◎ 劉賢釗，陳炎歡，羅蘭芳，覃日金，李美珍

（無限極（中國）有限公司，廣東 江門 529100）

余甘子是大戟科植物余甘子（Phyllanthus emblicaL.） 的干燥成熟果實[1]，是一種藥食同源的果實。余甘子提取物（Phyllanthus emblicaExtract）是以余甘子為原料，經(jīng)水提取、過濾、濃縮、干燥等工序制成的提取物[2]。余甘子提取物在我國主要作為膳食補(bǔ)充劑，廣泛用于食品、保健食品行業(yè)。余甘子提取物中含有沒食子酸、鞣花酸等成分[3-5]，現(xiàn)代藥理研究表明，余甘子提取物具有提高免疫力[6]、抗氧化[7]、輔助保護(hù)肝損傷[8-9]等作用。目前，在國內(nèi)外均未有余甘子提取物的官方質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，僅有余甘子生品及鹽制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一些初步研究[10]。由于余甘子提取物的質(zhì)量指標(biāo)沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)可遵循，其質(zhì)量要求差異大，產(chǎn)品質(zhì)量無法保證，不利于行業(yè)發(fā)展。本研究對13批不同產(chǎn)地的余甘子提取物進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，初步建立余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其規(guī)范化生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供科學(xué) 依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子提取物由適量余甘子藥材加8倍量水煎煮3次，合并濾液，70 ℃減壓濃縮，經(jīng)噴霧干燥而得。13批余甘子提取物來源于4個廠家，編號1～13。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號149-91-7，批號110831-201906，中國食品藥品檢定研究院，含量以91.5%計）；鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號476-66-4，批號111959-201903，中國食品藥品檢定研究院，含量以88.8%計）；甲醇為色譜純（德國Merck公司）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

HP1200 型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器，美國Agilent公司），KQ-400KDE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 感官測定

取本品嗅其氣味、嘗其滋味；另取試樣適量置于白色瓷盤中觀察其色澤、外觀，并檢查有無異物。觀察發(fā)現(xiàn)13批余甘子提取物為黃棕色至深褐色干燥均勻粉末，色澤均勻，具有余甘子特有的氣味，無異味，無正常視力可見外來異物。

1.3.2 薄層色譜鑒別

（1）對照品溶液配制。分別取5.0 mg沒食子酸溶解于1.0 mL 70%乙醇中，1.0 mg鞣花酸溶解于 50.0 mL70%乙醇中，分別制成0.5 mg·mL-1沒食子酸對照品溶液和0.02 mg·mL-1鞣花酸對照品溶液。

（2）供試品溶液配制。取本品粉末約0.2 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%乙醇30 mL，超聲（250 W，40 kHz）處理30 min，取出放冷，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）薄層色譜測定。分別吸取沒食子酸對照品溶液2 μL，鞣花酸對照品溶液20 μL，供試品溶液2～ 10 μL，點(diǎn)于同一硅膠板上，以二氯甲烷-甲酸-乙酸乙酯-水（7∶2.5∶2∶0.5，體積比）的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，在100～105 ℃下加熱至斑點(diǎn)或條帶顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，應(yīng)顯相同的熒光斑點(diǎn)。

1.3.3 理化指標(biāo)測定

水分按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）的第一法進(jìn)行測定。灰分按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行測定。粒度按照《中華人民共和國藥典（2020版）》第四部通則中“粒度和粒度分布測定法”第二法（篩分法）進(jìn)行測定，過100目篩。

1.3.4 沒食子酸的含量測定

（1）對照品溶液制備。精密稱取沒食子酸對照品約3 mg于10 mL的棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即得對照品溶液。

（2）供試品溶液制備。取本品約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲（250 W，40 kHz）提取1 h，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

（3）色譜條件。色譜柱：十八烷基鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：以甲醇為流動相A，以0.2%磷酸溶液為流動相B，按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；波長273 nm；柱溫30 ℃；流速 1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按沒食子酸計不低于5000。

表1 梯度洗脫條件表

（4）線性關(guān)系考察。精密稱取沒食子酸對照品18.842 mg置25 mL容量瓶中，按1.3.4中（1）項下制備方法加50%甲醇溶解制成儲備液，再精密吸取該儲備液1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL和10.0 mL分別至10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，按1.3.4中（3）項下色譜條件分析，測定峰面積。

（5）精密度試驗。精密稱取1.3.4中（1）項下制備的沒食子酸對照品溶液（濃度0.2737 mg·mL-1），重復(fù)進(jìn)樣6次。

（6）穩(wěn)定性試驗。精密稱取余甘子提取物（批號20191202/12591）按1.3.4中（2）項下制備的供試品溶液，按1.3.4中（3）項下色譜條件分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h測定。

（7）重復(fù)性試驗。精密稱取余甘子提取物（批號20191202/12591）同一天內(nèi)按1.3.4（2）項下制備的6份供試品溶液，按1.3.4中（3）項下色譜條件測定。

（8）回收率試驗。精密稱取余甘子提取物（批號20191202/12591，沒食子酸含量為9.75%）精密稱定約0.1 g于9個具塞錐形瓶中。另取沒食子酸對照品（純度90.8%）112.26 mg置50 mL棕色容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容（此對照品溶液含沒食子酸 2.0386 mg·mL-1），分別吸取該對照品溶液2.5 mL（以沒食子酸計5.0966 mg）、5.0 mL（以沒食子酸計10.1932 mg）、7.5 mL（以沒食子酸計15.2898 mg），分3組加入含樣品的9個具塞錐形瓶中，按1.3.4中（2）項下制成供回收率測定用供試品溶液，按1.3.4中（3）項下色譜條件測定，計算沒食子酸的回收率。

（9）樣品含量測定。分別精密吸取對照品溶液和供試品溶各10 μL，注入液相色譜儀，測定。根據(jù)所得對照品溶液和供試品溶液色譜圖中沒食子酸峰面積計算供試品中待測組分沒食子酸含量。

1.3.5 重金屬指標(biāo)測定

重金屬指標(biāo)按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中多元素的測定》（GB 5009.268—2016）第一法電感耦合等離子質(zhì)譜法（ICP-MS）規(guī)定的方法測定鉛、砷、鎘、汞含量。

1.3.6 微生物檢查

菌落總數(shù)的測定按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》（GB 4789.2—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行；霉菌和酵母的測定按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行；大腸埃希氏菌的測定按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 霉菌和酵母計數(shù)》（GB 4789.15—2016）檢驗大腸埃希氏菌計數(shù)規(guī)定的方法進(jìn)行。沙門氏菌的測定按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）規(guī)定的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官測定

觀察發(fā)現(xiàn)13批余甘子提取物為黃棕色至深褐色干燥均勻粉末，色澤均勻，具有余甘子特有的氣味，無異味，無正常視力可見外來異物。

2.2 薄層色譜鑒別

S1為沒食子酸；S2為鞣花酸。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的熒光斑點(diǎn)。見圖1。

圖1 余甘子提取物薄層色譜圖

2.3 理化指標(biāo)

余甘子提取物水分、灰分、粒度測定結(jié)果見表2。

表2 余甘子提取物水分、灰分、粒度測定結(jié)果表

2.4 沒食子酸的含量測定

2.4.1 線性關(guān)系考察

按1.3.4（4）操作，以沒食子酸對照品的濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得回歸方程：Y=556.45X-0.121，R2=0.9999。結(jié)果表明沒食子酸在0.0684～0.6843 mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗

按1.3.4（5）操作，分別計算峰面積及保留時間的RSD值，保留時間和峰面積的RSD值均為0.06%。不對稱度以沒食子酸計不高于1.2。理論塔板數(shù)，以沒食子酸計約21000，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗

按1.3.4（6）操作，供試品中沒食子酸峰面積的RSD為0.24%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 重復(fù)性試驗

按1.3.4（7）操作，沒食子酸平均含量為9.75%，RSD為1.00%。分離度大于1.5，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 回收率試驗

按1.3.4（8）操作，沒食子酸平均回收率為98.85%（92%～105%），RSD值為1.63%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。余甘子提取物沒食子酸含量測定結(jié)果見表3。

表3 余甘子提取物沒食子酸含量測定結(jié)果表

2.5 重金屬指標(biāo)

余甘子提取物鉛、砷、鎘、汞測定結(jié)果見表4。

表4 余甘子提取物鉛、砷、鎘、汞測定結(jié)果表（單位：mg·kg-1）

2.6 微生物指標(biāo)

余甘子提取物微生物檢查結(jié)果見表5。

表5 余甘子提取物微生物檢查結(jié)果表

（續(xù)表5）

3 結(jié)論

根據(jù)對13批次的余甘子提取物進(jìn)行感官測定、薄層色譜鑒別、理化指標(biāo)測定、沒食子酸含量測定、微生物檢查和重金屬指標(biāo)測定結(jié)果，結(jié)合食品和藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定原則、相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)品特性、市場要求制定本標(biāo)準(zhǔn)初步制定了余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表6。本研究初步建立的余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高了其質(zhì)量評價的客觀性與專屬性，為進(jìn)一步規(guī)范余甘子提取物生產(chǎn)、銷售行業(yè)提供科學(xué) 依據(jù)。

表6 余甘子提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)表