 mL,搖勻,以相應(yīng)的試劑為空白,通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法(《中華人民共和國(guó)藥典2015年版 四部》通則0401)在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.4.2 供試品溶液的制備
取本品粉末約2 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,加乙醇50 mL,超聲處理(功率100 W,頻率 40 kHz)45 min,濾過(guò),濾液置于100 mL量瓶中,用適量乙醇,分次洗滌濾器和濾渣,濾液并入同一量瓶中,加乙醇至刻度,搖勻,即得。
1.4.3 供試品的測(cè)定
精密量取供試品溶液0.1 mL,置15 mL具塞試管中,照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法,自“揮干”起,同法操作,測(cè)定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量,計(jì)算,即得。
1.4.4 分析結(jié)果計(jì)算
按下式計(jì)算試樣中三萜及甾醇的含量:
式中:X為樣品的三萜及甾醇含量,g/100 g;A為樣品測(cè)定的吸光度值;b為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距;n為稀釋倍數(shù);a為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率;m為樣品稱樣量,g;V為樣品的測(cè)定體積,mL;100、1000為換算系數(shù)。
本方法利用三萜及甾醇在強(qiáng)氧化性酸高氯酸的存在下,氧化脫氫形成雙鍵再與反應(yīng)體系中的香草醛縮合顯色,用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值。
取齊墩果酸對(duì)照品溶液,依次精確移取0.1 mL、 0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于具塞試管中,揮干,依照“1.4”方法步驟測(cè)定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),齊墩果酸對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo),得線性回歸方程為y=7.54560x-0.01161,相關(guān)系數(shù)R2=0.99954,表明本方法在0.01834~0.09170 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,如圖1所示。
圖1 齊墩果酸線性圖
取齊墩果酸對(duì)照品溶液和待測(cè)樣品溶液,照上述“1.4”方法,分別在顯色完成后0 min、10 min、 20 min、30 min、45 min和60 min讀取吸光度值,結(jié)果表明,顯色后在1 h內(nèi)測(cè)得對(duì)照品溶液、供試品溶液吸光度值的RSD值小于2%,表明該方法1 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性好。結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 對(duì)照品和供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表
取一批樣品,照上述“1.4”方法,制備6份供試液,測(cè)定三萜及甾醇含量,測(cè)定其含量值范圍為3.66%~3.85%,均值為3.76%,RSD為1.9%。結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表
精確稱取6份已知含量的樣品1.0 g,同時(shí)分別加入對(duì)照品,按上述測(cè)定方法,測(cè)定加標(biāo)后吸光度值,計(jì)算回收率為95.52%~101.29%,均值為98.55%,RSD為2.5%。結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)表
香草醛-冰氯酸、高氯酸比色法是測(cè)定靈芝孢子粉中總?cè)祁惢衔锍S玫姆椒?,但其影響因素也較多。本實(shí)驗(yàn)在嚴(yán)格控制反應(yīng)條件下,結(jié)果穩(wěn)定,重現(xiàn)性好,適用于破壁靈芝孢子粉中三萜及甾醇含量的測(cè)定。