馮靖雯，楊澤，楊柯，張揚(yáng)

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院·附屬口腔醫(yī)院正畸科，遼寧省口腔疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110002；2.中國(guó)科學(xué)院金屬研究所前沿材料研究部，沈陽(yáng) 110016）

研究［1］顯示，口腔菌群呈動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。口腔治療中使用的各種金屬固定裝置會(huì)導(dǎo)致患者口腔清潔能力下降，同時(shí)改變口內(nèi)菌群環(huán)境，使細(xì)菌數(shù)量增加、菌斑滯留，導(dǎo)致炎癥發(fā)生［2-3］。因此，研究者［4-5］在金屬表面制備抗生素涂層或注入金屬離子，從而有效減少感染的發(fā)生。CHAI等［6］將微量的Cu2+注入醫(yī)用不銹鋼中，研發(fā)了一種含有4.5%Cu2+的317L-Cu新型抗菌不銹鋼（00Cr19Ni13Mo3-4.5 wt pct Cu，317L-Cu SS）。研究表明，317L-Cu SS 不僅廣譜抗菌性能優(yōu)異，抗菌效果持久，且因其所含Cu2+高于316L-Cu約1%～2%而具有更加優(yōu)良的耐腐蝕性和可加工性。317L-Cu SS有望應(yīng)用于臨床，特別是對(duì)于患有全身代謝性疾病的種植體周圍炎易感人群意義重大。

對(duì)于新材料安全性、有效性的評(píng)價(jià)，除機(jī)械、物理和化學(xué)性能之外，生物相容性同樣至關(guān)重要。含有微量Cu2+的317L-Cu SS的生物相容性符合標(biāo)準(zhǔn)是應(yīng)用于正畸臨床治療的前提條件。本研究采取細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、活細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8法、流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI雙染法及吖啶橙細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)，探討317L-Cu SS對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞生物學(xué)行為（生長(zhǎng)、增殖、黏附、凋亡）的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠成纖維細(xì)胞L-929購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。5種金屬材料包括317L-Cu SS、醫(yī)用不銹鋼（00Cr19Ni13Mo3，317L SS）、純 銅（99.95 Cu，Cu）、醫(yī)用純鈦（99Ti，Ti）、鉛（98.2Pb，Pb）。所有金屬材料均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院金屬研究所。

1.2 方法

1.2.1 金屬試件制備：將5種金屬材料分別制作成為直徑30 mm、厚度1 mm的圓片，每種各5片，用于細(xì)胞增殖活性檢測(cè)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)。另將5種金屬材料分別制成直徑10 mm、厚度1 mm的圓片，每種各10片，用于細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 金屬浸提液制備：無(wú)菌條件下將制備完成的金屬試件放于培養(yǎng)板中，金屬表面積與培養(yǎng)液配比3 cm2∶1 mL為浸提液制備標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 CCK-8法細(xì)胞毒性檢測(cè)及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)分為6組，RPMI1640培養(yǎng)液組（陰性對(duì)照組）、Ti組、317L-Cu SS組、317L SS組、Cu組、Pb組（陽(yáng)性對(duì)照組）。L-929細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將其制備成懸液并接種于培養(yǎng)板中，每孔加入相應(yīng)的金屬浸提液或培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察及細(xì)胞毒性檢測(cè)。在490 nm波長(zhǎng)下酶標(biāo)儀法測(cè)量各孔吸光度（optical density，OD）值，相對(duì)增殖率（relative growth rate，RGR）計(jì)算方法［7］：RGR=ODe/ODc×100%，ODe為實(shí)驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組平均OD值，ODc為陰性對(duì)照組OD值。

1.2.4 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞分為4組，Ti組、317LCu SS組、317L SS組、Cu組。4種金屬試件置于無(wú)菌24孔培養(yǎng)板中，材料表面接種L-929細(xì)胞，在培養(yǎng)至24 h、48 h、72 h時(shí)各組取出1塊培養(yǎng)板進(jìn)行吖啶橙染色，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞黏附情況。

1.2.5 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、Ti組、317L-Cu SS組、317L SS組、Cu組5組。培 養(yǎng)L-929細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%孔底面積時(shí)，陰性對(duì)照組更換為原RPMI1640培養(yǎng)液，而其他組更換為金屬浸提液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后移除各孔中的金屬浸提液或培養(yǎng)液，重懸細(xì)胞，使用AnnexinⅤ-FITC/PI 雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較

倒置相差顯微鏡下觀察L929細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h后 6種材料浸提液中的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。與陰性對(duì)照組比較，Ti組、317L-Cu SS組、317L SS 組細(xì)胞生長(zhǎng)速度略慢，但貼壁生長(zhǎng)情況良好，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)偶見(jiàn)少量細(xì)胞的細(xì)胞核固縮；Cu組細(xì)胞異常，呈空泡狀中毒樣；陽(yáng)性對(duì)照組多見(jiàn)重度中毒樣的懸浮死細(xì)胞，見(jiàn)圖1。

圖1 各組L929細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后的形態(tài)學(xué)比較×40Fig.1 Morphological comparison of L929 cells in each group at 24，48，and 72 h ×40

2.2 各組細(xì)胞毒性比較

CCK-8法檢測(cè)6種材料浸提液培養(yǎng)24、48、72 h后的L929細(xì)胞OD值，結(jié)果顯示，除Cu組和陽(yáng)性對(duì)照組外，其他4組隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)L929細(xì)胞OD值均增加。在培養(yǎng)24 h、72 h后317L-Cu SS 組L929細(xì)胞OD值低于Ti組（P＜ 0.05），而培養(yǎng)48 h后2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。317L SS 組L929細(xì)胞OD值低于317L-Cu SS 組（P＜ 0.05）。Cu組、陽(yáng)性對(duì)照組L929細(xì)胞OD值均明顯低于其他組（均P＜ 0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 各組培養(yǎng)24、48、72 h 后L929細(xì)胞OD值比較Fig.2 Comparison of optical density values of L929 cells in each group at 24，48，and 72 h

由OD值計(jì)算出各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h的相對(duì)增殖率及細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示，Ti組、317L-Cu SS組、317L SS 組細(xì)胞毒性等級(jí)均為1級(jí)，無(wú)明顯細(xì)胞毒性；Cu組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞毒性等級(jí)為3級(jí)或4級(jí)，表現(xiàn)出較明顯的細(xì)胞毒性。見(jiàn)表1。

表1 各組培養(yǎng)24、48、72 h 后細(xì)胞增殖率及毒性級(jí)別比較Tab.1 Comparison of L929 cell proliferation rates and toxicity levels at 24，48，and 72 h in each group

2.3 AnnexinⅤ-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

結(jié)果顯示，各組凋亡細(xì)胞分布不均勻。陰性對(duì)照組、Ti組、317L-Cu SS組、317L SS組、Cu組的細(xì)胞凋亡率分別為（1.89±0.12）%、（2.28±0.13）%、（2.72±0.19）%、（5.20±0.27）%、（38.77±1.99）%。陰性對(duì)照組、Ti組、317L-Cu SS 組間細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞ 0.05），而其他各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 各組凋亡細(xì)胞流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Flow cytometry results of apoptotic cells in each group

2.4 各組L929細(xì)胞的黏附情況

結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Ti組、317L-Cu SS 組、317L SS 組黏附細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，而Cu組逐漸減少。與Ti組比較，細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h 317L-Cu SS組黏附細(xì)胞數(shù)量減少（P＜ 0.05），而在培養(yǎng)48 h時(shí)，2組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。各時(shí)間點(diǎn) 317L SS 組黏附細(xì)胞數(shù)量均少于317L-Cu SS 組（均P＜0.05）。各時(shí)間點(diǎn)Cu組細(xì)胞黏附數(shù)量明顯少于其他各組（均P＜ 0.05），見(jiàn)圖4、5。

圖4 L929細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h 時(shí)各組的黏附情況比較×200Fig.4 Comparison of the adhesion of L929 cells in each group at 24，48，and 72 h ×200

圖5 L929細(xì)胞培養(yǎng) 24、48、72 h 時(shí)各組黏附的細(xì)胞數(shù)量比較Fig.5 Comparison of the number of adherent L929 cells in each group at 24，48，and 72 h

3 討論

近年來(lái)，微種植體支抗廣泛應(yīng)用于正畸臨床治療中［8］，然而種植體與天然牙在結(jié)構(gòu)上有本質(zhì)的區(qū)別，它的表面無(wú)牙骨質(zhì)且無(wú)牙周膜纖維附著，生物屏障作用較弱，容易產(chǎn)生感染。為減少細(xì)菌感染的發(fā)生，本研究采用的317L-Cu SS是傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)材料和功能材料完美結(jié)合的新一代抗菌不銹鋼，與以往的抗菌不銹鋼比較，其Cu2+含量更接近飽和注入量。體內(nèi)和體外研究［9-11］已證實(shí)317L-Cu SS能夠阻止細(xì)菌的黏附或在黏附的短期內(nèi)有效殺滅金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等常見(jiàn)致病菌，具有比傳統(tǒng)醫(yī)用不銹鋼材料更加優(yōu)越的抗菌性、可加工性和耐腐蝕性。

細(xì)胞形態(tài)變化是啟動(dòng)一系列細(xì)胞生物學(xué)行為的信號(hào)，細(xì)胞的生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、凋亡和壞死。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)材料生物相容性具有重要意義，已有研究［12］報(bào)道，Cu2+的細(xì)胞毒性具有濃度依賴性。本研究探討了317L-Cu SS的生物相容性。結(jié)果顯示，317L-Cu SS組細(xì)胞凋亡率與陰性空白對(duì)照組、Ti組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞ 0.05），而低于317L-SS組（P＜ 0.05），說(shuō)明微量的Cu2+不促進(jìn)或僅輕微促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Cu組凋亡率明顯高于其他各組（均P＜ 0.05），說(shuō)明高劑量的Cu2+可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞的正常生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，與以往研究結(jié)果一致。

細(xì)胞能否大量黏附于金屬材料表面也是評(píng)價(jià)植入材料生物相容性的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h時(shí)317L-Cu SS組材料表面黏附的細(xì)胞數(shù)量少于Ti組（均P＜ 0.05），而在細(xì)胞培養(yǎng)72 h時(shí)2組材料表面黏附細(xì)胞數(shù)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。同時(shí)與317L SS組比較，317L-Cu SS組材料表面黏附的細(xì)胞數(shù)量增加（P＜ 0.05），且細(xì)胞形態(tài)良好，證明317L-Cu SS材料表面較317L SS更有利于細(xì)胞黏附。分析其原因可能是材料中含有的微量Cu2+參與了細(xì)胞代謝活動(dòng)，加強(qiáng)了細(xì)胞的黏附。

綜上所述，Cu2+的細(xì)胞毒性表現(xiàn)為雙向性，純銅材料具有明顯的細(xì)胞毒性，但含有微量Cu2+的317LCu SS對(duì)細(xì)胞的形態(tài)、黏附、增殖、凋亡等一系列生物學(xué)行為無(wú)明顯不良影響，且生物相容性良好，滿足了口腔生物材料的臨床應(yīng)用要求。本研究?jī)H局限于細(xì)胞水平，今后還需進(jìn)一步論證。