◎ 施慧君，吳韻瑤，袁筱怡，吳小玲，鐘小紅

（廣東省食品安全學(xué)會(huì)，廣東 廣州 510100）

靈芝，是多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體，三萜類化合物是靈芝的主要化學(xué)成分之一。靈芝孢子粉是靈芝在生長(zhǎng)發(fā)育后期從靈芝菌褶中噴射出來(lái)的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，能夠?qū)㈧`芝的遺傳物質(zhì)全部保留下來(lái)。靈芝孢子內(nèi)含有靈芝子實(shí)體幾乎所有的活性物質(zhì)，包含多糖類、三萜類、蛋白質(zhì)、甾醇類、核苷類、微量元素等，且部分活性物質(zhì)如總?cè)?、總多糖含量明顯高于靈芝子實(shí)體，同時(shí)在抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等方面表現(xiàn)出更加明顯的效果，因此靈芝孢子粉已成為當(dāng)前研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，成為保健品市場(chǎng)上最受消費(fèi)者青睞的產(chǎn)品之一[1-2]?？?cè)莆镔|(zhì)的檢測(cè)多以熊果酸或齊墩果酸為對(duì)照品，采用分光光度法，應(yīng)用香草醛-高氯酸顯色法，測(cè)定其含量[3-4]。本實(shí)驗(yàn)以破壁靈芝孢子粉為樣品，參照《中國(guó)藥典》三萜及甾醇檢測(cè)方法[5]，進(jìn)行線性關(guān)系、穩(wěn)定性、重復(fù)性、回收率的驗(yàn)證，確定一種應(yīng)用于靈芝孢子粉三萜及甾醇含量的簡(jiǎn)便、快速、科學(xué)的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

分析天平：PTX-FA1004型，美國(guó)康州HZ電子科技有限公司；單孔水浴鍋：HH-2K1型，河南鞏義予華儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器：KQ2200DE型，昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-2600型，島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司。

1.2 試劑

齊墩果酸（91.7%，20 mg，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙醇；高氯酸；冰醋酸；香草醛；乙酸乙酯；甲醇（除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取齊墩果酸對(duì)照品10.00 mg至50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成濃度為0.1834 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、 0.4 mL、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的5%香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得）0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，在70 ℃水浴中加熱15 min，立即置冰浴中冷卻5 min，取出，精密加入乙酸乙酯 4 mL，搖勻，以相應(yīng)的試劑為空白，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法（《中華人民共和國(guó)藥典2015年版 四部》通則0401）在546 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 mL，超聲處理（功率100 W，頻率 40 kHz）45 min，濾過(guò)，濾液置于100 mL量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，濾液并入同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

1.4.3 供試品的測(cè)定

精密量取供試品溶液0.1 mL，置15 mL具塞試管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“揮干”起，同法操作，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計(jì)算，即得。

1.4.4 分析結(jié)果計(jì)算

按下式計(jì)算試樣中三萜及甾醇的含量：

式中：X為樣品的三萜及甾醇含量，g/100 g；A為樣品測(cè)定的吸光度值；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的截距；n為稀釋倍數(shù)；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的斜率；m為樣品稱樣量，g；V為樣品的測(cè)定體積，mL；100、1000為換算系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 原理

本方法利用三萜及甾醇在強(qiáng)氧化性酸高氯酸的存在下，氧化脫氫形成雙鍵再與反應(yīng)體系中的香草醛縮合顯色，用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值。

2.2 線性試驗(yàn)

取齊墩果酸對(duì)照品溶液，依次精確移取0.1 mL、 0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL于具塞試管中，揮干，依照“1.4”方法步驟測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，齊墩果酸對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸方程為y=7.54560x-0.01161，相關(guān)系數(shù)R2=0.99954，表明本方法在0.01834～0.09170 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，如圖1所示。

圖1 齊墩果酸線性圖

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取齊墩果酸對(duì)照品溶液和待測(cè)樣品溶液，照上述“1.4”方法，分別在顯色完成后0 min、10 min、 20 min、30 min、45 min和60 min讀取吸光度值，結(jié)果表明，顯色后在1 h內(nèi)測(cè)得對(duì)照品溶液、供試品溶液吸光度值的RSD值小于2%，表明該方法1 h內(nèi)測(cè)定穩(wěn)定性好。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 對(duì)照品和供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取一批樣品，照上述“1.4”方法，制備6份供試液，測(cè)定三萜及甾醇含量，測(cè)定其含量值范圍為3.66%～3.85%，均值為3.76%，RSD為1.9%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

2.5 回收率試驗(yàn)

精確稱取6份已知含量的樣品1.0 g，同時(shí)分別加入對(duì)照品，按上述測(cè)定方法，測(cè)定加標(biāo)后吸光度值，計(jì)算回收率為95.52%～101.29%，均值為98.55%，RSD為2.5%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)表

3 結(jié)論

香草醛-冰氯酸、高氯酸比色法是測(cè)定靈芝孢子粉中總?cè)祁惢衔锍Ｓ玫姆椒?，但其影響因素也較多。本實(shí)驗(yàn)在嚴(yán)格控制反應(yīng)條件下，結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，適用于破壁靈芝孢子粉中三萜及甾醇含量的測(cè)定。