◎ 崔 敏，張曉英，譚 瑋，董紅陽，燕娜娜

（山東省榮成市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 榮成 264300）

喹諾酮類藥物作為一種廣譜抗菌藥物，抗菌活性強(qiáng)。其中恩諾沙星（Enrofloxacin）為合成的第三代氟喹諾酮類藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均有很好的抗菌作用，耐藥率低，口服效果顯著，血藥濃度高且穩(wěn)定，能廣泛分布各組織，其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin），仍有強(qiáng)大抗菌效果，在動(dòng)物飼養(yǎng)、水產(chǎn)養(yǎng)殖和臨床上應(yīng)用非常廣泛[1-2]。然而，由于近些年抗生素的濫用問題，已經(jīng)引起了社會(huì)廣泛關(guān)注。在食用農(nóng)產(chǎn)品安全問題上，美國、歐盟和我國等許多國家已經(jīng)制定了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)喹諾酮類藥物進(jìn)行了殘留量的限定[3]。

雞肉粉作為一種食品配料，廣泛應(yīng)用于調(diào)制湯料、方便營養(yǎng)調(diào)料、鮮味香精、膨化食品等制品的生產(chǎn)[4]，因此雞肉粉中獸藥殘留的監(jiān)管不容忽視。雞肉粉作為質(zhì)控樣品介質(zhì)，將待測(cè)分析物加入其中，常用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的評(píng)估及分析方法的確認(rèn)[5]。本研究參照GB/T 20366—2006、GB/T 21312—2007， SN/T 1751.2—2007、農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告14-2008和農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008[6-10]的檢測(cè)方法，借助三重四極桿液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)雞肉粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的殘留量的檢測(cè)進(jìn)行方法優(yōu)化，綜合各標(biāo)準(zhǔn)方法優(yōu)點(diǎn)建立了一種準(zhǔn)確、快捷、簡(jiǎn)便的測(cè)定方法，能夠準(zhǔn)確測(cè)定恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量，為雞肉粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測(cè)方法提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星-D8為有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（北京壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）；甲醇、乙腈、正己烷（歐普森，色譜純）；鹽酸、氫氧化鈉、甲酸、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉和檸檬酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司），實(shí)驗(yàn)室用水符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級(jí)水。

雞肉粉空白樣品、雞肉粉中恩諾沙星（標(biāo)準(zhǔn)值376 μg·kg-1，擴(kuò)展不確定度53 μg·kg-1，k=2）殘留分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10152（簡(jiǎn)稱ZKE）、雞肉粉中環(huán)丙沙星（標(biāo)準(zhǔn)值456 μg·kg-1，擴(kuò)展不確定度55 μg·kg-1，k=2）殘留分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW10153（簡(jiǎn)稱ZKC）：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：TSQ Quantum Ultra EMR System，美國賽默飛世爾科技公司；電子分析天平：AR224CN，±0.0001 g，上海天平儀器廠；高速冷凍離心機(jī)：CF16RXⅡ，日本日立；渦旋混合器：Vortex I，IKA；氮吹儀：MTN-5800，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；超純水系統(tǒng)：MOL PW500EDI，重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司；C18色譜柱：Hypersil gold（C18）100 mm×2.1 mm 1.9 μm，Thermo；超聲波發(fā)生器：KQ-300TDB，昆山市超聲儀器有限公司；HLB固相萃取柱：6 mL/500 mg，CNW；60 mL注射器：山東新華安得醫(yī)療用品有限公司；固相萃取柱轉(zhuǎn)接頭。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；準(zhǔn)確吸取100 μg·mL-1的恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液和100 μg·mL-1的環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；準(zhǔn)確吸取10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液1 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成濃度為1 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

100 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液：準(zhǔn)確吸取 1 mL 100 μg·mL-1的恩諾沙星-D5標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL 100 μg·mL-1的環(huán)丙沙星-D3標(biāo)準(zhǔn)溶液，于10 mL容量瓶中，甲醇稀釋定容，配制成10 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，依次逐級(jí)稀釋，至濃度為100 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液。

0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液：稱取71.63 g磷酸氫二鈉，用水溶解，定容至1000 mL。

0.1 mol·L-1的檸檬酸溶液：稱取21.01 g檸檬酸，用水溶解，定容至1000 mL。

0.1 mol·L-1的EDTA-Mcllvaine緩 沖 溶 液：將 1000 mL 0.1 mol·L-1檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液混合，氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0±0.05，加入60.5 g乙二胺四乙酸二鈉，溶解混勻之后備用。

含5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液：稱取 0.3854 g乙酸銨，用水溶解并稀釋至1000 mL，加入1 mL甲酸，混勻。

1.3.2 樣品前處理

提?。簻?zhǔn)確稱取試樣0.5 g（精確到0.001 g），于50 mL的聚丙烯離心管中，加1.8 mL水充分混合復(fù)原，加100 μL 100 ng·mL-1的混合內(nèi)標(biāo)工作液，加入20 mL 0.1 mol·L-1的EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，均質(zhì)。超聲提取10 min，10000 r·min-1離心5 min（4 ℃），提取3次，合并上清液。

凈化：HLB固相萃取柱（500 mg，6 mL），使用前6 mL甲醇洗滌，6 mL水活化。安裝轉(zhuǎn)接頭和 60 mL注射器，將上清液轉(zhuǎn)移至注射器，控制流速以2～ 3 mL·min-1速度過柱，6 mL 5%甲醇水淋洗，6 mL甲醇洗脫，收集洗脫液。40 ℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL（根據(jù)實(shí)測(cè)濃度可調(diào)整定容體積）含有10%甲醇的0.1%甲酸水溶液和4 mL正己烷，超聲1 min后渦旋混勻，10000 r·min-1離心5 min（4 ℃），取下層水相過0.22 μm微孔濾膜，上機(jī)待測(cè)。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

為降低基質(zhì)效應(yīng)影響，提高試驗(yàn)準(zhǔn)確性，本研究采用了雞肉粉空白樣品，與樣品同步進(jìn)行前處理，作為空白基質(zhì)。添加質(zhì)量濃度為10 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液，將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋成1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、15 ng·mL-1、20 ng·mL-1、30 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、60 ng·mL-1和70 ng·mL-1的工作曲線。

1.3.4 儀器條件

色譜條件。C18色譜柱，柱溫：30 ℃，流動(dòng)相：溶劑A（含5 mmol·L-1乙酸銨的0.1%甲酸溶液），溶劑B（甲醇+乙腈=4+6）；流速：0.25 mL·min-1；梯度洗脫條件：0～1 min 5%B，1～3 min 5%B→95%B，3～8 min 95%B，8～10 min 5%B。

質(zhì)譜條件。ESI源，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），氬氣為碰撞氣；毛細(xì)管溫度（℃）：350，鞘氣（Arb）：45，輔助氣（Arb）：10，噴霧電壓（V）：3000，離子掃描模式：正離子掃描模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

取1 μg·mL-1的恩諾沙星、恩諾沙星-D5、環(huán)丙沙星和環(huán)丙沙星-D8混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在液相質(zhì)譜聯(lián)用儀ESI+模式下掃描，優(yōu)化質(zhì)譜條件，選擇信號(hào)強(qiáng)度理想的母離子和子離子作為定性定量離子，篩選結(jié)果見表1。

表1 化合物的質(zhì)譜條件表

2.2 離子流圖和線性方程

上機(jī)檢測(cè)，化合物總離子流圖和提取離子流圖結(jié)果見圖1，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的出峰時(shí)間分別為 4.47 min和4.38 min，恩諾沙星和環(huán)丙沙星系列標(biāo)準(zhǔn)工作液均為1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10 ng·mL-1、15 ng·mL-1、20 ng·mL-1、30 ng·mL-1、40 ng·mL-1、50 ng·mL-1、60 ng·mL-1和70 ng·mL-1，該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程分別為：Y=-0.032908 1+0.129126X和Y=-0.442433+0.26663X，相關(guān)系數(shù)R2為0.9979和0.9983，線性良好，恩諾沙星和環(huán)丙沙星的線性曲線如圖2所示。

圖1 化合物總離子流圖和提取離子圖

圖2 恩諾沙星和環(huán)丙沙星的線性曲線圖

2.3 加標(biāo)回收率和精密度

雞肉粉空白樣品中，加入恩諾沙星和環(huán)丙沙星混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇在5.0 μg·kg-1，20 μg·kg-1，80 μg·kg-13水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，按照文中方法進(jìn)行前處理，每個(gè)添加濃度測(cè)定6次，同時(shí)測(cè)定陽性質(zhì)控樣品（ZKE和ZKC），平均加標(biāo)回收率和精密度結(jié)果如表2所示，平均回收率為89.9%～101.6%，精密度為0.9%～7.2%，陽性質(zhì)控樣品ZKE和ZKC的實(shí)測(cè)值分別為346 μg·kg-1和475 μg·kg-1，結(jié)果均在其擴(kuò)展不確定度范圍內(nèi)，符合檢測(cè)需求。

表2 樣品平均回收率和精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.4 檢出限和定量限

取恩諾沙星和環(huán)丙沙星加標(biāo)量為5.0 μg·kg-1的樣品經(jīng)前處理后上機(jī)測(cè)定，根據(jù)3倍信噪比確定方法的檢出限，按10倍信噪比確定方法的定量限，結(jié)果顯示恩諾沙星的檢出限和定量限分別為0.50 μg·kg-1和 1.3 μg·kg-1，環(huán)丙沙星的檢出限和定量限分別為 1.0 μg·kg-1和2.5 μg·kg-1。

2.5 定量方法的選擇

3水平加標(biāo)樣品和陽性質(zhì)控樣品（ZKE和ZKC）采用外標(biāo)法定量計(jì)算，外標(biāo)法定量結(jié)果見表3，外標(biāo)法回收率范圍為80.6%～94.0%，ZKE和ZKC的實(shí)測(cè)值分別為331 μg·kg-1和428 μg·kg-1，與內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果比對(duì)發(fā)現(xiàn)外標(biāo)法定量結(jié)果偏低，而內(nèi)標(biāo)法定量更準(zhǔn)確，因此本方法選擇內(nèi)標(biāo)法定量。

表3 外標(biāo)法定量結(jié)果表

3 結(jié)論

本文通過試驗(yàn)對(duì)雞肉粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定法進(jìn)行了優(yōu)化，選擇EDTAMcllvain緩沖溶液作為提取液，減少了有機(jī)溶劑的使用，借助轉(zhuǎn)接頭安裝60 mL注射器的HLB固相萃取柱凈化樣品提取液，簡(jiǎn)化了多次進(jìn)樣的凈化過程，提高了工作效率，且有效去除了干擾雜質(zhì)，延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，避免色譜質(zhì)譜系統(tǒng)的污染。同時(shí)采用空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，降低了基質(zhì)效應(yīng)，提高了定性和定量的準(zhǔn)確性，該方法前處理簡(jiǎn)單快速、線性良好，回收率和精密度高，內(nèi)標(biāo)法校正，可以更準(zhǔn)確定量測(cè)定雞肉粉中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量，滿足檢測(cè)需求。