李點 鄭正 江葉舟

(湖南省胸科醫(yī)院綜合科，湖南 長沙 410003)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是呼吸系統(tǒng)疾病中的常見病和多發(fā)病，具有較高的患病率和病死率，對社會造成了巨大的經(jīng)濟負擔，已成為重要的公共衛(wèi)生問題[1-2]。COPD又稱為慢阻肺，是一種可以預防和治療的疾病，主要特征為持續(xù)性氣流受到限制，在肺部主要表現(xiàn)為進行性發(fā)展的不完全性氣流受限，并且和香煙煙霧等有害氣體的吸入有密切關(guān)系，其中吸入香煙煙霧也是導致COPD最重要的發(fā)病因素[3]。肺動脈平滑肌細胞(Pulmonary vascular smooth muscle cells, PASMCs)是肺血管的重要組成部分，增加肺動脈平滑肌細胞凋亡可以逆轉(zhuǎn)肺動脈高壓肺血管重建[4]。有研究表明，COPD的全身、局部炎癥及缺氧等因素均可導致PASMCs的增殖和凋亡[5]。細胞外信號調(diào)控激酶(Extracellular signal-regulated kinase,ERK)介導著細胞增殖、分化和凋亡等多種生物學過程，在凋亡過程中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)是最關(guān)鍵的蛋白酶，增加caspase-3蛋白的表達可促進細胞的凋亡[6]。1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine1-phosphate,SIP)是一類真核生物體內(nèi)天然存在的具有生物活性的細胞膜鞘類脂質(zhì)代謝中間產(chǎn)物[7]。有研究證實S1P介導著多種生物學過程，其不僅可以和細胞表面特定的受體相互結(jié)合，進而影響細胞的增殖、血管再生和免疫細胞遷移等，另外，其也可以作為細胞的第二信使調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn)態(tài)、抑制細胞凋亡、促進細胞增殖等作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)S1P可通過促進下游ERK信號傳導而引起細胞增殖反應[9]。FTY720為S1P受體激動劑芬戈莫德，其廣泛應用于臨床，在結(jié)構(gòu)上與S1P具有相似性，且本身并不能被S1P受體識別，可以變相的增強S1P的生物學功能[10]。本研究通過應用FTY720對COPD大鼠進行處理，觀察S1P信號對肺動脈平滑肌細胞及caspase-3和ERK蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用12周的清潔級健康雄性SD大鼠60只，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司，體重200～220 g，所有大鼠無特定病原體，均飼養(yǎng)在同溫度、同濕度的環(huán)境中，自由飲水，普通飼料飼養(yǎng)16周。本研究遵守動物倫理要求，并經(jīng)湖南省胸科醫(yī)院倫理委員會審核批準。

1.2 試劑和儀器 分戈莫德(FTY720)購自美國Selleck公司；黃果樹香煙購自貴州中煙工業(yè)公司；兔抗大鼠ERK和caspase-3抗體購自美國CST公司；Tunel試劑盒購自Roche公司；β-actin單抗購自武漢谷歌生物科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱購自天津泰斯特公司；圖像分析軟件購于寧波江豐生物信息技術(shù)有限公司。

1.3 動物分組和模型建立 將大鼠隨機分為對照組、COPD組和S1P組。采用煙霧暴露聯(lián)合脂多糖氣管內(nèi)滴注的方法建立COPD大鼠模型，把模型組和S1P組大鼠均置于動物煙熏箱進行煙熏(煙熏箱中煙霧濃度保持在450～500 bpm，持續(xù)30 min，間隔3 h煙熏1次，每12 h更換煙盒1次)，并氣管內(nèi)滴注脂多糖0.2 mg/kg，每日1次，持續(xù)12周。分別于第1天和第84天，稱取COPD組和S1P組大鼠體質(zhì)量，采用Wistar大鼠肺功能檢測儀檢測呼吸峰流速、呼氣峰流量和每分鐘通氣量，當以上指標下降程度超過30%時即為COPD模型成功。

建模成功后，S1P組大鼠每天給予10 mg/kg FTY720灌胃給藥，隔天1次，每周3次。對照組和COPD組大鼠每天給予等量的生理鹽水灌胃，每周3次。在給藥前對大鼠進行乙醚氣道麻醉，操作時動作輕柔，避免對大鼠造成損傷，增加大鼠感染及病死率。

1.4 標本采集 測定大鼠收縮壓后，麻醉所有大鼠并處死，取出右肺組織，保存在-80℃的冰箱中備用。一部分用于HE染色，另一部分用于蛋白質(zhì)印跡檢測。

1.5 肺功能檢測 每千克大鼠腹腔注射40 mg的戊巴比妥鈉麻醉，連接小動物呼吸機，維持平靜呼吸3 min并連接Maclab 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，3 min后給予一定氣量充氣模仿深呼吸，利用危機處理計算大鼠肺功能指標。

1.6 右心室收縮壓(RVSP)的測定 每千克大鼠腹腔注射40 mg的戊巴比妥鈉麻醉，在大鼠右側(cè)頸外靜脈插入聚乙烯導管直到肺動脈干，穩(wěn)定10 min后，采用YP101型壓力轉(zhuǎn)換傳感器及YSD4-G型生理記錄儀檢測大鼠平均肺動脈壓力，以mmHg來表示(1 mmHg=0.133 kPa)。

1.7 右心室肥大指數(shù)(RVMI)測定 測定右心室RVSP值后，將大鼠放血處死，迅速開胸取出心臟及肺組織。沿房室交界處除去左右心房以及周圍大血管，留取右心室(RV)以及左心室和室間隔(LV+S)，采用濾紙吸干組織中多余的水分并經(jīng)電子天平分別稱取質(zhì)量，計算RV質(zhì)量與LV+S質(zhì)量的比值，即為RVMI值。

1.8 HE染色檢測肺組織病理形態(tài) 將處死的大鼠左肺組織采用大頭針固定在泡沫板上，并用手術(shù)刀在距離肺的尖部0～5 cm處切取肺組織，并將組織固定在中性甲醛中24 h，取出后，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、切片后，再進行HE染色，光學顯微鏡下觀察各組肺血管形態(tài)。另取直徑為100 μm左右的肺動脈，采用ICM-102細胞圖像分析軟件對其形態(tài)進行定量統(tǒng)計，以血管壁橫斷面積占血管橫斷面積的比值(WA，%) 作為衡量低氧肺血管重構(gòu)的指標。

1.9 TUNEL檢測肺動脈平滑肌細胞的凋亡 按照羅氏公司提供的TUNEL試劑盒說明書操作，將大鼠左側(cè)肺組織進行石蠟包埋、切片后加入20 μg/mL蛋白酶K，0.3%雙氧水及0.1%TritonX-100，而后加入TUNEL反應液，加入標記熒光素抗體的HRP封閉以及DAB顯色試劑盒進行顯色，在光學顯微鏡下進行鏡檢。在顯微鏡下隨機選取直徑在100 μm左右的肺動脈，統(tǒng)計500個肺動脈平滑肌細胞中凋亡細胞數(shù)，得出細胞凋亡指數(shù)(AI)，AI=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.10 蛋白質(zhì)印跡法檢測COPD大鼠caspase-3和p-ERK蛋白表達 將3組大鼠的肺組織分別提取100 mg，將細胞進行裂解并提取核蛋白，并對核蛋白的濃度進行測量，分裝后，保存在零下20攝氏度的環(huán)境中。將提取出的蛋白溶液和緩沖溶液進行混均，按照4∶1比例進行，然后將蛋白液煮沸使其變性。在電泳板內(nèi)分別注入50 μm的蛋白樣品，把電泳后的樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入脫脂奶粉，并進行封閉，時常為1 h。加入1抗后進行TTBS漂洗，每次漂洗10 min，一共進行3次漂洗，最后加入2抗對溶液進行稀釋，再在常溫的環(huán)境中封閉1 h。取出PVDF膜，TTBS漂洗10 min×3，DAB顯色后數(shù)碼相機照相。

2 結(jié)果

2.1 COPD大鼠肺功能 對照組大鼠肺功能FEV0.3/FVC、Cdyn值高于COPD組，RI值低于COPD組(P<0.05)；與COPD組相比，S1P組FEV0.3/FVC、Cdyn值顯著升高，RI值明顯降低(P<0.05)，見表1。

表1 3組大鼠肺功能比較

2.2 3組大鼠RVSP與RVMI比較 與對照組大鼠相比，COPD組大鼠RVSP值顯著升高，干預后的S1P組大鼠RVSP值得到了明顯的降低，且低于COPD組(均P<0.05)；與對照組相比，COPD組大鼠RVMI值顯著升高(P<0.05)；與COPD組相比，S1P組大鼠RVMI明顯降低(P<0.05)，見表2。

表2 3組大鼠RVSP值測定結(jié)果比較

2.3 3組大鼠肺組織病理形態(tài)學比較 與對照組相比，COPD組大鼠肺動脈組織中膜明顯變厚，肺血管生成明顯，內(nèi)皮細胞出現(xiàn)損傷甚至脫落；干預后的S1P組大鼠肺組織得到了明顯的改善，見圖1。

圖1 肺組織HE染色(200×)

2.4 3組大鼠肺動脈平滑肌細胞凋亡比較 與對照組相比，COPD組肺動脈平滑肌細胞形體完整，基本無固縮；與COPD組相比，S1P組肺動脈平滑肌細胞出現(xiàn)大量的固縮，細胞內(nèi)出現(xiàn)空泡，見圖2。對照組、COPD組及S1P組大鼠的AI指數(shù)分別為(12.7±0.58)%，(1.23±0.22)%和(32.4±0.76)%，COPD組大鼠的AI指數(shù)明顯低于對照組，S1P組AI指數(shù)顯著高于S1P組(均P<0.05)。

圖2 肺動脈平滑肌細胞凋亡(200×)

2.5 3組大鼠caspase-3和p-ERK蛋白表達 與對照組大鼠相比，COPD組大鼠肺組織中caspase-3蛋白表達顯著升高，p-ERK蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與COPD組相比，S1P組大鼠肺組織中caspase-3蛋白得到了顯著的抑制，且p-ERK蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見圖3。

圖3 3組大鼠caspase-3和p-ERK蛋白表達比較

3 討論

COPD主要是由長期氣道阻塞導致患者肺泡缺氧和二氧化碳潴留，進而引起肺血管收縮、肺血管重構(gòu)等臨床癥狀，嚴重的可導致肺動脈高血壓癥、右心衰竭癥甚至死亡[11]。慢性炎癥、低氧或缺氧等癥狀均可導致肺血管重塑，且肺血管重塑是導致COPD進一步惡化的關(guān)鍵因素[12]。低氧導致肺內(nèi)高血壓，從而促進肺動脈纖維母細胞和內(nèi)皮細胞的的促有絲分裂因子、生長因子的釋放，而這些因子的釋放進一步促進平滑肌細胞、成纖維細胞的增殖并進一步刺激細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，導致肺動脈血管壁增厚，加重氣道阻塞[13]。肺動脈高壓是以肺動脈壓力以及肺部血管阻力升高為特點的病理生理綜合征，其主要病理機制為血管收縮、血管重塑，導致右心室負荷增加，右心衰竭[14]。RVSP、RVMI是反映肺動脈及血管重塑的指標。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠肺功能FEV0.3/FVC、Cdyn值明顯降低，RI值明顯升高；且RVSP和RVMI明顯較對照組也明顯升高；干預后的S1P組FEV0.3/FVC、Cdyn值顯著升高，RI值明顯降低；且RVSP和RVMI明顯均得到了顯著的抑制，這也印證了以往的研究[15]。COPD患者肺動脈管增厚明顯，管腔明顯變窄，本研究結(jié)果也證實了這一病理變化。

肺動脈平滑肌細胞在胚胎血管發(fā)育期為合成表型，處于增殖狀態(tài)；而出生后該細胞由合成表型轉(zhuǎn)為收縮型，處于靜止狀態(tài)，主要維持肺部血管的張力和正常血管構(gòu)型。當機體出現(xiàn)低氧等刺激時，該細胞則又轉(zhuǎn)化為合成表型，從而進入增殖狀態(tài)。有研究表明，COPD患者平滑肌細胞增加數(shù)量高于非COPD患者[16-17]。本研究結(jié)果也證實，COPD大鼠血管壁增厚、TUNEL染色陽性細胞數(shù)少于正常對照組，COPD大鼠AI明顯低于對照組，這些結(jié)果均證實COPD鼠存在明顯的血管壁增厚、平滑肌細胞增殖現(xiàn)象。S1P脂質(zhì)具有一定的多效性，參與多種生理、病理過程，包括血管生成、細胞的增殖和遷移，炎癥細胞的運輸，細胞因子的產(chǎn)生、細胞骨架重組、內(nèi)皮屏障調(diào)節(jié)血管張力控制等[18-19]。本研究證實，S1P可有效抑制COPD大鼠平滑肌細胞增殖，改善RVSP、RVMI和肺功能，進而改善肺血管重塑；同時，其還能有效的促進肺動脈平滑肌細胞的凋亡，由此推測S1P改善COPD大鼠肺動脈高壓的作用可能與其促進平滑肌細胞凋亡的作用有關(guān)。蔡學定等[20]研究證實，姜黃素可能通過抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β軸，改善低氧誘導的PASMCs異常增殖，HPH大鼠肺血管重塑和右心肥大，降低肺動脈壓力。陳廷偉等[21]通過對COPD大鼠研究發(fā)現(xiàn)，S1P可能參與COPD大鼠肺部炎癥的進程。

ERK介導細胞的增殖、分化和凋亡等生物學過程，阻斷ERK通路的激活，可促進細胞的凋亡[22]。ERK上游的蛋白會磷酸化ERK，活化后P-ERK會作用于細胞漿內(nèi)多種信號分子，P-ERK也會直接進入到細胞核內(nèi)，進而作用于轉(zhuǎn)錄因子，對基因的表達進行調(diào)控[23]。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠p-ERK蛋白的表達明顯降低，其活性被明顯抑制。Caspase-3是caspase家族中級聯(lián)反應最關(guān)鍵的一種蛋白酶，caspase-3正常情況下在細胞質(zhì)中沒有活性，當其被凋亡信號激活后，caspase-3被分裂為兩個亞基，進而結(jié)合為四聚體成為有活性的酶，活化后的caspase-3會對不同的底物進行切割，讓DNA發(fā)生裂解，進而導致細胞死亡[24]。本研究結(jié)果顯示，COPD組大鼠的caspase-3蛋白表達顯著高于對照組，給予COPD大鼠1-磷酸鞘氨醇受體激活劑芬戈莫德灌胃處理后，大鼠的caspase-3表達得到抑制，同時ERK蛋白的表達被激活，提示S1P可有效的抑制COPD大鼠caspase-3表達，激活ERK蛋白活性。趙龍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇可通過抑制肺組織細胞凋亡進而影響肺氣腫的形成，進一步改善COPD患者的癥狀及病理改變，其機制可能與S1P信號激活S1P/Akt/ERK信號通路有關(guān)。

4 結(jié)論

S1P可抑制COPD大鼠caspase-3蛋白表達，激活ERK蛋白，對肺動脈平滑肌細胞的凋亡有一定的促進作用。但本研究也有一定局限性，COPD是多方面作用的結(jié)果，涉及多條信號通路，而其對信號通路是否有作用，有什么樣的作用仍需要后續(xù)深入研究。