楊莉 黃嬌 彭媛 母立峰 劉福

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，四川 南充 637000)

乳腺癌是一種乳腺上皮組織惡性腫瘤，對女性生命健康有較大威脅[1-2]。目前，手術(shù)及放化療是治療乳腺癌的主要手段，其中順鉑是治療多種實(shí)體瘤的一線化療藥，但由于腫瘤細(xì)胞原發(fā)或繼發(fā)耐藥性的產(chǎn)生，以及順鉑具有較明顯的腎毒性、胃腸道反應(yīng)等，使其治療效果欠佳，目前臨床也將多西紫杉醇作為乳腺癌、卵巢癌等惡行腫瘤的一線用藥[3-4]。奈達(dá)鉑是日本研發(fā)的第二代鉑類抗腫瘤藥，具有抗癌譜廣、活性強(qiáng)、腎毒性小、胃腸道反應(yīng)低的特點(diǎn)，臨床研究證實(shí)其對宮頸癌、乳腺癌等實(shí)體腫瘤均有效[5-6]。然而，目前有關(guān)奈達(dá)鉑對乳腺癌的治療作用機(jī)制尚未統(tǒng)一。因此，本研究通過探討奈達(dá)鉑對乳腺癌細(xì)胞行為學(xué)的影響及可能的機(jī)制，旨在為臨床治療乳腺癌提供更多的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑 人乳腺癌MDA-MB-2311細(xì)胞株(貨號BNCC337893)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

奈達(dá)鉑(HY-13700，規(guī)格50 mg)購自美國MCE公司；DMEM-H培養(yǎng)基(GC3110-100ML)購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；3-2(4,5-二甲基噻唑-2)-2-四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)(1120-02-1)均購自美國sigma公司；蛋白提取試劑盒(BC3711-50T)、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(556547)均購自上海谷研實(shí)業(yè)有限公司；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)(ATA35203)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)(BYFG-70R-36053)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 aasociated X protein，Bax)(RM-9106)、E-鈣粘附蛋白(E-cadherin)(ACRO)、N-鈣粘附蛋白(N-cadherin)(M00403-FCZ)、Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)(BYFG-70R-11717)、髓樣細(xì)胞分化蛋白88(Myeloid differentiation primary response gene88，MyD88)(310748-T08)、核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(Nuclear factor-kappa B，NF-κB)(ATA33868)、白細(xì)胞介素(Interleukin-1β，IL-1β)(ATA31401)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)(ATA38860)、GAPDH(ABP57456)多克隆抗體、山羊抗兔HRP(SE12-0.1)二抗均購自北京索萊寶科技有限公司。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(型號NHD DYE1738)、酶標(biāo)儀(型號ELx800)購自美國Bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇MDA-MB-231細(xì)胞，培養(yǎng)于含10% FBS+90% DMEM-H培養(yǎng)基中，置于37℃飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中，每2～3天更換一次培養(yǎng)液，PBS清洗兩遍后，加入6 mL(/100 mm皿)胰酶，在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細(xì)胞剛有脫落時(shí)，吸除大部分胰酶，留約0.5 mL，移至培養(yǎng)箱消化，約2 min取出，加入10% FBS+90% DMEM-H培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 取1.2.1對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞，接種至96孔板(5×104個(gè)/孔)，當(dāng)細(xì)胞生長至60%～70%融合時(shí)換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞隨機(jī)分成5組：①空白對照組：只含MDA-MB-231細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。②陽性對照組：加入1 μmol/L多西紫杉醇[7]溶液，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。③奈達(dá)鉑低、中、高劑量組：分別加入32、64、96 μg/mL奈達(dá)鉑[8]溶液，培養(yǎng)細(xì)胞48 h。收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的MDA-MB-231細(xì)胞重懸并接種于96孔培養(yǎng)板(5×104個(gè)/孔)，均于培養(yǎng)12、24、48 h后向各孔加入20 μl MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去上清，加入150 μL DMSO，振蕩10 min。于490 nm處測定各孔細(xì)胞光密度(Optic density，OD)值，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對照組OD-實(shí)驗(yàn)組OD)/對照組OD×100%。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡情況 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的MDA-MB-231細(xì)胞，使用AnnexinV-FITC/PI雙染試劑盒及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，PBS溶液洗滌2次，棄上清，并調(diào)節(jié)濃度至1×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL細(xì)胞懸液加入5 μL的AnnexinV/PITC及10 μL的PI(20 μg/mL)混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力 取液態(tài)Matrigel基質(zhì)膠(50 μL，2.0 mg/mL)于Transwell小室上層，凝固30 min(37 ℃)，取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的MDA-MB-231細(xì)胞，接種至小室上層(3×103個(gè)/孔)，小室下層加入含10% FBS的培養(yǎng)基(600 μL)，孵育24 h。用棉簽擦除上層未遷移細(xì)胞，下層用甲醛溶液(4%)固定15 min；結(jié)晶紫染色(0.2%，20 min)，沖洗、封片。拍照、統(tǒng)計(jì)各組侵襲細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的MDA-MB-231細(xì)胞重懸并接種于24孔板(2.5×104個(gè)/孔)，待細(xì)胞鋪滿底部時(shí)，利用滅菌槍頭(10 μL)呈做“一”字劃痕，分別于0、24 h后顯微鏡下取點(diǎn)，觀察并拍照。以初始距離為對比，測量細(xì)胞遷移距離并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率(%)=(d0 h-d24 h)/d0 h×100%，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，取平均值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7 蛋白免疫印跡法檢測增殖、侵襲遷移、凋亡及TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)變化 取1.2.2各組培養(yǎng)48 h的MDA-MB-231細(xì)胞，每組均設(shè)6個(gè)重復(fù)，PBS洗滌2遍，冰上加裂解液，裂解30 min，離心取上清，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳分離，電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(95 mA電流)3 h，脫脂牛奶(5 %)封閉3 h，室溫封閉1 h，加入PCNA、caspase-3、Bcl-2、Bax、N-Cadherin、E-Cadherin、TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α、GAPDH抗體作為一抗，稀釋比均為(1∶1000)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，次日加入HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育2 h，顯色、顯影定影，分析各蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力比較 與空白對照組比較，12 h時(shí)各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率無顯著差異(P>0.05)，24、48 h時(shí)奈達(dá)鉑低、中、高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(均P<0.05)，呈劑量依賴性，且高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，奈達(dá)鉑低、中、高劑量各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，有時(shí)間依賴性，見圖1。

圖1 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率比較

2.2 各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況比較 與空白對照組[(8.66±1.29)%]比較，陽性對照組[(47.95±7.19)%]以及奈達(dá)鉑低[(16.77±2.52)%]、中[(33.73±5.06)%]、高劑量組[(48.25±7.23)%] MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，奈達(dá)鉑各組呈劑量依賴性，且高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡情況比較

2.3 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲情況比較 與空白對照組[(310.15±46.52)個(gè)]比較，陽性對照組[(125.83±18.87)個(gè)]以及奈達(dá)鉑低[(278.97±41.85)個(gè)]、中[(212.58±31.88)個(gè)]、高劑量組[(123.37±18.51)個(gè)]侵襲細(xì)胞數(shù)顯著減少(均P<0.05)，奈達(dá)鉑各組呈劑量依賴性，且高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖3。

圖3 各組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲情況比較(200×)

2.4 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移情況比較 與空白對照組[(43.16±6.47)%]比較，陽性對照組[(15.66±2.35)%]以及奈達(dá)鉑低[(35.98±5.38)%]、中[(22.01±3.30)%]、高劑量組[(15.37±2.31)%]細(xì)胞遷移率顯著降低(均P<0.05)，奈達(dá)鉑各組呈劑量依賴性，且高劑量組細(xì)胞遷移率與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖4。

圖4 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移情況比較(40×)

2.5 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與空白對照組比較，陽性對照組以及奈達(dá)鉑低、中、高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞Bcl-2、N-Cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、E-Cadherin蛋白表達(dá)顯著升高(均P<0.05)，奈達(dá)鉑各組呈劑量依賴性，且高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞PCNA、Bax、Bcl-2、E-Cadherin、N-Cadherin蛋白表達(dá)與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖5、表1。

表1 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

圖5 各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

2.6 各組MDA-MB-231細(xì)胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 與空白對照組比較，陽性對照組以及奈達(dá)鉑低、中、高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，奈達(dá)鉑各組呈劑量依賴性，且高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平與陽性對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖6、表2。

圖6 各組MDA-MB-231細(xì)胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

表2 各組MDA-MB-231細(xì)胞TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較

3 討論

乳腺癌是最常見乳腺導(dǎo)管上皮惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已成為全世界女性死亡的主要原因之一[9-10]。順鉑能損傷腫瘤細(xì)胞的DNA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但其反復(fù)應(yīng)用也易誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，嚴(yán)重影響治療效果[11-12]。奈達(dá)鉑即順-甘醇酸二氨合鉑，與順鉑比較，其毒副作用較小，治療乳腺癌有一定療效及安全性[13-14]。莫遠(yuǎn)群等[15]研究顯示，與順鉑+吉西他濱治療組比較，奈達(dá)鉑+吉西他濱治療組三陰性乳腺癌患者治療有效率升高，不良反應(yīng)顯著降低，且安全性較好。然而目前有關(guān)奈達(dá)鉑治療乳腺癌具體機(jī)制尚未統(tǒng)一。TLR4介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑主要是炎癥信號通路，與腫瘤關(guān)系密切[16-17]。張祥建等[18]研究顯示，由黃芪、黨參、白術(shù)等制成的凍干粉制劑可以通過抑制TLR4/NF-κB信號通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增加乳腺癌細(xì)胞對紫杉醇的化療敏感性。本研究通過體外培養(yǎng)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，分析奈達(dá)鉑對其生物學(xué)行為及TLR4/NF-κB通路的影響，旨在為臨床提高乳腺癌治療效果提供參考。

腫瘤發(fā)生和發(fā)展被認(rèn)為是細(xì)胞增殖與凋亡失衡、細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移等因素共同作用的結(jié)果[19]。PCNA能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞DNA復(fù)制，在癌變組織中呈高表達(dá)，Bcl-2能夠阻礙細(xì)胞皺縮、DNA是內(nèi)源性抗凋亡因子，Bax是人體最主要促凋亡基因，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程關(guān)鍵執(zhí)行者之一，處于凋亡途徑的核心環(huán)節(jié)[20-21]。E-cadherin、N-cadherin是上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化生物學(xué)過程的分子學(xué)標(biāo)志物，介導(dǎo)細(xì)胞連接作用，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，N-cadherin蛋白表達(dá)升高，胞間黏附作用減弱，進(jìn)一步促使細(xì)胞向周邊組織侵襲、轉(zhuǎn)移[22]。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，24、48 h時(shí)奈達(dá)鉑低、中、高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，呈劑量依賴性；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，奈達(dá)鉑低、中、高劑量各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制率顯著升高，呈時(shí)間依賴性。與空白對照組比較，48 h時(shí)奈達(dá)鉑低、中、高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率、Bax、E-cadherin蛋白水平顯著升高，侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞遷移率及PCNA、Bcl-2、N-cadherin蛋白水平顯著降低，有劑量依賴性。這說明奈達(dá)鉑可能抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲及遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

TLR4/NF-κB是一條炎癥信號通路，與TLR4相應(yīng)配體如內(nèi)毒素結(jié)合后再與MyD88的C末端鏈接形成復(fù)合體，進(jìn)一步使復(fù)合體發(fā)生磷酸化反應(yīng)，使NF-κB激活處于游離狀態(tài)，進(jìn)而透過核膜從胞質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)，促使IL-1β、TNF-α等發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄。炎癥因子又可反作用于信號分子TLR4，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)循環(huán)往復(fù)，造成DNA不可逆損傷或突變，使腫瘤細(xì)胞增殖[23-24]。張祥建等[25]研究顯示，扶正類中藥(黃芪、黨參、白術(shù)等)制備而成的凍干粉制劑可抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性，可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路活化有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組比較，奈達(dá)鉑低、中、高劑量組MDA-MB-231細(xì)胞TLR4、MyD88、NF-κB、IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著降低，呈劑量依賴性，與既往相關(guān)研究結(jié)果一致。這說明奈達(dá)鉑可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲及遷移并誘導(dǎo)凋亡，可能是通過抑制TLR4/NF-κB通路活化實(shí)現(xiàn)的。但本研究未能明確TLR4/NF-κB通路在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的具體作用機(jī)制，后期仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

奈達(dá)鉑可能通過抑制TLR4/NF-κB通路活化抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖、侵襲及遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。