謝婉靜， 楊玉凌， 黃逸安， 張昱雯*， 丁 晶*， 汪 昕

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，上海 200032 2.中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心，上海 200031

癲癇是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一，臨床表現(xiàn)為有持久的癲癇發(fā)作傾向，有發(fā)作性、短暫性、刻板重復(fù)的特點，其主要病理生理特征是神經(jīng)元異常同步化放電[1]。神經(jīng)元興奮性的維持依賴于各種離子通道的活動。內(nèi)向整流型鉀離子(Kir)通道是鉀離子通道家族的一類，具有介導(dǎo)鉀離子內(nèi)流效率高于鉀離子外流效率的內(nèi)向整流特性。目前已發(fā)現(xiàn)多種Kir通道與癲癇發(fā)生有關(guān)。Kir4.1電流及Kir4.1蛋白表達在顳葉癲癇患者和癲癇動物模型中均有明顯改變[2-4]；特異性敲除Kir6.2通道更容易在高熱驚厥動物模型中誘發(fā)癲癇發(fā)作[5]；Kir2通道在顳葉癲癇動物模型中表達升高[6]。

G蛋白耦聯(lián)的Kir(GIRK)通道是Kir通道的一類，在哺乳動物中主要存在GIRK1～4四種亞基[7]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中GIRK1～3亞基廣泛表達在大腦皮層、海馬等部位，主要分布在神經(jīng)元樹突棘和胞體上[8]。GIRK通道開放能使神經(jīng)元膜電位向超級化方向偏移，進而穩(wěn)定神經(jīng)元膜電位、調(diào)節(jié)神經(jīng)元放電頻率[9]。GIRK通道的功能異常與癲癇易感性相關(guān)，在戊四氮的誘導(dǎo)下，GIRK2亞基敲除的小鼠癲癇發(fā)作的潛伏期比野生型小鼠顯著縮短，發(fā)作程度更加嚴重[10]。GIRK通道抑制劑Tertiapin Q (TPQ)能增加離體神經(jīng)元在無鎂溶液中的癇樣放電頻率[11]，而GIRK通道激動劑能夠延長戊四氮誘導(dǎo)的小鼠癲癇發(fā)作的潛伏期[12-13]。目前，癲癇發(fā)作后GIRK通道表達改變尚缺少深入研究，其具體調(diào)控機制尚需闡明。本研究首先建立匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇模型，檢測癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus，SE)發(fā)作后急性期和慢性期海馬組織膜蛋白中GIRK通道表達的變化，并進一步在細胞癲癇模型中探討磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K) /蛋白激酶B( protein kinase B, PKB/Akt)通路在其中的可能機制，研究GIRK通道與癲癇發(fā)作之間的關(guān)系，為癲癇的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選擇8～12周體質(zhì)量為180～220 g的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(斯萊克實驗動物公司)用于匹羅卡品癲癇動物模型的構(gòu)建。氯化鋰、阿托品、匹羅卡品購自Sigma公司，地西泮購自上海旭東海普藥業(yè)有限公司，SDS-PAGE試劑盒購自碧云天公司，GIRK1、GIRK2抗體購自GeneTex公司，p-Akt(T308)、Akt抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇模型 先在大鼠腹腔注射氯化鋰溶液(127 mg/kg)以提高匹羅卡品的易感性。18～24 h之后，腹腔注射1 mg/kg阿托品阻斷外周膽堿能反應(yīng)，30 min后PILO組大鼠經(jīng)腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品，對照組大鼠經(jīng)腹腔注射等劑量生理鹽水。

根據(jù)Racine分級，對大鼠癲癇發(fā)作行為進行觀察和評級。將發(fā)作級別達到Ⅲ級以上，且持續(xù)發(fā)作時間超過30 min的發(fā)作認為是癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)，達到SE發(fā)作且未死亡的大鼠認為造模成功，達到SE發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)的動物給予1 mg/kg地西泮終止發(fā)作。

Racine分級標(biāo)準(zhǔn)[14]為Ⅰ級：流口水，咀嚼運動，面部肌肉抽搐；Ⅱ級：點頭運動，頸部肌肉抽搐；Ⅲ級：單側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級：雙側(cè)前肢陣攣，四肢強直性痙攣，且出現(xiàn)后肢站立；Ⅴ級：在Ⅳ級基礎(chǔ)上失去平衡，跌倒或伴翻滾、跳躍、尖叫。

1.3 蛋白提取 提取全蛋白時使用RIPA裂解液裂解組織，并加入蛋白酶抑制劑(Roche公司)和磷酸酶抑制劑(Roche公司)，充分勻漿組織后，4℃下10 000×g離心15 min，棄去底部組織塊沉淀，收集上清液。

提取膜蛋白時使用試劑盒(Biovision公司)中提供的裂解液和酶抑制劑，根據(jù)試劑盒說明書進行反復(fù)梯度離心和萃取，最終得到細胞膜蛋白沉淀，用0.5%TBST重懸。全單白和膜蛋白濃度均使用BCA試劑盒測量，將蛋白和5×loading buffer按照4∶1的比例混勻，全蛋白用95℃ 5 min進行蛋白變性，胞膜蛋白用45℃ 45 min進行蛋白變性。

1.4 Western印跡步驟 電泳：配置10%分離膠和濃縮膠，按照10 μg蛋白量上樣，在60 V電壓下恒壓電泳30 min，再將電壓改為120 V繼續(xù)電泳60 min。轉(zhuǎn)膜：在甲醇中浸泡3 min使PVDF膜活化，在轉(zhuǎn)膜液中按照黑色轉(zhuǎn)膜夾-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿-白色轉(zhuǎn)膜夾(即“黑膠白膜”)的順序組裝，倒入1 L轉(zhuǎn)膜液并放置冰盒，在冰浴條件下以280 mA的電流恒流轉(zhuǎn)膜80 min。封閉：將置于0.05%TBST配置的5%脫脂奶粉中，室溫條件下在慢速搖床上孵育2 h。一抗孵育：4℃孵育過夜。本文所用抗體濃度：p-Akt(T308) 1∶1 000，Akt 1∶1 000，GIRK1 1∶1 000，GIRK2 1∶1 000，GAPDH 1∶2 000。二抗孵育：用5%脫脂牛奶按照1∶10 000的比例配制相應(yīng)二抗，在室溫條件下孵育1.5 h。顯影：配置ECL發(fā)光液，均勻滴在膜上，避光條件下反應(yīng)2 min后，將膜放入顯影儀中選擇合適曝光時間進行曝光成像。

1.5 細胞電生理實驗 利用孕17～19 d SD大鼠的胎鼠進行原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)，選取體外培養(yǎng)至第14 d的神經(jīng)元進行電生理記錄。采用環(huán)噻嗪孵育48 h的方法建立細胞癲癇模型，同時用PI3K抑制劑渥曼青霉素與環(huán)噻嗪共孵育以觀察PI3K抑制劑對癇樣放電神經(jīng)元GIRK通道功能是否有影響。在電壓鉗模式下記錄神經(jīng)元Kir電流，將神經(jīng)元膜電位以-10 mV的梯度從-60 mV降低至-160 mV，時長為200 ms，記錄間隔在5 s以上。

2 結(jié) 果

2.1 海馬GIRK通道SE發(fā)作后不同時期的表達 共使用45只成年雄性SD大鼠進行匹羅卡品造模，以SE發(fā)作達到4級以上、持續(xù)發(fā)作時間達到30 min以上作為造模成功的判定標(biāo)準(zhǔn)，未達到SE發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)的大鼠有2只，造模失敗率為4.44%；達到SE發(fā)作標(biāo)準(zhǔn)的大鼠有43只。其中SE發(fā)作過程中及發(fā)作后24 h內(nèi)死亡大鼠有18只；而在SE后7 d至30 d死亡的大鼠有2只。

本研究首先對GIRK通道在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后急性期(24 h)海馬組織細胞膜上的表達情況進行檢測。隨機選取匹羅卡品造模成功且24 h內(nèi)未死亡的10只大鼠作為造模組(PILO 24 h組)，并選擇生理鹽水代替匹羅卡品注射的8只大鼠作為同期對照組(CON 24 h組)。PILO 24 h組大鼠海馬GIRK1亞基蛋白表達水平相對灰度值為0.771±0.234，與對照組(0.999±0.131)相比，顯著降低(P=0.026，圖1A、1C)。PILO組大鼠海馬GIRK2亞基蛋白表達水平相對灰度值為0.814±0.128，與對照組(1.039±0.157)相比，同樣有明顯的降低趨勢(P=0.004，圖1B、1D)。海馬內(nèi)GIRK1亞基和GIRK2亞基的表達水平在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后24 h較對照組有所下調(diào)。

圖1 海馬GIRK通道在匹羅卡品誘導(dǎo)SE發(fā)作后急性期的表達情況

本研究進一步對GIRK通道在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后慢性期(30 d)海馬組織細胞膜上的表達情況進行檢測。隨機選取匹羅卡品造模成功且至30 d未死亡的4只大鼠的海馬組織作為造模組(PILO 30 d組)，并選擇生理鹽水代替匹羅卡品注射的4只大鼠的海馬組織作為同期對照組(CON 30 d組)。PILO 30 d組大鼠海馬GIRK1亞基蛋白表達水平(0.841±0.041)與CON組(1.014±0.044)相比顯著降低(P=0.029，圖2A、2C)。PILO組大鼠海馬GIRK2亞基蛋白表達水平(0.821±0.064)與CON組(1.031±0.101)相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2B、2D)。因此，在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后慢性期，海馬內(nèi)GIRK1亞基表達水平均較對照組顯著下調(diào)。

因此，海馬GIRK通道亞基表達水平在大鼠SE發(fā)作后急性期和慢性期均有顯著降低。

圖2 海馬GIRK通道在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后慢性期的表達情況

2.2 PI3K/Akt通路在SE發(fā)作后不同時期的激活情況 在下丘腦POMC神經(jīng)元表面，GIRK通道的功能受胞內(nèi)PI3K/Akt通路的影響，推測SE發(fā)作后GIRK通道表達與功能的變化可能與PI3K/Akt通路相關(guān)。因此，本研究進一步檢測了大鼠SE發(fā)作后急性期和慢性期海馬PI3K/Akt通路的激活情況。隨機選取匹羅卡品造模成功且24 h內(nèi)未死亡的6只大鼠的海馬組織作為造模組(PILO 24 h組)，并選擇生理鹽水代替匹羅卡品注射的6只大鼠的海馬組織作為同期對照組(CON組)，用p-Akt(T308)與Akt蛋白表達水平的比值表示Akt的磷酸化程度，同時也表示PI3K/Akt通路的活化程度。經(jīng)數(shù)據(jù)歸一化處理后，PILO 24 h組大鼠海馬組織中p-Akt(T308)與Akt蛋白表達水平比值的相對灰度值為1.288±0.226，與CON組的相對灰度值0.956±0.190相比，有顯著差異(P=0.020，圖3A、3C)。該結(jié)果表明在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后的急性期，海馬GIRK通道的表達下降的同時伴隨著PI3K/Akt通路的激活。

本研究進一步對匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后慢性期海馬PI3K/Akt通路的激活情況進行檢測。隨機選取匹羅卡品造模成功且至30 d未死亡的4只大鼠的海馬組織作為造模組(PILO 30 d組)，并選擇生理鹽水代替匹羅卡品注射的4只大鼠的海馬組織作為同期對照組(CON組)。PILO 30 d組大鼠(n=4)海馬組織中p-Akt(T308)與Akt蛋白表達水平比值的相對灰度值為1.167±0.225，與CON組(n=4)的相對灰度值1.228±0.165相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3B、3D)。因此，在SE發(fā)作后慢性期，GIRK通道表達的改變可能與PI3K/Akt通路激活無關(guān)。GIRK通道在SE發(fā)作后急性期的表達下調(diào)伴隨著PI3K/Akt通路的激活，PI3K/Akt通路可能是SE發(fā)作后GIRK通道變化的調(diào)控因素。

圖3 PI3K/Akt通路在匹羅卡品誘導(dǎo)SE發(fā)作后不同時期激活情況

2.3 PI3K抑制劑對癇樣放電神經(jīng)元Kir電流無明顯作用 使用5 μmol/L環(huán)噻嗪(cyclothiazide, CTZ)孵育海馬神經(jīng)元48 h能夠使神經(jīng)元產(chǎn)生癲癇樣放電，是一種研究癇樣放電神經(jīng)元電生理活動的有效細胞癲癇模型。因此，本研究利用CTZ細胞癲癇模型探討PI3K/Akt通路是否對癲癇發(fā)作后GIRK通道的功能有所調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，5 μmol/L CTZ孵育海馬神經(jīng)元48 h后，海馬神經(jīng)元最大Kir電流水平(-492.80±57.85)pA，較正常海馬神經(jīng)元(-1 065.0±264.7)pA，明顯減少(P<0.05，圖4A、4B)，兩者I-V曲線也有顯著差異(P<0.05，圖4F)，證明CTZ孵育后海馬神經(jīng)元Kir電流顯著減少，癇樣放電神經(jīng)元GIRK通道功能降低。為探討PI3K/Akt通路是否能夠影響癇樣放電神經(jīng)元GIRK通道的功能，本研究利用常用的2種PI3K抑制劑(wortmannin、LY294002)檢測了CTZ組癇樣放電神經(jīng)元、CTZ+LY294002組海馬神經(jīng)元、CTZ+Wort組癇樣放電神經(jīng)元的Kir電流。結(jié)果顯示，CTZ組癇樣放電神經(jīng)元的最大Kir電流為(-492.80±57.85)pA(n=12)，CTZ+LY294002組癇樣放電神經(jīng)元的最大Kir電流為(-457.50±44.03)pA(n=12)，CTZ+Wort組癇樣放電神經(jīng)元的最大Kir電流為(-500.10±72.76)pA(n=10)，三者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C～4E)，三者I-V曲線比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4F)。兩組PI3K抑制劑對癇樣放電神經(jīng)元的Kir電流均未產(chǎn)生顯著影響，在CTZ誘導(dǎo)的癇樣放電神經(jīng)元中利用PI3K抑制劑調(diào)控PI3K/Akt通路對神經(jīng)元Kir電流沒有顯著改善。

圖4 PI3K抑制劑對癇樣放電神經(jīng)元Kir電流的影響情況

3 討 論

鉀離子通道參與了神經(jīng)元靜息膜電位的維持和動作電位復(fù)極化過程，是維持神經(jīng)元興奮性的重要因素，目前已發(fā)現(xiàn)多種與癲癇發(fā)生相關(guān)的鉀離子通道基因突變[15]。本研究建立了匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠癲癇發(fā)作模型，發(fā)現(xiàn)海馬組織膜蛋白GIRK通道亞基表達水平在匹羅卡品誘導(dǎo)大鼠SE發(fā)作后急性期下調(diào)，同時伴隨著PI3K/Akt通路的激活，而大鼠海馬組織膜蛋白GIRK通道亞基在SE發(fā)作后慢性期表達下調(diào)，但此時未發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路的激活。而在細胞癲癇模型中加用兩種PI3K抑制劑，均未發(fā)現(xiàn)對癇樣放電神經(jīng)元Kir電流有明顯作用。

研究[16]證實GIRK通道介導(dǎo)的電流占總Kir電流的40%左右，且癇樣放電神經(jīng)元GIRK通道介導(dǎo)的Kir電流較正常神經(jīng)元有所降低。癲癇發(fā)作之后海馬中GIRK通道亞基的基因表達有所改變，海馬齒狀回GIRK1亞基的mRNA含量在急性電驚厥性休克后降低，而在慢性電驚厥性休克后增加[17]。在海人酸誘導(dǎo)的癲癇大鼠海馬中也發(fā)現(xiàn)，在癲癇慢性期海馬齒狀回GIRK1亞基mRNA表達升高[18]。既往研究從基因水平和功能水平闡述GIRK通道在癲癇發(fā)作后的改變，本研究利用大鼠匹羅卡品癲癇模型進一步驗證了癲癇發(fā)作后海馬神經(jīng)元中GIRK通道表達水平的改變。

在海馬中GIRK通道僅在神經(jīng)元上表達，因此本研究所檢測的GIRK通道表達水平能反映海馬神經(jīng)元細胞膜表面GIRK通道亞基蛋白表達在癲癇發(fā)作后的變化。GIRK2亞基結(jié)構(gòu)中含有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸模體，在GIRK通道從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向細胞膜上轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮重要作用，并且GIRK2亞基在GIRK電流的形成過程中發(fā)揮重要作用[19]。GIRK1亞基雖因缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運輸模體而無法單獨形成功能性的離子通道，但GIRK1亞基C端Q404殘基是決定受體依賴的GIRK離子通道活性的關(guān)鍵因素，因此GIRK1亞基是調(diào)節(jié)GIRK通道功能的重要成分[20]。

癲癇發(fā)作后神經(jīng)元細胞膜上GIRK1亞基表達減少導(dǎo)致其對GIRK通道功能調(diào)節(jié)能力降低，可能是Kir電流在癲癇發(fā)作后降低的原因。在癇樣放電神經(jīng)元中，持續(xù)癲癇樣放電能夠引起caspase-3依賴的對GIRK1和GIRK2蛋白的切割，被切割后的蛋白失去裝配能力，使得GIRK通道與G蛋白結(jié)合能力下降[21]。因此，本研究推測神經(jīng)元表面GIRK1蛋白表達量在癲癇發(fā)作后急性期的下降可能是癲癇發(fā)作后GIRK1基因表達水平改變所致，而神經(jīng)元表面GIRK1蛋白表達水平在癲癇發(fā)作后慢性期的降低，可能因慢性期GIRK通道亞基在胞質(zhì)內(nèi)被切割，從而影響GIRK通道在膜上的表達量。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)匹羅卡品誘導(dǎo)癲癇發(fā)作后急性期的海馬中存在PI3K/Akt通路的激活。PI3K/Akt通路參與了多種細胞功能的調(diào)控[22]。編碼PI3K/Akt通路有關(guān)蛋白的基因(如PIK3R2、PIK3CA、AKT3等)突變會導(dǎo)致伴癲癇發(fā)作的皮質(zhì)發(fā)育不良等疾病[23-26]。在顳葉癲癇患者手術(shù)切除的病灶組織中也發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達量較非癲癇患者有所增高[27]。在海人酸杏仁核注射、海人酸腹腔注射、戊四氮腹腔注射等多種動物癲癇模型中，也存在癲癇發(fā)作后的PI3K/Akt通路激活[28-30]。在下丘腦POMC神經(jīng)元中，PI3K/Akt通路的激活抑制ORL-1受體介導(dǎo)的GIRK通道開放，進而減弱對神經(jīng)元的興奮性的抑制[31]。因此筆者推測癲癇發(fā)作后急性期PI3K/Akt通路的激活可能會影響海馬神經(jīng)元膜上GIRK通道的表達。PI3K能夠?qū)⒘字＜〈?4,5-二磷酸(PIP2)磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，PIP2與GIRK通道直接結(jié)合，促進GIRK通道與Gβγ蛋白的結(jié)合從而激活GIRK通道[32]，癲癇發(fā)作后PI3K/Akt通路的激活對神經(jīng)元細胞膜上PIP2的消耗可能會影響GIRK通道的功能。

本研究進一步利用細胞癲癇模型探究PI3K抑制劑是否能夠改變癲癇發(fā)作后神經(jīng)元GIRK通道的功能，驗證了CTZ孵育后海馬神經(jīng)元Kir電流減少，與之前報道[33]相符。有研究[16]表明，海馬神經(jīng)元中GIRK通道介導(dǎo)的電流約占總Kir電流的50%。因此本研究檢測了應(yīng)用PI3K抑制劑后癇樣放電神經(jīng)元總Kir電流的變化，以此反映PI3K抑制劑對癇樣放電神經(jīng)元GIRK通道功能的影響。然而，本研究發(fā)現(xiàn)wortmannin和LY294002對癇樣放電神經(jīng)元的Kir電流并未產(chǎn)生顯著影響。GIRK通道的功能受雌激素及雌激素受體調(diào)控[34]，在其他疾病中發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路的激活能調(diào)控表觀遺傳相關(guān)分子組蛋白H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶(KMT2D)，進而影響雌激素受體所介導(dǎo)的基因表達[35]，PI3K/Akt通道的激活可能通過雌激素受體間接影響GIRK通道的表達和功能。Jorwal等[11]發(fā)現(xiàn)癲癇發(fā)作后乳酸水平的變化可能對GIRK通道的功能有所影響，Hill等[36]也發(fā)現(xiàn)GIRK通道參與了腺苷受體A1R對癲癇后神經(jīng)元興奮性的調(diào)控，癲癇發(fā)作后GIRK通道功能調(diào)控的因素復(fù)雜，PI3K/Akt通路可能不是其功能調(diào)控的主要因素。

本研究發(fā)現(xiàn)，匹羅卡品誘導(dǎo)SE發(fā)作后急性期海馬GIRK通道的表達降低，可能與同期PI3K/Akt通路的激活有關(guān)，PI3K/Akt通路與癲癇發(fā)作后GIRK通道表達改變的關(guān)系需要進一步研究明確，GIRK通路在癲癇發(fā)作后的調(diào)控因素需要進一步探究。

利益沖突：所有作者聲明不存在利益沖突。