古麗那扎爾 李倩 米娜瓦爾·胡加艾合買提 吳雷琪 阿加爾古麗·依米提

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，新疆 烏魯木齊 830054)

1 材料與方法

1.1 主要材料 人肺動脈平滑肌細胞(Human pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMCs)購自寧波明舟生物科技有限公司；平滑肌細胞專用培養(yǎng)基購自北京裕恒豐科技有限公司；P22phox siRNA序列(si- P22phox)、siRNA陰性對照(si-NC)、KLF4過表達載體(oe- KLF4)及其陰性對照(oe-NC)購自武漢金開瑞生物工程有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CCK-8試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；EdU細胞增殖檢測試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；2xSYBR Green qPCR MasterMix購自美國Bimake；P22phox抗體和KLF4抗體購自英國Abcam；GAPDH抗體購自美國GeneTex。

1.2 細胞培養(yǎng)及缺氧處理 將凍存的HPASMCs取出，37℃溫水快速解凍，800 rpm離心3 min后，棄去細胞上清液。含10% FBS的平滑肌細胞專用培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，常氧組細胞置于37℃、21% O2、5% CO2、74% N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。缺氧組細胞置于37℃、3% O2、5% CO2、92% N2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集常氧培養(yǎng)的細胞及缺氧處理24 h的細胞進行后續(xù)實驗操作。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)期生長的HPASMCs接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，其中每孔細胞數(shù)量為5×105個。細胞于常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去細胞舊培養(yǎng)基，重新添加含10% FBS的平滑肌細胞專用培養(yǎng)基，將細胞隨機分為空白對照組(不進行轉(zhuǎn)染操作)、si-NC+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC和oe-NC)、si-P22phox+oe-NC組(轉(zhuǎn)染si-P22phox和oe-NC)和si-P22phox+oe-KLF4組(轉(zhuǎn)染si-P22phox和oe-KLF4)，根據(jù)LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染操作。細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將細胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h，隨后進行后續(xù)實驗操作。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞活力 將對數(shù)期生長的HPASMCs接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，其中每孔細胞數(shù)量為5×103個。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)1.3所示進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染48 h后，細胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h。隨后根據(jù)CCK-8試劑盒說明書所示，向每孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液，細胞置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm處的光密度(OD)值。

1.5 EdU實驗檢測細胞增殖能力 將對數(shù)期生長的HPASMCs接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，其中每孔細胞數(shù)量為5×103個。細胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，根據(jù)1.3所示進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染48 h后，細胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h。棄去細胞舊培養(yǎng)基，加入50 μmo/L EdU的培養(yǎng)基37℃孵育2 h。4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min。2 mg/mL的甘氨酸，室溫孵育5 min，PBS清洗細胞。0.5% TritonX-100室溫孵育10 min后，PBS清洗細胞。加入1×Apollo染色反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min后，棄去反應(yīng)液，加入0.5% TritonX-100清洗細胞，DAPI染核。熒光顯微鏡觀察細胞發(fā)光情況。紅色熒光為EdU陽性著色，藍色熒光為DAPI陽性著色。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 將對數(shù)期生長的HPASMCs接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，其中每孔細胞數(shù)量為5×105個。按照1.3所示進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染48 h后，用槍頭沿著直尺垂直于培養(yǎng)板劃線，PBS清洗細胞，重新加入無血清平滑肌細胞專用培養(yǎng)基，顯微鏡觀察并拍照，此為0 h圖片。細胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h后，顯微鏡觀察并拍照，此為24 h圖片。Image J軟件分析細胞劃痕面積，細胞劃痕愈合率(%)=(1-劃痕面積24 h/劃痕面積0 h)×100%。

1.7 Transwell實驗檢測細胞遷移 將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板中。無血清平滑肌細胞專用培養(yǎng)基重懸HPASMCs，取2×104個HPASMCs接種于Transwell小室中，下室加入800 μL含10% FBS的平滑肌細胞專用培養(yǎng)基。細胞置于缺氧條件下培養(yǎng)24 h后，取出小室，800 μL 4%多聚甲醛室溫固定30 min。1%結(jié)晶紫染液室溫染色20 min。PBS清洗細胞，顯微鏡觀察計數(shù)。

1.8 qRT-PCR檢測細胞P22phox和KLF4 mRNA表達 收集轉(zhuǎn)染后的HPASMCs，Trizol法提取細胞總RNA。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書所示，將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄操作，得到cDNA。按照2xSYBR Green qPCR MasterMix使用說明書所示，進行qRT-PCR實驗。qRT-PCR反應(yīng)程序為：95℃ 2 min；95℃ 15 s，58℃ 15 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。以GAPDH mRNA表達量為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算P22phox和KLF4 mRNA表達。實驗所需引物見表1。

表1 qRT-PCR實驗所需引物序列

1.9 Western blot檢測細胞P22phox和KLF4蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后的HPASMCs，加入蛋白裂解液重懸細胞，冰上裂解細胞30 min。12000 rpm離心20 min收集細胞上清液，BCA法測定上清液蛋白濃度。取25 μg蛋白加入加樣孔中，進行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，進行轉(zhuǎn)膜操作，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5% BSA室溫孵育2 h。加入P22phox抗體(1∶2000)、KLF4抗體(1∶1000)和GAPDH抗體(1∶2000)，4℃條件下孵育過夜。加入特異性二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。PVDF膜經(jīng)清洗后，向膜上均勻滴加ECL發(fā)光液，暗室曝光。以GAPDH為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對PASMCs增殖的影響 CCK-8實驗和EdU實驗檢測細胞活力和增殖能力，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細胞活力顯著升高，EdU+細胞數(shù)顯著升高(均P<0.05)，見圖1。

圖1 缺氧對肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

2.2 缺氧對PASMCs遷移的影響 細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細胞劃痕愈合率顯著升高，遷移細胞數(shù)顯著升高(均P<0.05)，見圖2。

圖2 缺氧對PASMCs遷移的影響

2.3 缺氧對PASMCs中P22phox和KLF4表達的影響 qRT-PCR和Western blot檢測細胞中P22phox和KLF4表達，結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧組細胞中P22phox和KLF4 mRNA表達顯著升高，P22phox和KLF4蛋白表達顯著升高(均P<0.05)，見圖3。

圖3 缺氧對肺動脈平滑肌細胞P22phox和KLF4表達的影響

2.4 敲低P22phox對缺氧肺動脈平滑肌細胞中KLF4表達的影響 qRT-PCR和Western blot檢測細胞中P22phox和KLF4表達，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC組細胞P22phox和KLF4 mRNA表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，P22phox和KLF4 蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與si-NC+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-NC組細胞P22phox和KLF4 mRNA表達顯著降低，P22phox和KLF4 蛋白表達顯著降低(均P<0.05)；與si-P22phox+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-KLF4組細胞P22phox mRNA和蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，KLF4 mRNA和蛋白表達顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 敲低P22phox對缺氧肺動脈平滑肌細胞中KLF4表達的影響

2.5 P22phox/ KLF4軸對缺氧肺動脈平滑肌細胞增殖的影響 CCK-8實驗和EdU實驗檢測細胞活力和增殖能力，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC組細胞活力表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，EdU+細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與si-NC+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-NC組細胞活力顯著降低，EdU+細胞數(shù)顯著降低(均P<0.05)；與si-P22phox+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-KLF4組細胞活力顯著升高，EdU+細胞數(shù)顯著升高(均P<0.05)，見圖5。

圖5 P22phox/ KLF4軸對缺氧肺動脈平滑肌細胞增殖的影響

2.6 P22phox/ KLF4軸對缺氧肺動脈平滑肌細胞遷移的影響 細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測細胞遷移，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC組細胞劃痕愈合率和遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與si-NC+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-NC組細胞劃痕愈合率和遷移細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)；與si-P22phox+oe-NC組相比，si-P22phox+oe-KLF4組細胞劃痕愈合率和遷移細胞數(shù)顯著升高(P<0.05)，見圖6。

圖6 P22phox/ KLF4軸對缺氧肺動脈平滑肌細胞遷移的影響

3 討論

PAH血管功能障礙的主要特征包括血管收縮、血管壁重塑和原位血栓形成，從而導(dǎo)致肺血管阻力增加。血管病變主要通過內(nèi)膜增生、中膜肥大、外膜增生、炎癥、血栓形成和叢狀病變的發(fā)展影響遠端肺動脈[7]。缺氧誘導(dǎo)的PASMCs的過度增殖和遷移被認為是干預(yù)PAH相關(guān)血管重塑的一個有前途的靶點[8-9]，因此有必要研究PASMCs增殖和遷移相關(guān)的分子機制，以期為開發(fā)PAH治療靶點提供新的科學(xué)資料。

內(nèi)皮細胞和其他血管細胞中的超氧化物歧化酶和過氧化氫等活性氧的一個主要來源是NOX家族。這個蛋白家族的第一個成員NOX2與P22phox一起形成細胞色素b558，作為NOX的催化核心[10]。目前的研究結(jié)果表明，對氧磷可通過上調(diào)血管中P22phox的表達導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙[11]。Pena等[12]的研究結(jié)果顯示，慢性間歇性低壓缺氧可誘導(dǎo)大鼠心肌組織中P22phox表達上調(diào)， P22phox可能在缺氧誘導(dǎo)的相關(guān)病理生理過程中發(fā)揮重要作用。已有相關(guān)的證據(jù)顯示，P22phox在缺氧條件下可促進人微血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管生成。體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，低氧誘導(dǎo)的PAH小鼠肺和心臟組織中P22phox表達增加，而敲低P22phox對低氧誘導(dǎo)的PAH小鼠具有保護作用[13]。此外，Nagaraj 等[14]的研究結(jié)果顯示，在慢性阻塞性肺疾病患者中，P22phox的表達與平均肺動脈壓、氧合指數(shù)呈正相關(guān)。在慢性缺氧環(huán)境下，P22phox缺失與右心室功能改善和肺血管重塑減少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)HPASMCs增殖和遷移，還可上調(diào)細胞中P22phox的表達。進一步實驗結(jié)果顯示，敲低P22phox可抑制缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs增殖和遷移。該研究結(jié)果表明，P22phox可促進缺氧條件下HPASMCs增殖和遷移，可能是治療PAH肺動脈重塑的重要靶點。

KLF4與許多重要的細胞過程有關(guān)，如細胞增殖、分化和炎癥等其他生物學(xué)活動[15]。以前的研究已經(jīng)證明，KLF4參與調(diào)控血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化，并能促進細胞增殖和遷移能力[16]。下調(diào)細胞中KLF4的表達可抑制血管平滑肌細胞異常增殖和遷移[17-18]。目前，已有證據(jù)顯示，長期缺氧可導(dǎo)致血管平滑肌細胞增殖速度大于凋亡，最終導(dǎo)致不可逆的肺血管重塑[19]。而在缺氧條件下血管平滑肌細胞中KLF4表達增加，敲低KLF4可抑制血管平滑肌細胞的遷移[20]。目前，已有相關(guān)研究證明，KLF4在香煙煙霧提取物誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動脈中表達上調(diào)，敲低KLF4可以預(yù)防和改善大鼠PAH的進展[21]。本研究結(jié)果顯示，缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中KLF4表達上調(diào)。另外，已有研究表明，敲低P22phox通過下調(diào)KLF4表達抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖和遷移[22]。本研究結(jié)果顯示，在缺氧誘導(dǎo)的HPASMCs中，敲低P22phox可下調(diào)細胞中KLF4表達。進一步實驗結(jié)果表明，過表達KLF4可逆轉(zhuǎn)敲低P22phox對缺氧HPASMCs的作用，促進HPASMCs增殖和遷移。本研究結(jié)果還表明，P22phox可通過上調(diào)KLF4表達促進缺氧條件下HPASMCs增殖和遷移，P22phox/ KLF4軸可能是治療PAH肺動脈重塑的重要靶點。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)HPASMCs增殖和遷移，還可上調(diào)HPASMCs中P22phox和KLF4的表達。P22phox可通過上調(diào)KLF4表達促進缺氧條件下HPASMCs增殖和遷移。該研究結(jié)果為明確PAH血管重塑分子機制及開發(fā)新的PAH治療靶點提供了新的科學(xué)依據(jù)。