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        基于高通量測序篩選lncRNAs在宮頸鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義

        2022-01-20 02:56:40陳艷霞梁凌云馬彩玲
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2021年35期

        陳艷霞 梁凌云 陳 冰 馬彩玲

        新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科 省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點實驗室,新疆烏魯木齊 830054

        宮頸癌是全球婦女第四大癌癥死因[1],中國宮頸癌每年新增98 900 例,死亡30 500 例[2]。新疆維吾爾族婦女的宮頸癌發(fā)病率是漢族的3~4 倍[3]。高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)的持續(xù)感染是導(dǎo)致宮頸癌的重要因素,HPV E6 和E7基因能使致癌基因激活和抑癌基因失活,誘導(dǎo)抗凋亡基因過表達(dá)[4]。然而,越來越多的證據(jù)表明,單純HPV感染不足以誘發(fā)正常宮頸惡性轉(zhuǎn)化,其有可能是其他基因的改變參與了宮頸惡變的過程[5-6]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長度大于200 個堿基的非編碼RNA,可調(diào)控基因表達(dá),參與多種生物學(xué)過程,在疾病的發(fā)病機制中起到重要作用[7]。前期對新疆維吾爾族宮頸癌及高級別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)組織進(jìn)行高通量測序分析,而關(guān)于lncRNAs(TOPORSAS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG、NR2F2-AS1)在宮頸癌中的表達(dá)及與宮頸癌患者臨床特征的關(guān)系研究少有或未有報道。因此,本研究探討lncRNAs 在宮頸癌組織中表達(dá)水平及其與臨床特征的關(guān)系,為進(jìn)一步揭示宮頸癌發(fā)病機制提供理論依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        收集2019 年6 月至12 月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院就診的80 例維吾爾族患者的宮頸組織,包括宮頸炎20 例、HSIL 20 例和宮頸鱗狀細(xì)胞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)40 例。每例取兩份組織,依據(jù)世界衛(wèi)生組織病理組織學(xué)標(biāo)準(zhǔn),由兩名病理科醫(yī)師獨立閱片。宮頸炎樣本取自同期因子宮肌瘤行子宮全切術(shù)的患者;CSCC 患者按2018 年FIGO 分級進(jìn)行臨床分期,其中37 例為廣泛子宮全切+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)后標(biāo)本、3 例為宮頸活檢標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①符合病理診斷;②CSCC 樣本取自首次診斷的患者。排除患有其他惡性腫瘤、妊娠、哺乳、免疫疾病及接受放化療的患者。CSCC 組年齡32~76 歲,平均(48.97±10.49)歲。HSIL 組年齡26~66 歲,平均(48.00±9.80)歲;宮頸炎組年齡27~55 歲,平均(44.75±8.67)歲。三組年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05),具有可比性。本研究經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn),參與研究者均簽署知情同意書。

        1.2 方法

        1.2.1 試劑與儀器 TRIzolTMReagent 購于ambion(NO.15596026);5X All-In-One RT MasterMix 購于ABM(NO.G492);EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-Low Rox 購于ABM(NO.MasterMix-EL)。引物由北京中美泰和公司合成,ABI7500 實時熒光定量PCR 儀由美國ABI 公司生產(chǎn)。

        1.2.2 總RNA 的提取 將組織從-80℃冰箱中取出,在液氮包圍下,研磨成粉,取50 mg 加入有1 ml TRLzol的離心管中,混勻。提取總RNA,檢測RNA 溶液A260及A280值,計算RNA 濃度和純度。A260/A280比值為1.8~2.0 可用于檢測,1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA 的完整性。

        1.2.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及Real-time PCR 反應(yīng) 采用GAPDH 作為內(nèi)標(biāo),反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為800 ng 總RNA、1 μl 反轉(zhuǎn)錄引物、1 μl 2×TS Reaction Mix、1 μl TransScript@RT/RI Enzyme Mix、1 μl gDNA Remover,加水至20 μl。反應(yīng)條件:25℃10 min,85℃5 s,將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 置于-80℃保存,后續(xù)熒光定量檢測的樣本cDNA 使用RNase-free Water 按照1∶1 的比例稀釋進(jìn)行反應(yīng)。以10 μl 反應(yīng)體系進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng),反應(yīng)體系包括1 μl cDNA 產(chǎn)物、5 μl 2×SYBR Green ⅠMaster mix,0.5 μl ROX、正反向引物各0.7 μl 和水,引物信息見表1。PCR 條件為95℃2 min后,95℃5 s、60℃30 s,61 個循環(huán)。每個標(biāo)本設(shè)3 個復(fù)孔,設(shè)陰性對照。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析目的基因(圖1)。記錄每個反應(yīng)管中的熒光信號到達(dá)設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即Ct 值,采用定量PCR 中的相對定量法,以N=2-△△Ct表示目的基因的表達(dá)水平。

        表1 引物信息

        圖1 PCR 產(chǎn)物鑒定電泳圖

        1.3 觀察指標(biāo)

        觀察lncRNAs(TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC0 0925、MIR155HG、NR2F2-AS1)在各組中的表達(dá)及MIR155HG 與宮頸癌臨床特征的關(guān)系。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

        采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間比較,采用單因素方差分析;兩組間比較采用t 檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)表示。以P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 不同病變宮頸組織lncRNAs 比較

        CSCC 組TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 表達(dá)高于宮頸炎組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05);CSCC 組TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC 00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 表達(dá)高于HSIL 組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。宮頸炎組和HSIL 組TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P >0.05)。見表2。

        表2 不同病變宮頸組織lncRNAs 比較()

        表2 不同病變宮頸組織lncRNAs 比較()

        注:與宮頸炎組比較,aP <0.05;與HSIL 組比較,bP <0.05。HSIL:高級別鱗狀上皮內(nèi)病變;CSCC:宮頸鱗狀細(xì)胞癌

        2.2 MIR155HG 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

        CSCC 患者腫瘤直徑>4 cm 的MIR155HG 表達(dá)高于腫塊直徑≤4 cm,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MIR155HG 表達(dá)高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。MIR155HG 表達(dá)與患者年齡、臨床分期、病理分級、浸潤肌層深度、宮頸旁浸潤及鱗狀細(xì)胞癌抗原無關(guān)(P >0.05)。見表3。

        表3 MIR155HG 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系()

        表3 MIR155HG 表達(dá)與宮頸癌患者臨床病理特征的關(guān)系()

        注:3 例為宮頸活檢標(biāo)本

        3 討論

        近年來,lncRNAs 在宮頸癌中的作用逐步被揭示[8]。本課題組前期高通量測序分析發(fā)現(xiàn),TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 在宮頸癌中可能作用于凋亡受體激酶BAK1、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白E1 和組蛋白去乙?;?0,故本研究在組織水平進(jìn)一步探討分析lncRNAs 的表達(dá)差異及臨床意義。本研究結(jié)果顯示,所分析的lncRNAs 在宮頸癌組織中表達(dá)上調(diào),與Liu 等[9]結(jié)果一致,且在其他腫瘤中TOPORS-AS1[10]、TMPO-AS1[11]、MIR155HG[12]和NR2F2-AS1[13]表達(dá)上調(diào)。

        研究顯示,誘發(fā)宮頸癌的主要危險因素是HRHPV 的持續(xù)感染[14],HPV16 是宮頸癌中最危險的因素。隨著宮頸病變分級的增加,HPV 感染率顯著增加[15]。對新疆維吾爾自治區(qū)人群HPV 感染分析顯示,HPV16是最主要的型別[16]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因1(metastasis related gene 1,MALAT1)被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中高表達(dá),宮頸癌細(xì)胞系敲低HPV16 E6/E7 后MALAT1 表達(dá)下降[17],提示宮頸癌發(fā)病中MALAT1 與HPV16 可能有協(xié)同作用。

        多種lncRNAs 異常表達(dá)與腫瘤的臨床病理特征相關(guān),如胃癌中ARAP1-AS1 上調(diào)與TNM 分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)[18];乳腺癌中NEAT1 表達(dá)顯著上調(diào),且NEAT1 表達(dá)水平升高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期呈正相關(guān)[19];肝癌中AOC4P 低表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期相關(guān)[20]。MIR155HG 參與了多種人類癌癥。MIR155HG 聯(lián)合其他lncRNAs 可作為預(yù)測腎透明細(xì)胞癌患者存活時間的生物標(biāo)志物[21]。MIR155HG基因可作為多種癌癥的預(yù)后標(biāo)志物,與免疫細(xì)胞浸潤密切相關(guān),對預(yù)測免疫抑制劑的治療效果具有重要價值[22]。多位學(xué)者從癌癥基因組圖譜分析MIR155HG 可能作為預(yù)測腫瘤患者生存期的獨立預(yù)后生物標(biāo)志物[23-24]。崔衛(wèi)娜等[25]在喉癌中研究顯示,MIR155HG 與TNM 分期、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。尚未見MIR1 55HG 與宮頸癌臨床特征研究的報道。本研究結(jié)果顯示MIR155HG 的表達(dá)與腫塊直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān)。MIR155HG 可能成為輔助判斷宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)的指標(biāo)之一。

        綜上所述,TOPORS-AS1、TMPO-AS1、LINC00925、MIR155HG 和NR2F2-AS1 在宮頸癌組織中表達(dá)明顯上調(diào),MIR155HG 的表達(dá)與腫塊直徑和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)相關(guān),MIR155HG 可能成為宮頸癌診斷及病情預(yù)測的標(biāo)志物。

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