劉娟 彭洪 吳洪 柏丹 舒子龍 屈艷 敬劍英 楊淑娟

(1. 南充市中心醫(yī)院肛腸外科，四川 南充 637000；2.南充市中心醫(yī)院胃腸外科, 四川 南充 637000；3.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科, 四川 南充 6370004；4.南充市中心醫(yī)院產(chǎn)科，四川 南充 637000)

結直腸癌不僅是全球第三大最常見惡性腫瘤，也是全球第四大癌癥死亡原因，嚴重威脅著人類健康[1]。盡管結直腸癌的治療取得了很多新進展，但距患者期盼仍有很大差距，因此深入了解腫瘤發(fā)生的分子機制及尋找新的治療靶點已是目前臨床研究熱點。

RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBP)是一類重要的細胞蛋白，其可通過識別特異性的RNA結合域與RNA相互作用，廣泛參與多種轉錄后調(diào)控，如RNA剪切、轉運、序列編輯、細胞內(nèi)定位和翻譯控制等[2-3]。RBP與多種人類疾病相關，并參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4-7]。長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，IncRNA)是一類長度大于200核苷酸的RNA分子，占人類基因組的70%[8]。過去IncRNA曾被認為是基因組RNA中的轉錄噪聲，但是越來越多研究表明IncRNA在表觀遺傳、轉錄或轉錄后水平對基因表達具有調(diào)控作用[9-12]，并且IncRNA在多種惡性腫瘤中表達異常，并參與腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和轉移等多種生物學過程[13-15]。IncRNA的異常表達與腫瘤的進展，包括臨床病理特征和生存率之間存在顯著相關性，這表明IncRNA可作為各種惡性腫瘤的分子標志物[16]。

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)預后具有高度的異質性，而既往研究表明RBP和IncRNA均可作為CRC診斷和預后的分子標志物，因此可用于預測CRC患者的預后，并可以作為潛在的治療靶點。本研究擬構建結直腸癌RBP相關IncRNA預后模型，旨在為改善CRC患者的預后及臨床治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1 資料 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)獲取398例結直腸癌組織標本與39例正常組織標本(結直腸癌旁正常組織)轉錄組數(shù)據(jù)與臨床數(shù)據(jù)。從(https://ebiac.uk/GOA/)獲取RBP相關基因。本研究的所有數(shù)據(jù)都在網(wǎng)上公開，并且本研究不需要在人類或動物身上進行實驗。

1.2 差異表達基因的數(shù)據(jù)處理 通過R軟件分析結直腸癌組和正常組樣本之間的RBP基因，篩選出腫瘤和正常樣本中差異表達的RBP基因。

1.3 差異表達基因的GO富集分析 GO(Gene ontology)分析是大規(guī)?；蚬δ芨患治龅某Ｓ梅椒?，基因功能分為生物過程(Biological processes，BP)、細胞成分(Cellular components，CC)和分子功能(Molecular functions，MF)。利用R 4.0.3 clusterProfiler程序包進行基因功能富集分析，并繪制條形圖和氣泡圖，P<0.05為結果有統(tǒng)計學意義。

1.4 RBP相關IncRNA的篩選 采用Pearson相關性分析篩選與RBP差異表達基因相關的IncRNA，滿足R2>0.4,P<0.001的IncRNA被認為是RBP相關IncRNA。

1.5 數(shù)據(jù)初篩 刪除在CRC患者中生存時間少于30 d以及臨床數(shù)據(jù)缺失的患者，最后進行生存分析的數(shù)據(jù)集包括355例CRC患者的RBP相關基因表達數(shù)據(jù)和臨床資料。再利用R軟件中caret程序包將用于預后分析的355例TCGA的HCC數(shù)據(jù)集樣本按50%與50%的比例分為訓練集(n=178)和內(nèi)部驗證集(n=177)。

1.6 預后RBP相關IncRNA的鑒定 應用單因素回歸分析、Lasso分析和多元回歸分析等方法探討RBP相關IncRNA與患者OS的相關性。在單因素Cox回歸分析中，當P<0.05時該IncRNA被視為候選預后RBP相關IncRNA，接下來再進行Lasso分析和多元回歸分析以進一步篩選。

1.7 風險評分公式的建立 將篩選后的三個RBP相關lncRNA用于構建預后模型，使用風險評分公式計算風險評分，風險評分公式：Risk Score(patient) = Σi Coefficient(lncRNAi) ×Expression(lncRNAi)。coef值是通過多因素 Cox 回歸分析得到的回歸系數(shù)；患者RBP相關lncRNA表達量定義為expr lncRNA。

1.8 預后模型有效性驗證 根據(jù)三個RBP相關lncRNA表達水平分別計算訓練集和測試集中每個患者的風險得分，按照風險評分的中位值將患者分為低風險組和高風險組，同時進行ROC、Kaplan-Meier曲線和獨立預后分析，篩選獨立的預后因素，包括年齡、性別、分級、TNM分期和風險值高低。接下來納入所有的獨立預后因素，構建建諾模圖預測結直腸癌患者1、2、3年生存率并繪制標準曲線。

2 結果

2.1 差異表達的RBP基因的鑒定 從結直腸癌組和正常組樣本中共獲得493個差異表達的RBP基因，其中327個基因表達上調(diào)，166個基因表達下調(diào)，見圖1。

圖1 差異表達的RBP基因的熱圖和火山圖

2.2 RBP差異基因功能富集 GO富集分析的BP、CC和MF部分各選擇了前10個最相關的功能。對于上調(diào)表達的RBP差異基因，基因功能主要富集在lncRNA加工，核糖體合成，rRNA代謝過程，rRNA加工，核酸磷酸二酯鍵水解，RNA定位，前核糖體，細胞質核糖核蛋白顆粒，RNA生物催化活性，核酸酶活性等。下調(diào)表達的RBP差異基因主要在細胞酰胺代謝過程調(diào)控，翻譯調(diào)控，RNA剪接，mRNA代謝過程調(diào)控，RNA分解代謝過程，mRNA分解代謝過程，細胞質核糖核蛋白顆粒，核糖核蛋白顆粒，核斑點，RNA生物催化活性，mRNA 3,-UTR結合等功能方面富集，見圖2～3。

圖2 上調(diào)表達RBP差異基因GO富集分析

圖3 下調(diào)表達RBP差異基因GO富集分析

2.3 RBP相關基因-IncRNA共表達網(wǎng)絡的構建 差異表達的493個RBP相關基因與lncRNA進行相關性分析，相關系數(shù)大于0.4的lncRNA被認為是RBP相關lncRNA，共有994個lncRNA被鑒定為RBP相關lncRNA。

2.4 與預后相關的RBP相關lncRNA的確定 通過單因素回歸分析、Lasso回歸分析和多元回歸分析等方法對預后相關的RBP相關lncRNA進行鑒定，最終有3個RBP相關lncRNA用于構建預后模型，并構建RBP相關差異基因-lncRNA交互網(wǎng)絡，見圖4～5。

圖4 CRC中3個IncRNA與RBP差異表達基因共表達網(wǎng)絡圖

圖5 3個預后相關lncRNA的生存曲線圖

2.5 建立預后模型 使用多變量Cox風險回歸模型計算3個RBP相關lncRNA風險系數(shù)(表1)，用于計算風險得分的風險公式如下：風險分數(shù)=0.186822דNKILA”表達量+0.181553דLINC02474”表達量+0.660613דZEB1-AS1”表達量。

表1 3個RBP相關lncRNA多因素Cox回歸分析

2.6 預后模型分析 根據(jù)風險評分結果，3個RBP相關lncRNA在高分組和低分組的表達明顯不同，并且表達水平愈高風險得分愈高，致死率也愈高。KaplanMeier生存曲線顯示，高風險組的OS明顯差于低風險組。此外，ROC分析表明，該模型可以較為有效地預測患者1、2、3年的OS(1、2、3年AUC分別為0.730、0.712、0.772)，見圖6。

圖6 訓練集預后模型分析

2.7 預后模型與臨床特征的關系 使用單因素Cox回歸和多因素Cox回歸分析風險評分與臨床病理特征的關系。單因素Cox回歸分析表明腫瘤分級、TNM分期和風險評分與CRC患者OS顯著相關，多因素Cox回歸分析表明年齡、腫瘤大小和風險評分是獨立預后因子，見圖7。

圖7 預后模型與臨床特征的關系

2.8 諾模圖的構建 根據(jù)患者的臨床特征，將臨床性狀進行二分類(如年齡分為<65歲及≥65歲)構建諾模圖，并繪制諾模圖的標準曲線。結果表明諾模圖預測1年和2年生存率優(yōu)于3年生存率，因為在1年和2年生存率預測中，實際和預測的生存率相差較小。根據(jù)標準曲線表明這個模型對結直腸癌患者預后的預測具有比較大的優(yōu)勢，見圖8。

圖8 諾模圖可預測患者生存率

2.9 內(nèi)部驗證 內(nèi)部驗證集中的177例CRC患者按照風險評分的中位值將患者分為低分組和高分組，結果表明3個RBP相關lncRNA表達水平在高分組中明顯高于低分組，表達水平愈高風險得分愈高。KaplanMeier生存曲線顯示，高風險組CRC患者的OS明顯差于低風險組。ROC分析結果表明，1、2和3年AUC分別為0.735、0.769、0.777，說明該模型可以較為有效地預測患者1年、2年和3年的OS，同訓練集中的預測結果相似，見圖9。

圖9 驗證集預后模型分析

單因素Cox回歸分析表明腫瘤分級、腫瘤侵潤程度、淋巴結轉移和風險評分與CRC患者OS顯著相關，多因素Cox回歸分析表明風險評分是獨立預后因子，見圖10。

圖10 預后模型與臨床特征的關系

3 討論

基因組的大部分被轉錄成非(蛋白質)編碼的RNA片段，其中l(wèi)ncRNAs在細胞中占轉錄產(chǎn)物的絕大多數(shù)，它們控制著轉錄、剪接、RNA穩(wěn)定性和翻譯等細胞進程[17]。RBP可動態(tài)協(xié)調(diào)各種RNA的成熟、運輸和穩(wěn)定性[18]，如與68KDa有絲分裂相關的SRC(SAM68)是RNA結合蛋白STAR家族(Signal transduction and RNA metabolism activation)的一員，它參與mRNA代謝的幾個步驟如轉錄、選擇性剪接和核輸出。此外SAM68與細胞對刺激的反應、細胞周期轉換和病毒感染所需的信號轉導通路相關[19-20]。TARBP2在轉移性乳腺癌患者中過表達，其異常激活可通過影響靶mRNA的穩(wěn)定性而促進乳腺癌的進展，還可以增強乳腺癌患者對三苯氧胺的耐藥性[21-22]。因此RBP表達水平或功能的改變可產(chǎn)生重要的影響。然而到目前為止只有少數(shù)與癌癥相關的lncRNAs可與RBP相互作用參與腫瘤進展。因此，本研究對RBP相關IncRNA與CRC預后的關系進行了深入分析。對CRC中表達的RBP基因進行綜合分析，共鑒定出503個差異表達的RBP基因，其中327個基因表達上調(diào)，166個基因表達下調(diào)。對于上調(diào)表達的RBP差異基因，基因功能主要富集在ncRNA加工，核糖體合成，rRNA代謝過程，下調(diào)表達的RBP差異基因主要在細胞酰胺代謝過程調(diào)控，翻譯調(diào)控，RNA剪接，mRNA代謝過程調(diào)控，RNA分解代謝過程等功能方面富集。進一步構建了RBP相關基因-IncRNA共表達網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)994個lncRNA被鑒定為RBP相關lncRNA。通過單因素回歸分析、Lasso分析和多元回歸分析等方法最終選擇了LINC02474, NKILA,和ZEB1-AS1作為評估CRC預后的RBP相關lncRNA，并推算出風險公式(風險分數(shù)=0.186822דNKILA”表達量+0.181553דLINC02474”表達量+0.660613דZEB1-AS1”表達量)。對TCGA數(shù)據(jù)集進行篩選后根據(jù)數(shù)據(jù)集風險評分的中值將所有患者分為高風險組和低分險組，訓練集和驗證集中低分險組的OS均優(yōu)于高風險組。ROC分析顯示本風險模型預測訓練集中CRC患者1、2、3年OS的AUC分別為0.730、0.712、0.772，驗證集則分別為0.735、0.769、0.777。并且單因素和多因素Cox回歸分析證實風險評分與CRC患者的OS顯著相關，表明風險評分是預測CRC患者預后的獨立指標。這些結果表明基于LINC02474, NKILA,和ZEB1-AS1的風險評分可以準確預測結直腸癌患者的預后。本研究中還建立了基于預后特征和臨床因素的諾模圖模型，結果表明諾模圖預測CRC患者1，2，3年生存率具有較好的性能，進一步證明了風險評分在預測CRC患者長期預后方面的可靠性。

本研究發(fā)現(xiàn)LINC02474, NKILA,和ZEB1-AS1這3個RBP相關IncRNA都與腫瘤有關， ZEB1-AS1在CRC組織中高表達，其表達水平與CRC患者OS和無復發(fā)生存率顯著相關。ZEB1-AS1可促進CRC細胞增殖并抑制細胞凋亡，其可能是通過抑制細胞周期抑制蛋白p15發(fā)揮作用[23]。并且ZEB1-AS1在肝癌組織和細胞中表達上調(diào)，其可通過靶向抑制miR-23c促進肝癌細胞的增殖和侵襲[24]。對于NKILA的研究表明NKILA可通過使T細胞對活化誘導的細胞死亡敏感來促進乳腺癌免疫逃逸，NKILA的過表達與細胞凋亡水平降低及患者生存期縮短相關，提示NKILA可作為抗腫瘤免疫治療的作用靶點[25]。但是LINC02474在腫瘤方面的研究還不夠深入，只有Wang等[26]的研究報道LINC02474是CRC患者預后相關的lncRNA，但其具體作用機制尚需進一步研究。

4 結論

本研究成功構建了結直腸癌RBP相關IncRNA預后模型，發(fā)現(xiàn)3個RBP相關IncRNA(LINC02474,NKILA,ZEB1-AS1) 可能是CRC的預測因子，并與CRC的發(fā)生、發(fā)展相關，為CRC的治療開辟了新的視角。LINC02474,NKILA,ZEB1-AS1等基因已被證實能影響腫瘤的進展，并有可能用于靶向治療。但是LINC02474,NKILA和ZEB1-AS1在結直腸癌細胞和動物中的研究較少，其具體作用機制也不明確，因此還需要更多的臨床數(shù)據(jù)及更深入的機制研究支持本研究的結論。