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        羅漢果黃素及其主要代謝物抗糖基化活性研究

        2022-01-20 06:31:50童優(yōu)蕓李夢月高藝笑項穎芳劉合生
        現(xiàn)代食品 2021年23期

        ◎ 陳 楊,童優(yōu)蕓,李夢月,高藝笑,項穎芳,劉合生

        (1.浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院,浙江 寧波 315100;2.諾安檢測服務(wù)有限公司,浙江 寧波 315000)

        隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的迅速提高及生活方式的改變,高糖、高脂肪的飲食結(jié)構(gòu)及缺乏運動的生活方式使得糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病率、死亡率及醫(yī)療成本呈現(xiàn)快速上升趨勢[1]。目前商品化的抗糖尿病藥物根據(jù)其作用機制不同可以分為多種類型,如α-葡萄糖苷酶抑制劑、胰島素增敏劑、二肽基肽酶抑制劑以及糖基化抑制劑等[2]。其中糖基化抑制劑可顯著減輕糖尿病癥狀、延緩糖尿病進(jìn)程及降低糖尿病并發(fā)癥風(fēng)險[3]。但是長期服用這類藥物容易引發(fā)多種毒副作用,如胃腸道紊亂、肝臟疾病、流感樣癥狀、罕見血管炎以及腎臟腫瘤等[4],因此天然來源、特別是膳食來源的AGEs抑制劑因其具有無或輕微毒副作用、來源廣泛、食用方便及相對廉價等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[5]。大量文獻(xiàn)報道了天然來源提取物或其活性成分具有強烈抗AGEs或抗糖基化作用[6]。羅漢果黃素是羅漢果(Siraitia grosvenorii)果實中的一種特征性黃酮類化合物,其主要代謝物有山奈苷、α-rhamnoisorobin、阿福豆苷和山奈酚,均具有明顯的抗氧化活性,且代謝物活性比原形物的更高[7]。而抗氧化與抗糖基化作用顯著相關(guān),因此羅漢果黃素是否具有顯著的抗糖基化活性有待驗證。經(jīng)胃腸道消化、轉(zhuǎn)化后,羅漢果黃素代謝產(chǎn)物是否也具有抗糖基化作用,以及代謝前后抗糖基化活性是否變化,目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。因此,本項目擬利用牛血清白蛋白-果糖-葡萄糖(BSA-Fru-Glu)體外糖基化體系,探討羅漢果黃素及3種胃腸道主要代謝物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚對AGEs抑制活性,以期為羅漢果抗糖尿病功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        羅漢果黃素、阿福豆苷、山奈苷和山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品購于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司;牛血清白蛋白(BSA)購于北京索萊寶科技有限公司;5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、葡萄糖以及果糖購于阿拉丁試劑有限公司;鹽酸氨基胍(AG)、硫黃素T來源于Sigma公司;果糖胺試劑盒購買于南京建成生物工程研究所;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

        1.2 儀器與設(shè)備

        F-380熒光分光光度計,天津港東科技股份有限公司;Infinite M200 Pro多功能酶標(biāo)儀,瑞士Tecan公司。

        1.3 試驗方法

        1.3.1 體外糖基化體系

        參照文獻(xiàn)[8]方法,略微修改。含10 mg·mL-1BSA的0.1 mol·L-1pH=7.4的磷酸鈉緩沖液(PBS),加入終濃度0.2 mol·L-1的果糖和0.2 mol·L-1的葡萄糖,再加入一定量溶解于10%二甲亞砜(DMSO)水溶液的羅漢果黃素、山奈苷、阿福豆苷、山奈酚和AG儲備溶液,使其終濃度分別為0.1 mmol L-1和1 mmol·L-1的羅漢果黃素、山奈苷、阿福豆苷和山奈酚的抑制劑組及陽性對照組,以含10 mg·L-1BSA、0.2 mol·L-1葡萄糖、0.2 mol·L-1果糖,不含抑制劑或陽性對照的 0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS為模型組,以含10 mg·mL-1組,BSA的0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS為 空 白 對 照組,同時做本底組(含相同濃度DMSO的抑制劑+PBS),所有組均加入終濃度為0.02%的疊氮化鈉,以抑制微生物生長。每個組設(shè)置3個平行,37 ℃恒溫水浴鍋中避光孵育4周,每周取樣測定下列指標(biāo)。

        1.3.2 晚期糖基化產(chǎn)物(AGEs)的檢測

        參照文獻(xiàn)[8]方法并略做修改。移取150 μL糖基化樣品,置于黑色96孔板中,酶標(biāo)儀于激發(fā)波長 350 nm,發(fā)射波長450 nm測定熒光強度。按下式計算抑制率:

        式(1)中:F0為模型組(BSA-Fru-Glu)熒光強度;F1為抑制劑組熒光強度;F2為本底組熒光強度。

        1.3.3 果糖胺含量測定

        參照文獻(xiàn)[8]描述方法,略做修改。準(zhǔn)確移取100 μL糖化樣品置于96孔板中,加入0.25 mmol·L-1氮藍(lán)四唑溶液(溶于0.1 mol·L-1pH=10.35的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液)100 μL,37 ℃孵育30 min,于530 nm處測定吸光度,按下式計算果糖胺含量:

        式(2)中:A為530 nm測定的吸光度;L為光程(cm);ε為摩爾消光系數(shù),為12640 L·mol-1·cm-1;V1為測量體系總體積(mL);10-3為mL與L的換算系數(shù);109為mol與nmol的換算系數(shù);c為BSA濃度(mg·mL-1);V2為取樣體積(mL);結(jié)果表示為nmol果糖胺/mg蛋白質(zhì)。

        1.3.4 蛋白羰基含量測定

        參照報道[8]的方法,稍做修改。準(zhǔn)確移取糖化BSA溶液100 μL,加入10 mmol·L-12,4-二硝基苯肼溶液(溶于2.5 mol·L-1鹽酸)400 μL,充分混合,黑暗中孵育1 h后,加入0.5 mL的20%(m/v)的三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì),立即于冰上放置5 min,4 ℃,10000×g離心10 min,棄上清,沉淀用0.5 mL乙醇/乙酸乙酯(1∶1,v/v)混合液洗滌3次后,加入 6 mol·L-1的鹽酸胍溶液0.25 mL,反復(fù)渦旋至溶解,準(zhǔn)確移取200 μL旋至至96孔板,酶標(biāo)儀于370 nm處測定吸光度,樣品羰基含量按下式計算:

        式(3)中:A為370 nm測定的吸光度;L為光程(cm),即96孔板液面高度;ε為2,4-二硝基苯肼的摩爾消光系數(shù),為22000 L·mol-1·cm-1;V1為測定吸光度時樣液總體積,mL;10-3為mL與L的轉(zhuǎn)換系數(shù);109為mol與nmol的轉(zhuǎn)換系數(shù);c為BSA濃度,本試驗c=10 mg·mL-1;V2為取樣體積,mL;結(jié)果表示為nmol羰基/mg蛋白質(zhì)。

        1.3.5 巰基含量測定

        參照文獻(xiàn)[8]方法,稍有修改。準(zhǔn)確移取70 μL糖 化BSA溶液于96孔酶標(biāo)板,加入130 μL的5 mmol·L-1DTNB溶 液(溶 于0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS), 25 ℃孵育15 min,酶標(biāo)儀于412 nm處測定吸光度,按照同樣方法,以L-半胱氨酸(100-350 μmol·L-1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以不加樣品的DTNB溶液調(diào)零,按照下式計算巰基含量:

        式(4)中:c1為L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算的濃度(μmol·L-1);V1為取樣體積,μL;10-6為μL與L的轉(zhuǎn)換系數(shù);c2為BSA濃度(mg·mL-1);10-3為μL與mL的轉(zhuǎn)換系數(shù);結(jié)果表示為μmol巰基/mg蛋白質(zhì)。

        1.3.6 類淀粉蛋白β交聯(lián)結(jié)構(gòu)的測定

        參照文獻(xiàn)[8]方法,略做修改。10 μL糖化BSA樣品置于黑色96孔板中,加入64 μmol·L-1硫磺素T溶液(溶于0.1 mol·L-1pH=7.4的PBS)100 μL,25 ℃孵育60 min,采用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長435 nm,發(fā)射波長485 nm測定熒光強度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 羅漢果黃素與其主要代謝產(chǎn)物的抗糖基化效果

        本研究首先比較了羅漢果黃素與其主要代謝物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚在低濃度(0.1 mmol·L-1)和高濃度(1 mmol·L-1)下孵育4周對BSA-Fru-Glu體外 孵育體系熒光AGEs的影響。如圖1所示,0.1 mmol·L-1處理4周,羅漢果黃素?zé)o明顯AGEs抑制作用 (P>0.05),而山奈苷、阿福豆苷和山奈酚均顯示出較低的抑制作用,抑制率分別為6.2%、8.6%和9.6%。當(dāng)1.0 mmol·L-1處理4周時,羅漢果黃素處理組的熒光強度無明顯變化(P>0.05),而阿福豆苷、山奈苷和山奈酚處理組的熒光AGEs顯著減低(P<0.05),呈現(xiàn)劑量依賴性,山奈酚的抑制作用最強,抑制率達(dá)62.6%,顯著高于羅漢果黃素和另外2種代謝物 (P<0.05),為此后續(xù)試驗以山奈酚為研究對象。

        圖1 羅漢果黃素及其主要代謝產(chǎn)物山奈苷、 阿福豆苷和山奈酚對糖基化的抑制作用圖

        2.2 山奈酚體外抗糖基化活性

        2.2.1 山奈酚對果糖胺形成的影響

        圖2表明,低劑量(0.1 mmol·L-1)山奈酚對果糖胺形成無明顯抑制作用(P>0.05),而高劑量 (1 mmol·L-1)盡管在第1和第4周對果糖胺含量無顯著抑制作用(P>0.05),但第2、3周對其具有顯著抑制作用(P<0.05),抑制效果與陽性對照(氨基胍,AG)相當(dāng),且該抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性。與Fru-Glu-BSA組比較,1 mmol·L-1山奈酚或AG孵育 3周,果糖胺含量分別降低了27.7%和33.1%。

        圖2 山奈酚對體外糖基化體系果糖胺形成的影響圖

        2.2.2 山奈酚對蛋白質(zhì)氧化的影響

        圖3a表明低濃度(0.1 mmol·L-1)山奈酚處理 4周對糖基化體系羰基水平無明顯影響(P>0.05),但高濃度(1 mmol·L-1)山奈酚在前期的抑制效果優(yōu)于后期;類似地,0.1 mmol·L-1山奈酚在整個試驗周期對體系的巰基水平無明顯影響(P>0.05),但是與模型組比較,1 mmol·L-1山奈酚在前3周提升了巰基水平,但第4周與模型組無明顯差異(P>0.05)。 與BSA-Fru-Glu組比較,1 mmol·L-1山奈酚孵育3周,羰基水平降低了19.4%,巰基水平上升了16.7%,提示山奈酚對糖基化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)氧化有抑制 作用。

        圖3 山奈酚對體外糖基化體系蛋白質(zhì)氧化的影響圖

        2.2.3 山奈酚對糖基化誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)交聯(lián)的影響

        蛋白質(zhì)糖基化形成的活性二羰基化合物加速蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間形成交聯(lián)結(jié)構(gòu),使其功能受損和缺失。圖4表明高濃度(1 mmol·L-1)山奈酚作用4周,明顯抑制β淀粉樣蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05),與模型組比較,降低了49.2%;而低劑量(0.1 mmol·L-1)在糖基化初期,對β淀粉樣蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu)形成具有較弱的抑制作用,而后期表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用,這可能與山奈酚在低濃度有促氧化作用,而高濃度有抗氧化作用有關(guān)。

        圖4 山奈酚對體外糖基化體系β淀粉樣蛋白交聯(lián)結(jié)構(gòu) 形成的影響圖

        3 結(jié)論

        羅漢果黃素在體外無明顯抗糖基化作用,但經(jīng)胃腸道消化酶及腸道菌群作用后,形成的主要代謝產(chǎn)物山奈苷、阿福豆苷和山奈酚具有明顯的體外抗糖基化活性,其活性次序為山奈苷<阿福豆苷<山奈酚,表明糖配基數(shù)量與羅漢果黃素主要代謝物的抗糖基化活性負(fù)相關(guān)。

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