何勇鳳 朱永久 龔進(jìn)玲 朱挺兵 吳興兵 李學(xué)梅 孟子豪 楊德國(guó)

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430223)

金沙江是長(zhǎng)江上游干流的一段, 起自青海省玉樹(shù)巴塘河口, 至四川省宜賓岷江口止, 全長(zhǎng)約2290 km,約占長(zhǎng)江上游干流河長(zhǎng)的2/3, 總落差3333 m, 平均比降1.45‰, 水量豐沛, 集水面積36.2×104km2, 約占長(zhǎng)江上游流域面積的36%[1]。自青海省玉樹(shù)巴塘河口至云南省麗江石鼓為金沙江上段, 河長(zhǎng)約984 km,平均比降為1.75‰, 從石鼓至四川省攀枝花市為金沙江中段, 河長(zhǎng)約546 km, 平均比降為1.48‰, 從攀枝花市至四川宜賓岷江口為金沙江下段, 河長(zhǎng)約783 km, 平均比降為0.93‰[2]。金沙江由青藏高原邊緣地區(qū)向四川盆地邊緣地區(qū)進(jìn)行過(guò)渡, 跨越中國(guó)地勢(shì)的第一大階梯和第二大階梯, 河流情勢(shì)多變,比降大, 生境異質(zhì)性高, 孕育了豐富的魚(yú)類資源, 據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)金沙江流域共分布有魚(yú)類200種[2]。金沙江水能資源非常豐富, 理論蘊(yùn)藏量占長(zhǎng)江總量的45.25%, 是國(guó)家規(guī)劃的13個(gè)重要能源基地之一, 在我國(guó)能源資源建設(shè)中具有重要的戰(zhàn)略地位。金沙江上游江段規(guī)劃有7個(gè)梯級(jí)水電站, 從上而下依次是崗?fù)?、波羅、葉巴灘、拉哇、巴塘、蘇洼龍和昌波水電站, 其中蘇洼龍水電站已建成蓄水, 葉巴灘水電站正在修建中, 其余電站均尚未開(kāi)工建設(shè);金沙江中游江段規(guī)劃有10個(gè)梯級(jí)水電站, 從上而下依次是龍盤、兩家人、梨園、阿海、金安橋、龍開(kāi)口、魯?shù)乩⒂^音巖、金沙和銀江水電站, 其中梨園、阿海、金安橋、龍開(kāi)口、魯?shù)乩陀^音巖等6個(gè)水電站已建成蓄水發(fā)電, 金沙水電站已實(shí)現(xiàn)三期截流, 銀江水電站正在修建中, 龍盤和兩家人2個(gè)水電站尚未開(kāi)工建設(shè); 金沙江下游江段規(guī)劃有4個(gè)梯級(jí)水電站, 從上而下依次是烏東德、白鶴灘、溪洛渡和向家壩水電站, 其中烏東德、溪洛渡和向家壩水電站已建成蓄水發(fā)電, 白鶴灘水電站正在修建中。金沙江大規(guī)模的水電建設(shè)顯著影響了水生生態(tài)環(huán)境, 大壩阻隔使原本急流險(xiǎn)灘的河流環(huán)境變成了靜水緩流的河道型水庫(kù)環(huán)境, 水文條件發(fā)生巨大改變, 這無(wú)疑都使原有的魚(yú)類區(qū)系及分布格局發(fā)生明顯改變, 尤其對(duì)適合急流生活、產(chǎn)漂流性卵的魚(yú)類如圓口銅魚(yú)[Coreius guichenoti(SauvageetDabry)]等產(chǎn)生巨大影響。

圓口銅魚(yú)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鮈亞科(Gobioninae)、銅魚(yú)屬(Coreius), 主要分布于長(zhǎng)江上游干流及雅礱江、烏江等大型支流中, 是典型的河道洄游性魚(yú)類和產(chǎn)漂流性卵魚(yú)類, 也是長(zhǎng)江上游特有魚(yú)類和重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類[3—5],其產(chǎn)卵場(chǎng)僅發(fā)現(xiàn)于金沙江中下游以及雅礱江干流下游[6—8]。但近些年來(lái), 由于長(zhǎng)期的過(guò)度捕撈、無(wú)節(jié)制的資源掠奪和長(zhǎng)江上游梯級(jí)水電開(kāi)發(fā)的逐步實(shí)施, 圓口銅魚(yú)完成生活史的通道因筑壩截流而被阻, 其產(chǎn)卵場(chǎng)環(huán)境遭受毀滅性破壞, 其種群資源已呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)[9—11], 其物種生存與延續(xù)面臨巨大的威脅,2007年已被列入農(nóng)業(yè)部《國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)植物資源名錄(第一批)》中, 2015年更是被環(huán)境保護(hù)部和中國(guó)科學(xué)院聯(lián)合發(fā)布的《中國(guó)生物多樣性紅色名錄——脊椎動(dòng)物卷》評(píng)估為極度瀕危物種。目前關(guān)于圓口銅魚(yú)的研究主要涉及生物學(xué)、資源量、棲息地、馴養(yǎng)繁殖與性腺發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)與疾病防治、應(yīng)激、能量代謝、親子鑒定和遺傳多樣性等方面[7,12—26],其中關(guān)于圓口銅魚(yú)遺傳多樣性的研究, 內(nèi)容包括微衛(wèi)星標(biāo)記篩選、部分江段(如雅礱江金河江段、金沙江觀音巖江段、攀枝花江段、巧家江段、永善江段、屏山江段、宜賓江段、長(zhǎng)江上游重慶江段、三峽庫(kù)區(qū)江段和長(zhǎng)江中游宜昌江段)群體的遺傳多樣性評(píng)估等[20—26]。然而, 針對(duì)金沙江中游江段的圓口銅魚(yú)群體尚未有任何研究報(bào)道。

因此, 在金沙江中下游已修建十二級(jí)水電工程的背景下, 本研究以圓口銅魚(yú)野生樣本為實(shí)驗(yàn)材料,重點(diǎn)針對(duì)金沙江中下游江段尚有分布的4個(gè)群體進(jìn)行線粒體Cytb基因和COⅠ基因測(cè)序, 分析圓口銅魚(yú)金沙江中下游不同地理群體的遺傳多樣性、群體分化以及種群歷史動(dòng)態(tài)等, 以期為金沙江圓口銅魚(yú)的種群遺傳管理和資源保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

于2017—2019年對(duì)金沙江中下游干流江段圓口銅魚(yú)的分布進(jìn)行野外調(diào)查, 共采集到393尾樣本,其中金安橋群體153尾、龍開(kāi)口群體124尾、巧家群體101尾和屏山群體15尾。樣本經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量全長(zhǎng)、體長(zhǎng)和體重等基礎(chǔ)生物學(xué)信息后(表 1), 剪取鰭條, 采用無(wú)水乙醇進(jìn)行固定保存。樣本分布圖見(jiàn)圖 1。

表 1 金沙江中下游圓口銅魚(yú)樣本采集信息Tab. 1 Sampling information of Coreius guichenoti in the middle and lower reaches of the Jinsha River

圖 1 金沙江中下游圓口銅魚(yú)樣本采集地點(diǎn)Fig. 1 Map of sample locations for Coreius guichenoti in the middle and lower reaches of the Jinsha River

1.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用Omega Bio-Tek公司的Tissue DNA Kit(D3396)試劑盒提取圓口銅魚(yú)樣本基因組DNA, 采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其濃度和完整性, 于-20℃保存。Cytb基因擴(kuò)增和測(cè)序引物為L(zhǎng)14724(5′-gACTTgAAAAACCACCgTTg-3′)和H15915(5′-CTCCgATCTCCggATTACAAgAC-3′)[27],COⅠ基因擴(kuò)增和測(cè)序引物為COⅠ-F(5′-TCAACCAACCA CAAAgACATTggCAC-3′)和COⅠ-R(5′-TAgAC TTCTgggTggCCAAAgAATCA-3′)[28]。PCR反應(yīng)總體積為30 μL, 反應(yīng)體系包括: 2×PowerTaqPCRMasterMix 15 μL, 基因組DNA 1 μL, 引物各1 μL (10 mmol/L), 滅菌ddH2O 12 μL。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s, 58℃退火30s, 72℃延伸1min,共35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸5min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠拍照檢測(cè)目的片段, 成功后將PCR產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司完成純化、測(cè)序與拼接。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序所得序列使用DNASTAR軟件包中的Seq-Man編輯首尾兩端噪音序列至同樣長(zhǎng)度。同時(shí), 為了獲得更多的變異信息, 合并了兩個(gè)線粒體基因Cytb和COⅠ的串聯(lián)序列用于后續(xù)分析。采用MEGA 6.0[29]進(jìn)行序列比對(duì)和校正, 統(tǒng)計(jì)堿基組成, 并采用Kimura雙參數(shù)模型進(jìn)行譜系分支內(nèi)部與分支之間遺傳距離的計(jì)算。采用DnaSP v6軟件計(jì)算群體變異位點(diǎn)(Variable sites)、單一突變位點(diǎn)(Singleton variable sites)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(Parsimony-informative sites)、單倍型多樣性(Haplotype diversity)和核苷酸多樣性(Nucleotide diversity)等[30]。

利用PopART軟件(http://popart/otago.ac.nz)以中接法(Median-joining)構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖[31],分析單倍型之間的進(jìn)化關(guān)系。采用PhyloSuite軟件[32]中最大似然法(Maximum likelihood, ML)和貝葉斯法(Bayesian inferences, BI)構(gòu)建圓口銅魚(yú)分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 其中ML法建樹(shù)時(shí)運(yùn)行10000次bootstrap,BI法建樹(shù)時(shí)運(yùn)行200萬(wàn)代。

使用Arlequin 3.5軟件[33]中的分子方差分析(Analysis of Molecular Variance, AMOVA)估算群體遺傳距離和遺傳變異的分布, 計(jì)算群體遺傳分化指數(shù)Fst。同時(shí), 采用貝葉斯聚類分析(Bayesian Analysis of Population Structure)BAPS 6.0軟件[34]中“Clustering with linked loci”對(duì)圓口銅魚(yú)393個(gè)個(gè)體的線粒體串聯(lián)基因序列進(jìn)行聚類分析, 設(shè)置潛在種群K值為2—10的整數(shù)值, 并且分別重復(fù)計(jì)算10次,迭代次數(shù)1000次, 確定聚類關(guān)系。

使用Arlequin3.5軟件計(jì)算錯(cuò)配分布(mismatch distribution)[35]、Tajima’sD[36]和Fu’sFs值[37]來(lái)檢驗(yàn)群體歷史上是否經(jīng)歷擴(kuò)張, 通過(guò)偏差平方和(Sum of Squared deviation, SSD)和粗糙指數(shù)(Harpending’s Raggedness index,Hri)來(lái)檢測(cè)核苷酸不配對(duì)分布與種群擴(kuò)張模型下期望分布之間的擬合優(yōu)度。采用BEAST v1.10.4軟件[38]對(duì)串聯(lián)基因序列進(jìn)行種群歷史動(dòng)態(tài)的Bayesian skyline plot(BSP)分析, 利用Tracer v1.7.1軟件進(jìn)行構(gòu)圖[39], 最佳堿基替換模型為HKY+I+G模型, 分子鐘模型采用strict clock, 魚(yú)類線粒體DNA基因序列的突變率采用1%/百萬(wàn)年[40,41],估算圓口銅魚(yú)不同譜系分支的分化時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 基因序列變異分析

本研究共獲得393尾圓口銅魚(yú)的線粒體Cytb基因(GenBank登錄號(hào): MW045220—MW045310)和COⅠ基因序列(GenBank登錄號(hào): MW094040—MW094130)。在序列兩端截齊后, 共獲得: (1)1140 bp的Cytb序列, 變異位點(diǎn)56個(gè), 其中單一突變位點(diǎn)19個(gè), 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)37個(gè), 平均堿基組成: A=29.3%、T=29.7%、C=27.0%、G=14.0%, A+T的含量(59.0%)高于G+C的含量(41.0%), 平均轉(zhuǎn)換/顛換值為9.44, 界定了60個(gè)單倍型; (2)680 bp的COⅠ序列,變異位點(diǎn)20個(gè), 其中單一突變位點(diǎn)5個(gè), 簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)15個(gè), 平均堿基組成: A=26.1%、T=29.9%、C=25.8%、G=18.1%, A+T的含量(56.0%)高于G+C的含量(43.9%), 平均轉(zhuǎn)換/顛換值為4.81, 界定了27個(gè)單倍型; (3)兩個(gè)基因序列中堿基G的含量均最低, 尤其在密碼子第三位的含量最低, 堿基組成表現(xiàn)出了明顯的AT偏好和反G偏倚, 符合脊椎動(dòng)物線粒體DNA基因的共同特性; (4)串聯(lián)后的線粒體基因序列, 界定了91個(gè)單倍型。

2.2 單倍型多樣性和核苷酸多樣性

基于2個(gè)基因的串聯(lián)序列(表 2), 估算金沙江中下游野生圓口銅魚(yú)的單倍型數(shù)目介于6—55, 單倍型多態(tài)性介于0.838 (±0.061)—0.960 (±0.005), 核苷酸多態(tài)性介于0.00426 (±0.00023)—0.00519 (±0.00009)。從不同地理群體來(lái)看, 金安橋群體的單倍型數(shù)目、單倍型多樣性和核苷酸多樣性均是最高的, 屏山群體的單倍型多樣性和巧家群體的核苷酸多樣性均是最低的。

從單倍型分布來(lái)看, 全部群體的共享單倍型為4個(gè), 如單倍型Hap4、Hap5、Hap12和Hap40, 而其中2—3個(gè)群體的共享單倍型數(shù)目為21個(gè)。從獨(dú)有單倍型來(lái)看, 4個(gè)野生群體均分布有獨(dú)有單倍型, 如金安橋群體和龍開(kāi)口群體分布的獨(dú)有單倍型數(shù)目分別為32個(gè)和17個(gè), 巧家群體分布有16個(gè)獨(dú)有單倍型, 屏山群體僅分布有1個(gè)獨(dú)有單倍型(表 2)。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

以銅魚(yú)(Coreius heterodon, GenBank登錄號(hào):NC_020042.1)為外類群, 應(yīng)用最大似然法(ML)和貝葉斯法(BI)構(gòu)建圓口銅魚(yú)91個(gè)線粒體Cytb和COⅠ串聯(lián)基因序列單倍型之間的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示, 2種方法分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)基本一致, 所有單倍型聚為一個(gè)單系, 但在系統(tǒng)樹(shù)上并不按照地理分布聚類, 存在多岐分支(圖 2)。串聯(lián)基因序列單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示, 圓口銅魚(yú)線粒體DNA單倍型的網(wǎng)絡(luò)進(jìn)化關(guān)系呈星狀分布,Hap12屬于較原始單倍型和進(jìn)化中心, 不存在顯著的地理分布格局, 但呈現(xiàn)出3個(gè)較明顯的單倍型譜系分支(Clade 1、Clade 2和Clade 3; 圖 3), 每個(gè)譜系分支均涉及4個(gè)不同地理群體, 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上也得到相應(yīng)的支持。Clade 1包括36個(gè)單倍型172個(gè)個(gè)體(占所有樣本的43.7%), 其中金安橋JAQ群體、龍開(kāi)口LKK群體、巧家QJ群體和屏山PS群體分別占該分支所有個(gè)體的比例為29.1%、40.1%、27.3%和3.5%; Clade 2包括27個(gè)單倍型106個(gè)個(gè)體(占所有樣本的27.0%), 其中金安橋JAQ群體、龍開(kāi)口LKK群體、巧家QJ群體和屏山PS群體分別占該分支所有個(gè)體的比例為41.5%、23.6%、32.1%和2.8%; Clade 3包括28個(gè)單倍型115個(gè)個(gè)體(占所有樣本的29.3%),其中金安橋JAQ群體、龍開(kāi)口LKK群體、巧家QJ群體和屏山PS群體分別占該分支所有個(gè)體的比例為51.3%、26.1%、17.4%和5.2%。其中分支Clade 1、Clade 2和Clade 3的內(nèi)部遺傳距離均為0.002, 分支Clade 1與Clade 2、Clade 3之間的遺傳距離分別為0.006和0.009, Clade 2 和Clade 3之間的遺傳距離為0.008。經(jīng)估算, 出現(xiàn)Clade 1譜系分支的時(shí)間大約在3.66 Ma, 出現(xiàn)Clade 2和Clade 3譜系分支的時(shí)間大約在2.93 Ma。

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)

基于串聯(lián)基因序列, BAPS分析結(jié)果顯示圓口銅魚(yú)所有個(gè)體聚為3支更為合適(圖 4), 此時(shí)log(marginal likelihood, ML)值為-2213.8949。

AMOVA分析結(jié)果顯示, 在不分組的情況下圓口銅魚(yú)線粒體DNA的遺傳變異主要來(lái)自地理群體內(nèi)的遺傳變異(占96.62%), 地理群體間的遺傳變異較小, 僅占3.38%; 在分成3個(gè)單倍型譜系分支的組別情況下, 圓口銅魚(yú)線粒體DNA的遺傳變異主要來(lái)自譜系分支之間(占81.29%), 譜系分支內(nèi)部的遺傳變異僅為18.71%(表 3)。圓口銅魚(yú)不同地理群體兩兩之間的遺傳分化指數(shù)(Fst)范圍為-0.008—0.045(表 4), 所有群體間Fst值均小于0.05, 而且除屏山群體與其他群體間Fst值未達(dá)到顯著水平外, 其余兩兩群體間Fst值均達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。針對(duì)3個(gè)不同譜系分支, 兩兩之間的Fst值均大于0.25, 其中譜系Clade 1與Clade 2、Clade 1與Clade 3、Clade 2與Clade 3之間的Fst值分別為0.759、0.847和0.805, 均達(dá)到顯著水平(P＜0.001)。

2.5 種群歷史動(dòng)態(tài)分析

核苷酸錯(cuò)配分析發(fā)現(xiàn), 所有地理群體均呈現(xiàn)多峰分布(表 5)。除圓口銅魚(yú)屏山群體外,SSD和Hri檢驗(yàn)結(jié)果顯示其他地理群體均未顯著偏離群體擴(kuò)張模型(P＞0.05)。中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示, 所有地理群體的Tajima’sD值均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05);Fu’sFs檢驗(yàn)結(jié)果顯示, 圓口銅魚(yú)混合群體和金安橋群體均呈現(xiàn)顯著負(fù)值(P＜0.02), 龍開(kāi)口群體和巧家群體均呈現(xiàn)不顯著負(fù)值(P＞0.02)。

BSP分析了有效種群大小隨溯祖時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化曲線, 結(jié)果顯示除屏山群體未檢測(cè)到明顯的種群擴(kuò)張現(xiàn)象外, 其他群體均在0.0004—0.0007 Ma期間存在擴(kuò)張現(xiàn)象(圖 5)。

圖 2 基于串聯(lián)基因序列的圓口銅魚(yú)單倍型間的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 2 Maximum likelihood (ML) phylogenetic tree of Coreius guichenoti based on concatenated haplotype sequences of gene Cyt b and COⅠ

3 討論

3.1 金沙江中下游圓口銅魚(yú)的遺傳多樣性和種群分化

單倍型多樣性和核苷酸多樣性是衡量一個(gè)物種群體DNA變異程度的重要指標(biāo), 也是評(píng)價(jià)種群遺傳多樣性的重要指標(biāo)。在本研究中, 金沙江中下游江段圓口銅魚(yú)的單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.936和0.00489, 不同地理群體之間差異不明顯, 這2個(gè)多樣性指標(biāo)分別處于≥0.5、＜0.5%的水平[42], 即高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性水平,表明金沙江中下游江段圓口銅魚(yú)歷史上可能受瓶頸效應(yīng)影響后種群數(shù)量發(fā)生了迅速擴(kuò)張。與袁希平等[22]針對(duì)長(zhǎng)江干流川江段圓口銅魚(yú)開(kāi)展了線粒體控制區(qū)序列研究結(jié)果相比, 在本研究中金沙江中下游江段圓口銅魚(yú)單倍型多樣性處于與長(zhǎng)江干流川江段相似水平, 而核苷酸多樣性則比宜賓江段(0.0083)要低, 與其他江段相比則處于相似水平; 與Cheng等[25]金沙江屏山江段圓口銅魚(yú)COⅠ基因序列研究結(jié)果相比, 本研究中圓口銅魚(yú)屏山群體的單倍型多樣性和核苷酸多樣性都要高。與同屬的銅魚(yú)(Coreius heterodon)[22]相比, 本研究中金沙江中下游江段圓口銅魚(yú)核苷酸多樣性和單倍型多樣性稍高; 與同亞科的魚(yú)類相比, 圓口銅魚(yú)的單倍型多樣性與蛇鮈(Saurogobio dabryi)類似, 比銀鮈(Squalidus argentatus)、花?(Hemibarbus maculatus)和棒花魚(yú)(Abbottina rivularis)要高, 圓口銅魚(yú)的核苷酸多樣性與銀鮈類似, 比蛇鮈和花?要低, 比棒花魚(yú)要高得多[43]; 而與同為鯉科非同一個(gè)亞科的魚(yú)類相比, 圓口銅魚(yú)與赤水河半?(Hemiculterella sauvagei)[44]的核苷酸多樣性和單倍型多樣性水平相似, 比嘉陵裸裂尻魚(yú)(Schizopygopsis kialingensis)[45]的核苷酸多樣性稍低, 單倍型多樣性則稍高?？傮w而言, 金沙江中下游的圓口銅魚(yú)處于高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性的模式。

表 2 金沙江中下游圓口銅魚(yú)不同群體的遺傳多樣性信息Tab. 2 Genetic diversity of Coreius guichenoti at different locations of the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and CO I

Balloux和Lugon-Moulin認(rèn)為當(dāng)Fst值在 0—0.05時(shí), 表示低等水平的遺傳分化; 當(dāng)在 0.05—0.15時(shí), 表示中等水平的遺傳分化; 當(dāng)在 0.15—0.25時(shí),表示高度的遺傳分化; 當(dāng)大于0.25時(shí), 表示極大的遺傳分化[46]。本研究中金沙江中下游圓口銅魚(yú)不同地理群體間的遺傳分化指數(shù)均小于0.05, 處于低等分化水平。這表明, 金沙江中下游水域的圓口銅魚(yú)尚未出現(xiàn)明顯的地理分布格局, 這可能與圓口銅魚(yú)產(chǎn)漂流性卵等生活史特征有關(guān), 盡管目前金沙江中下游已被梯級(jí)水電站的大壩阻隔形成多個(gè)小生境, 但由于阻隔年限尚短, 尚不足以引起圓口銅魚(yú)不同地理群體的遺傳分化。金沙江中下游水域的圓口銅魚(yú)雖未出現(xiàn)明顯的地理分布格局, 但不同地理群體內(nèi)部均分布有自己獨(dú)有的單倍型, 如基于串聯(lián)基因序列分析時(shí), 金安橋群體、龍開(kāi)口群體、巧家群體和屏山群體的獨(dú)有單倍型數(shù)占各自群體內(nèi)總單倍型數(shù)的比例分別為58.2%、43.6%、47.1%和16.7%。因此, 需要注意的是, 目前圓口銅魚(yú)金沙江中下游不同地理群體間的遺傳分化低并不意味著分化程度可以被忽視, 由于大壩阻隔帶來(lái)的長(zhǎng)期效應(yīng)在進(jìn)化史上將會(huì)對(duì)金沙江中下游圓口銅魚(yú)造成巨大的影響, 必須時(shí)刻關(guān)注。

表 3 金沙江中下游圓口銅魚(yú)的分子方差分析Tab. 3 Analysis of molecular variance analysis among locations of Coreius guichenoti from the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and CO Ⅰ

表 4 基于串聯(lián)序列金沙江中下游圓口銅魚(yú)不同地理群體的遺傳分化系數(shù)（Fst）Tab. 4 Pairwise Fst values among different locations of Coreius guichenoti from the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and COⅠgenes

表 5 金沙江中下游圓口銅魚(yú)不同地理群體的中性檢驗(yàn)和錯(cuò)配分析Tab. 5 Neutrality tests and mismatch distribution values for all locations of Coreius guichenoti from the middle and lower reaches of the Jinsha River based on the concatenated sequences of gene Cyt b and COⅠgenes

另一方面, 從BAPS分析、分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖等均可以看出, 金沙江中下游江段圓口銅魚(yú)呈現(xiàn)出3個(gè)明顯的線粒體DNA單倍型譜系分支, 這也得到了AMOVA和Fst分析結(jié)果的支持。而且不管樣本量的多少, 各個(gè)不同地理群體內(nèi)部均同時(shí)存在3個(gè)譜系分支, 只是各分支在不同群體內(nèi)所占比例稍有差異。其中, 金安橋群體中3個(gè)譜系分支所占比例相差不多, Clade 1、Clade 2和Clade 3分別占32.7%、28.7%和38.6%; 龍開(kāi)口群體和屏山群體中均是譜系分支Clade 1和Clade 3占大多數(shù), 分別占79.8%和80%; 而巧家群體則是譜系分支Clade 1和Clade 2占大多數(shù), 為80.2%。總的來(lái)說(shuō),在圓口銅魚(yú)進(jìn)化過(guò)程中, Clade 1為較原始譜系, 由Clade 1逐漸衍射出兩個(gè)譜系分支Clade 2和Clade 3,且3個(gè)譜系分支之間已呈現(xiàn)極大的遺傳分化水平。

圖 3 基于串聯(lián)基因序列的圓口銅魚(yú)單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖Fig. 3 The haplotype network of Coreius guichenoti based on the concatenated haplotype sequences of gene Cyt b and COⅠ

圖 4 基于聯(lián)合基因Cyt b和COⅠ序列的圓口銅魚(yú)BAPS聚類分析結(jié)果圖Fig. 4 Bayesian analysis of population structure of Coreius guichenoti based on clustering with linked loci for both Cyt b and COⅠ gene.Each color represents a separate genetic cluster, and each bar represents an individual

事實(shí)上, 關(guān)于圓口銅魚(yú)野生群體的遺傳多樣性和遺傳分化水平已開(kāi)展諸多研究, 但大部分研究均基于微衛(wèi)星標(biāo)記開(kāi)展[20,21,23,24,26], 僅有袁希平等[22]針對(duì)長(zhǎng)江干流川江段圓口銅魚(yú)開(kāi)展了線粒體控制區(qū)序列和微衛(wèi)星標(biāo)記雙重分析, 以及Cheng等[25]針對(duì)金沙江屏山江段圓口銅魚(yú)開(kāi)展了COⅠ基因序列分析。這些研究涉及的樣本來(lái)源江段主要包括金沙江觀音巖江段、攀枝花江段、巧家江段、永善江段和屏山江段、長(zhǎng)江干流川江段、長(zhǎng)江中游宜昌江段、雅礱江金河江段等, 均不涉及本研究中的金安橋群體和龍開(kāi)口群體。這些研究結(jié)果顯示出不同江段圓口銅魚(yú)野生群體的遺傳多樣性水平均較高, 但均未出現(xiàn)明顯的地理種群分化, 這也和本研究的結(jié)果是基本一致的。

3.2 金沙江中下游圓口銅魚(yú)的種群歷史動(dòng)態(tài)

在種群歷史動(dòng)態(tài)分析中涉及諸多方法, 如Tajima’sD值和Fu’sFs值等中性檢驗(yàn)方法、核苷酸錯(cuò)配分布情況、SSD和Hri檢驗(yàn)、BSP圖等。在一般情況下, 核苷酸錯(cuò)配分布呈現(xiàn)光滑單峰, 且SSD和Hri檢驗(yàn)未顯著偏離種群擴(kuò)張模型, Tajima’sD值和Fu’sFs值呈顯著負(fù)值時(shí), 被認(rèn)為種群在歷史上有擴(kuò)張跡象[35—37,47,48]。盡管從不同地理群體來(lái)看, 在本研究中種群歷史動(dòng)態(tài)分析各方法的結(jié)果稍有差異。但總體來(lái)說(shuō), 除屏山群體外, 圓口銅魚(yú)金沙江中下游金安橋群體、龍開(kāi)口群體、巧家群體和混合群體在近期均可能發(fā)生過(guò)擴(kuò)張跡象。因此, 圓口銅魚(yú)金沙江中下游群體在近期是可能發(fā)生過(guò)種群擴(kuò)張的。

圖 5 金沙江中下游圓口銅魚(yú)不同群體的種群動(dòng)態(tài)隨時(shí)間變化的BSP圖Fig. 5 Bayesian skyline plots (BSP) for population dynamics with time of Coreius guichenoti in the middle and lower reaches of the Jinsha River實(shí)線表示平均值, 虛線表示95%置信區(qū)間上限, 雙點(diǎn)劃線表示95%置信區(qū)間下限Solid lines indicate median values, dotted lines indicate 95% upper confidence interval, and long dash double dotted lines indicate 95%lower confidence interval

研究表明, 冰川演化在金沙江河谷形成中發(fā)揮了重要作用, 其中經(jīng)歷了最重要的4次冰期分別為中更新世早期的玉龍冰期(0.7—0.6 Ma)、中更新世中期的干海子冰期(0.53—0.45 Ma)、中更新世晚期的麗江冰期(0.31—0.13 Ma)和晚更新世中晚期的大理冰期(0.12—0.01 Ma)[49], 還經(jīng)歷了全新世的現(xiàn)代小冰川時(shí)期(0.01—0 Ma)[50]。通過(guò)估算獲得圓口銅魚(yú)不同群體發(fā)生擴(kuò)張的時(shí)間約在0.0004—0.0007 Ma左右, 即14—17世紀(jì)左右, 處于全新世的現(xiàn)代小冰川時(shí)期, 是距今最近一次冰川頻繁波動(dòng)的時(shí)期[50]。圓口銅魚(yú)3個(gè)不同線粒體DNA譜系分支的分化時(shí)間大約在3.66—2.93 Ma, 處于青藏高原隆起, 鶴慶等盆地下陷時(shí)期。晚更新世以來(lái), 受氣候冷暖變化和冰川作用等影響, 金沙江河谷發(fā)育經(jīng)歷了“下切-滑坡-堰塞-堆積-下切”等復(fù)雜過(guò)程, 冰川退縮, 河流逐漸發(fā)育成不同階地[51], 從而對(duì)河流中的生物種群的進(jìn)化產(chǎn)生影響。因此, 結(jié)合本研究圓口銅魚(yú)金沙江中下游群體發(fā)生擴(kuò)張的估算時(shí)間等信息, 說(shuō)明全新世小冰川時(shí)期冰川的演化和青藏高原隆升在金沙江圓口銅魚(yú)種群歷史動(dòng)態(tài)方面發(fā)揮了重要影響作用。

3.3 金沙江圓口銅魚(yú)的保護(hù)

魚(yú)類種群遺傳結(jié)構(gòu)和譜系系統(tǒng)地理格局的研究可為物種保護(hù)和管理措施的制定提供科學(xué)依據(jù)。本研究結(jié)果表明, 金沙江中下游圓口銅魚(yú)的單倍型多樣性水平總體較為豐富, 但核苷酸多樣性水平較低。近些年來(lái), 由于受人類活動(dòng)的影響, 圓口銅魚(yú)的野生資源量衰退嚴(yán)重, 而且隨著金沙江中下游梯級(jí)水利工程的修建完成, 其棲息地被片段化,棲息環(huán)境被破壞, 洄游通道被阻斷, 其受威脅程度將會(huì)持續(xù)加劇。目前, 已有多個(gè)水電工程將圓口銅魚(yú)列為增殖放流對(duì)象, 多家科研單位對(duì)圓口銅魚(yú)人工馴養(yǎng)與繁殖技術(shù)開(kāi)展攻關(guān)研究, 并取得了突破性進(jìn)展。增殖放流工作一旦開(kāi)展, 勢(shì)必會(huì)對(duì)自然種群的遺傳管理產(chǎn)生影響。因此, 為了更好地保護(hù)圓口銅魚(yú)資源, 應(yīng)給予金沙江中下游圓口銅魚(yú)3個(gè)線粒體DNA譜系分支特別關(guān)注, 后續(xù)可在增加該物種的生物學(xué)特征和核基因多樣性等數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上, 綜合分析后確立金沙江中下游圓口銅魚(yú)的進(jìn)化顯著單元(Evolutionarily Significant Units, ESUs)和管理單元(Management Units, MUs)等保護(hù)單元。目前, 在進(jìn)行增殖放流時(shí), 應(yīng)提前做好親魚(yú)和放流仔魚(yú)個(gè)體的遺傳背景檔案的建立, 有助于更好的管理圓口銅魚(yú)自然種群的遺傳多樣性。同時(shí), 還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖圓口銅魚(yú)線粒體DNA序列的檢測(cè), 建立親魚(yú)和子代線粒體DNA基因庫(kù), 便于采用來(lái)自不同譜系分支的親魚(yú)進(jìn)行繁殖以確保養(yǎng)殖圓口銅魚(yú)遺傳多樣性不降低, 充分保存不同譜系分支的圓口銅魚(yú)資源。