◎ 關(guān)仁梅，羅 強，生龍娜雍，羅 璠

（西南民族大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

藏區(qū)當(dāng)?shù)氐哪撩袷来赜脗鹘y(tǒng)而古老的自然發(fā)酵方法制作酸奶，牦牛乳中含有豐富的微生物群落[1-2]。目前牦牛乳資源未得到合理的開發(fā)利用，關(guān)于優(yōu)勢菌株的開發(fā)研究較少。本試驗通過對從西藏地區(qū)的自然發(fā)酵牦牛乳所分離的植物乳桿菌11進行益生性實驗，包括產(chǎn)酸、抑菌能力以及模擬人體腸道耐受能力、膽鹽耐受性、抗氧化能力實驗，希望為其作為益生菌應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物乳桿菌11，分離自自然發(fā)酵牦牛乳；大腸桿菌ATCC8099、金黃色葡萄球菌ATCC25923作為指示菌株及質(zhì)控菌株，購自中國科學(xué)院微生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 植物乳桿菌無細胞發(fā)酵上清液（CFS）的制備

取保藏菌株于MRS液體培養(yǎng)基30 ℃恒溫培養(yǎng) 48 h，8000 r·min-1離心10 min，上清液在80 ℃下水浴10 min，使用1 mol·L-1NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=6.0排除酸干擾，用0.22 μm濾膜過濾獲得乳酸菌CFS[3]。

1.2.2 指示菌懸浮液的制備

將2株指示菌以1%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，10000 r·min-1離心10 min，去除上清液，用10 mL 0.05 mol·L-1PBS（pH=7.2）緩沖液洗滌2次。用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1×107CFU·mL-1[4]。

1.2.3 產(chǎn)酸曲線的繪制

將植物乳桿菌11以1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，過夜活化，4000 r·min-1離心10 min，去上清液，用無菌生理鹽水洗滌2次，并配置菌懸液，調(diào)節(jié)菌液濃度至OD600=0.5，將菌懸液以5%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基（pH=6.5）中，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別測定2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、18 h和24 h 發(fā)酵液的pH值，繪制變化曲線。

1.2.4 抑菌能力

采用96孔板法測定植物乳桿菌CFS對兩株指示菌的抑制作用。在96孔板中分別加入10 μL指示菌懸浮液和190 μL乳酸菌CFS，30 ℃培養(yǎng)24 h，測定 600 nm處的吸光值OD600，以等量MRS液體培養(yǎng)基替代CFS為對照[5]，抑菌率計算如式（1）所示：

式（1）中：ODLAB表示24 h之后指示菌在乳酸菌CFS中的OD600；ODcontrol表示24 h之后指示菌在MRS液體中的OD600。

1.2.5 模擬人體胃腸道耐受能力

模擬胃腸液參照《中國藥典》[6]中提及的方法，配制人工胃液和腸液。人工胃液：取16.4 mL 1 mol·L-1稀鹽酸于容器中，依次加入800 mL超純水與10 g胃蛋白酶，混勻后在容量瓶中定容到1000 mL，用 0.22 μm濾膜過濾，即得到人工胃液，pH約為2.0。人工腸液：取6.8 g磷酸二氫鉀，用500 mL超純水溶解，用0.1 mol?L-1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=6.8；另取10 g 胰酶，加水適量溶解，將兩液混合后，加水定容到 1000 mL，即得人工腸液。取兩管活化后的植物乳桿菌11菌懸液，10000 r·min-1離心2 min 后棄上清液，用無菌生理鹽水洗滌兩次，在菌體中分別加入10 mL人工胃液和人工腸液，漩渦混勻后于30 ℃，200 r·min-1搖床溫浴，在0 h和3 h分別測定人工胃液處理組的活菌數(shù)量，在0 h和4 h分別測定人工腸液處理組的活菌數(shù)量，菌株存活率計算如式（2）所示：

式（2）中：N1代表經(jīng)過人工胃液或人工腸液處理后細菌數(shù)；N0代表人工胃液（人工腸液）處理前的細菌數(shù)。

1.2.6 膽鹽耐受性

將過夜活化后的實驗菌株菌液調(diào)整為含0.3%牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 h后，使用平板菌落計數(shù)法定量樣品中的菌體數(shù)目。以相同時間的原始菌液作對照，存活率計算如式（3）所示：

式（3）中：N1為處理組的細菌數(shù)（CFU）；N2為對照組的細菌數(shù)（CFU）。

1.2.7 抗氧化能力

使用總抗氧化能力（T-AOC）檢測試劑盒檢測總抗氧化能力。使用DPPH法振蕩[7]測定DPPH自由基清除能力：將150 μL乳酸菌CFS與150 μL甲醇DPPH溶液在96孔酶標混勻，在避光條件下，室溫靜置30 min后，測517 nm處吸光度，記為A2，將150 μL乳酸菌CFS與150 μL 70 %甲醇溶液混勻，記為A3，將150 μL 70%的甲醇溶液與150 μL甲醇DPPH溶液混勻，記為A1，以1 mmol?L-1維生素C為陽性對照。DPPH自由基清除率計算如式（4）所示：

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗均平行3次，數(shù)據(jù)用均值±標準差表示，使用Excel 2010和SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸曲線的繪制

測定發(fā)酵液pH有助于了解植物乳桿菌11的產(chǎn)酸能力，結(jié)果如圖1所示。在0～8 h發(fā)酵液pH快速降低，在8 h之后pH變化較為平緩，最終在24 h時pH穩(wěn)定在3.8左右，結(jié)果表明植物乳桿菌11產(chǎn)酸快，產(chǎn)酸能力強。

圖1 植物乳桿菌11的產(chǎn)酸曲線圖

2.2 抑菌能力分析

以大腸桿菌ATCC8099和金黃色葡萄球菌ATCC25923為指示菌測定了植物乳桿菌11的抑菌能力。植物乳桿菌11發(fā)酵上清液經(jīng)過中和酸、H2O2分解處理后對大腸桿菌的抑菌率分別為（32.96±5.65）%，對金黃色葡萄球菌的抑菌率為（53.15±4.71）%，初步判定植物乳桿菌11對兩株指示菌有一定的抑菌作用。

2.3 模擬人體胃腸道耐受能力分析

對植物乳桿菌11進行模擬胃腸道環(huán)境測定其存活率，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌11在人工胃液（pH=2.0）處理3 h后，存活率為（93.29±2.49）%，在模擬人工腸液（pH=6.8）處理4 h后，存活率為（94.33±11.65）%，試驗結(jié)果表明植物乳桿菌11在腸胃液中有較強的存活能力，為其發(fā)揮益生功能提供基礎(chǔ)。

2.4 膽鹽耐受性分析

植物乳桿菌11在含有0.3%的牛膽酸鹽培養(yǎng)基下培養(yǎng)3 h后，其存活率為（77.25±10.89）%，說明其對膽鹽的耐受性較好。

2.5 抗氧化能力評價

通過DPPH自由基清除率和總抗氧化能力評價了植物乳桿菌11的抗氧化活性，以1 mmol?L-1維生素C和MRS培養(yǎng)基作為參照，植物乳桿菌11的24 h發(fā)酵上清液對DPPH的清除率為（19.36±3.96）%，其總抗氧化能力為（8.2±2.18）U·mL-1，1 mmol?L-1維生素C的總抗氧化能力為（98.55±3.14）U·mL-1，MRS培養(yǎng)基總抗氧化能力為（3.36±1.47）U·mL-1。綜合兩類測定方法，植物乳桿菌11具備一定的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本研究通過產(chǎn)酸能力、抑菌能力、模擬人體腸道耐受能力、抗氧化能力實驗對植物乳桿菌11進行益生性評價。結(jié)果表明：植物乳桿菌11產(chǎn)酸快，對金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果，對人工胃腸液耐受性強，3 h人工胃液存活率為（93.29±2.49）%，4 h人工腸液存活率為（94.33±11.65）%，在0.3%膽鹽濃度培養(yǎng)下存活率為（77.25±10.89）%，其24 h發(fā)酵上清液有一定的抗氧化效果，對DPPH的清除率為（19.36±3.96）%。綜合試驗結(jié)果表明，初步判斷植物乳桿菌11是一株益生性菌株。此研究為植物乳桿菌11進一步開發(fā)與應(yīng)用奠定了理論基礎(chǔ)。