汪海洋,朱格格,盧 嬋,程 超,2,李 偉,方 慶,2

(1.湖北民族大學 生物科學與技術學院,湖北恩施 445000;2.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室,湖北恩施 445000)

原核藻類(prokaryotic algae),兼有細菌和高等植物部分重要特性,如較快速的細胞分裂繁殖與光合作用產(chǎn)能等,在生物進化中地位特殊。其光合作用的主要細胞器是藻膽體(phycobilisome)。藍藻(blue green algae),即藍細菌,依靠藻膽體捕獲并傳遞光能,被認為是某些藻類和高等植物葉綠體的祖細胞[1-3]。構成上,藻膽體為多亞基蛋白與有色輔基等有序結合的超大分子復合物[4-5]。藻膽蛋白(phycobiliprotein)多由α/β兩類重要的亞基組成,而藻膽素(phycobilibins)即色基部分為開鏈四吡咯化合物。近年來,對藻膽體的作用機制及其體外有益活性研究較廣[4,6-9]。

目前,針對資源性藻藍蛋白研究[8,10-11]為該類型有機復合物或其單組分等深入開發(fā)運用提供了基礎。藻膽素包含多種類型,通常以共價硫醚鍵與藻膽蛋白中的多肽鏈結合,吸收和傳遞光能。一般認為,藻膽蛋白只有結合色基后才具有光能捕獲與能量轉換的活性。試驗表明藻膽蛋白的純度愈高,對自由基清除的能力愈強[8]。由此可見,藻膽素對藻膽蛋白的體外活性具有促進作用。而且藍藻含有4種藻膽素,互為同分異構體,在光能捕獲和轉化中的作用因自身結構而不同。這表明細胞內藻膽素的酶促合成存在差異。早期研究發(fā)現(xiàn),藻藍膽素(phycocyanobilin,PCB)是以血紅素IX為前體,經(jīng)藻藍素鐵氧還蛋白還原酶(Pcy A)的催化作用而形成[6]。

葛仙米(Nostoc sphaeroidesKützing),也被稱為天仙米,學名擬球狀念珠藻,屬藍藻門念珠藻目,是中國重要的食藥兩用的藍藻之一[12]。研究顯示,葛仙米富含人體必需的多種氨基酸及多糖等活性物質,具較重要的藥源功效等[10]。現(xiàn)今中國居民對健康的需求已進入新時期,深入研究與開發(fā)葛仙米資源具有重要意義[12-13]。本研究克隆葛仙米藻藍素鐵氧還蛋白還原酶關鍵基因Ns-Pcy A,在原核細胞中表達并探究其蛋白高級結構,為進一步深入了解和開發(fā)葛仙米藻藍膽素的細胞內合成作用奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

葛仙米鮮樣采自湖北恩施鶴峰。分子克隆用基本工具酶,載體等購于大連寶生物等公司(TaKaRa);引物由金斯瑞公司合成。

1.2 DNA的提取

葛仙米總DNA提取參考前述方法[14]。具體步驟包括:鮮樣經(jīng)無菌水沖洗4～5次,接種于固體培養(yǎng)基上,經(jīng)3～4次反復繼代消除其他雜菌,待成體細胞直徑長至約2.5 mm后,進行總DNA抽提。取0.1 mg鮮樣與800μL CTAB抽提液混勻,迅速研磨后65℃水浴30 min;離心5 min上清液置于新的離心管中,經(jīng)氯仿-異戊醇(24∶1)處理后取上清液異丙醇沉淀,75%的乙醇洗滌后晾干,含RNA酶的dd H2O溶解,于-20℃冰箱保存,備用。

1.3 PCR反應

PCR反應體系為:模板DNA 1μL,Go Tap G2 Green Master Mix 5μL,引物混合物1μL,補加dd H2O至10μL;反應程序為95℃3 min,95℃30 s,50℃30 s,72℃45 s,72℃5 min,16℃10 min,擴增循環(huán)數(shù)設為30。據(jù)Pcy A基因(O.lucimarinusCCE9901)同源序列分析葛仙米對應基因組(Locus,NZ_CP031941)中的目的基因序列,設計Ns-Pcy A基因的引物為:上游Ns-phyA-F-Nde1:GGCATATGTCATTTACTTCTATAC;下游Ns-phy A-R-EcoR1:GAATT CTTATTTTAATGTTGGGAG。

1.4 克隆目的基因DNA

目的DNA與p MD18-T連接,采用42℃熱激轉化法將重組載體導入大腸桿菌細胞。在含抗生素(Amp,100μg/m L)的固體LB培養(yǎng)基上篩選單菌落,挑取單菌落37℃培養(yǎng)14 h后進行質粒提取并測序。

1.5 表達載體構建

采用限制性內切酶EcoR I和NdeI分別對克隆目的基因的質粒DNA和p Cold I載體進行消化,然后回收基因片段和線性化的載體,進行T4 DNA ligase連接反應。連接體系轉化大腸桿菌細胞DH5α。再經(jīng)質粒提取和測序鑒定重組表達質粒。目的基因測序由上海生工公司完成。

1.6 序列與蛋白結構分析

對目的基因Pcy A編碼蛋白氨基酸序列,針對Nostoc種屬基因序列,NCBI(National Center for Biotechnology Information)在線比對BLAST和Clustalw(https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw)分析;采用MEGA構建基于Neighbor-Joining方法的系統(tǒng)進化樹;葛仙米Ns-Pcy A基因編碼蛋白結構分析采用Swiss-model(https://www.swissmodel.expasy.org/)基于序列相似性的分子模擬。

1.7 目的蛋白的表達

將測序正確的重組表達質粒導入表達菌株BL21細胞中,進行0.1 mmol/L IPTG誘導表達4～12 h,超聲破碎細胞(破碎功率為66 W,時間4～10 s,重復3次,間隔10 s),制備表達樣品進行SDS-PAGE分析。

2 結果與分析

2.1 葛仙米Ns-Pcy A基因克隆

以CTAB法提取葛仙米總DNA為模板進行特異引物的PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳(圖1-A)。結果顯示,參照DNA分子量標準(D1),目的基因泳道(K1)擴增得到1條長近800 bp的特異產(chǎn)物,與目的基因大小相符。

回收目的DNA,與載體p MD18-T連接。將連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌并挑取單菌落培養(yǎng),提取質粒進行Nde1/EcoR1雙酶切。瓊脂糖凝膠電泳顯示兩個正確克隆質粒(p1,p2)相較對照DNA分子質量標準(M1),均能夠切出2條DNA帶型,其中較小的近800 bp,p1與p2很可能為正確克隆(圖1-B)。測序分析顯示,擴增克隆DNA產(chǎn)物與GenBank中一段目的基因DNA(CP031941.1,區(qū)段為4 451 478～4 452 221)完全相同,全長744 bp,包含起始密碼和終止密碼(TAA)。其預編碼藻藍素鐵氧還蛋白還原酶基因(phycocyanobilin:ferredoxin oxidoreductase)。以上結果表明葛仙米Ns-Pcy A克隆成功。

2.2 Pcy A基因編碼蛋白與分子進化

Ns-Pcy A預編碼一含247個氨基酸的多肽鏈(Genbank,WP_118167897.1)。同源序列比對分析,發(fā)現(xiàn)該Ns-Pcy A與其他幾個同源蛋白氨基酸序列總相似性達95.66%,并為典型的富含半胱氨酸(7個Cysteine)蛋白(圖2“#”標示);相較點型念珠藻(Nostoc punctiforme)的藻藍素鐵氧還蛋白還原酶,Ns-Pcy A氨基酸序列中存在8個較為顯著的位點替換,包括N41D,Q121E,T131N and V196A等(黑色三角標示)(圖2)。分子進化樹顯示,葛仙米Ns-Pcy A很可能源于點型念珠藻,而在發(fā)狀念珠藻(Nostoc flagelliforme)和普通念珠藻(Nostoc commune)同源蛋白中形成明顯分支(圖3)。這預示藻藍素鐵氧還蛋白還原酶生物學功能在不同念珠藻中可能存在變異。

2.3 目的蛋白表達

為進一步研究葛仙米藻藍素鐵氧還蛋白還原酶,將目的基因Ns-Pcy A連接進入表達載體pCold I。提取連接轉化子質粒,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測,6個質粒(#1～#6)中第#4比對照#1略大,很可能為正確重組質粒。測序鑒定顯示,#4質粒目的基因序列處于載體pCold I上冷休克基因(csp A)啟動子下游,重組表達載體構建成功(圖4-A)。

目的基因Ns-Pcy A預編碼蛋白質分子質量大小為28.24 ku。將表達載體#4質粒轉入大腸桿菌BL21細胞經(jīng)0.1 mmol/L IPTG誘導,分離上清和沉淀蛋白。12%SDS-PAGE電泳如圖4-B顯示,目的蛋白相較標準蛋白Marker(Pm泳道),在29.0 ku附近有明顯積累(P4泳道),而對照(P1與P2泳道,未誘導大腸桿菌細胞樣品上清和沉淀裂解樣品)中沒有出現(xiàn)相應大小的蛋白條帶。目的蛋白在沉淀中較大量積累(P4泳道,箭頭標示),上清中存量較少(P3泳道),表明目的基因在大腸桿菌中能夠順利表達。

2.4 藻藍素鐵氧還蛋白還原酶Ns-Pcy A分子構型

蛋白肽鏈的分子內折疊是形成其高級結構進而發(fā)揮功能的基礎。高級結構模擬顯示,目的基因編碼蛋白Ns-Pcy A單分子主要包含α螺旋和β折疊等兩類主要的二級結構。α螺旋和β折疊進一步形成類似三面夾心的高級結構,其中5個α螺旋分布于外側;而8個β折疊處于螺旋形成的封閉空間中(圖5-B),形成疏水內核。Ns-Pcy A為富含半胱氨酸蛋白,其肽鏈中有4個半胱氨酸(從N端起第2至第5個半胱氨酸)分別分布于β折疊片層中(圖5-A)。膽綠素IV在藻藍素鐵氧還蛋白還原酶(Pcy A)作用下,還原D環(huán)與A環(huán)上的乙烯基團,從而形成藻藍膽素PCB.Ns-Pcy A這種夾式構型有利于底物和產(chǎn)物的及時錨定或釋放。

3 討論

葛仙米(Nostoc sphaeroidesKützing)是中國重要的食藥同源性原核藻類,在服務地域經(jīng)濟和社會發(fā)展方面其生物資源潛能亟待深入發(fā)掘[12-13]。作為輔基色素,藻藍膽素是一類線性四吡咯結構的化合物,在藻類細胞中具有捕獲和傳遞光能的功能[6,14-15]。這些同分異構體,因雙鍵位置不同,引致吸收光譜不同并在特定的條件下呈現(xiàn)不同的顏色。同分異構體存在,也表明此類色基合成的關鍵酶可能不同。藻藍膽素在細胞內合成的途徑已經(jīng)明確:血紅素IX經(jīng)氧化作用形成膽綠素IV,后者在藻藍素鐵氧還蛋白還原酶(Pcy A)作用下形成藻藍膽素PCB[16-17]。藻藍蛋白具有抗氧化、抗炎癥、抑腫瘤與強免疫等重要活性[10,18-19]。本研究成功克隆葛仙米藻藍素鐵氧還蛋白還原酶基因Ns-Pcy A,為進一步研究和開發(fā)葛仙米藻藍素等的生物資源奠定了重要基礎。

一般認為,藻藍膽素對藻藍蛋白體外活性具有促進作用。實際上,脫離多肽鏈的藻藍膽素清除自由基等活性已被證實。這為藻藍膽素和藻藍蛋白的深入開發(fā)提供了基礎[20-23]。生物體中,鐵氧還蛋白還原酶(Ferredoxin-NADP+Reductase,FNR)非共價鍵結合黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)輔基,并作為電子傳遞鏈中的重要組成部分,在眾多基礎代謝中發(fā)揮作用;其中,輔酶NADP+是FNR催化反應的先決條件,分子偶極矩表面電荷的分布和數(shù)量保證了FNR與Fd定向關聯(lián),其中氫鍵、鹽橋、范德華力及疏水作用起到穩(wěn)定蛋白構象和功能的作用[24-28]。依賴鐵氧還蛋白的膽色素還原酶氨基酸位點變異,或是其功能和進化的重要證據(jù)。藍藻中Pcy A家族酶類功能或活性可能已經(jīng)發(fā)生改變[29-30]。分子進化水平上,顯示Ns-Pcy A與幾個近源種內的同源蛋白譜系關系較近,為念珠藻的進化提供了分子證據(jù)[12]:即葛仙米可能是點型念珠藻的變異種,并以其為親本進一步衍生出普通念珠藻和發(fā)狀念珠藻。

Ns-Pcy A在體外功能有待深入研究。Pcy A蛋白第一個高分辨率的晶體模型被發(fā)現(xiàn),為了解和發(fā)現(xiàn)其功能提供了基礎[30-31]。筆者借助分子模擬發(fā)現(xiàn),盡管存在部分氨基酸位點替換,但葛仙米Ns-Pcy A蛋白仍能夠形成一α/β/α夾心式結構,其夾心空間及反向平行的β折疊片層利于底物和產(chǎn)物的及時錨定或釋放。因此,筆者認為這種夾心式結構為其活性提供了重要支撐。并且,Ns-Pcy A為富含半胱氨酸蛋白,因此能夠借助低電位鐵硫基團以加強對曝氧等的防御[32]。半胱氨酸可能對于Ns-Pcy A蛋白具有雙重意義:既能夠自我保護又能夠有利酶促底物反應進行。但是,Pcy A是否具備抑制某些超氧物氧化功能,需進一步鑒別?？傊?克隆葛仙米Ns-Pcy A基因,為了解和運用葛仙米藻藍蛋白輔基色素關鍵合成酶功能及提供了基礎。

4 結論

本研究克隆葛仙米藻藍素鐵氧還蛋白還原酶基因Ns-Pcy A,并在大腸桿菌中成功表達目的蛋白。序列和分子結構模擬分析顯示,Ns-Pcy A為富含半胱氨酸蛋白,其氨基酸肽鏈主要包含α螺旋和β折疊等二級結構,并以其分別建構蛋白親水外圍與疏水核心,從而形成三面夾心式高級構型。研究結果為進一步深入研究和開發(fā)葛仙米藻藍膽素細胞內合成提供了重要基礎。