孫新穎,李美玉,孫 鵬,顏 碩,朱新遠(yuǎn),董煥聲*,潘慶杰*
(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東青島 266109;2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,山東濰坊 261061)
目前國(guó)內(nèi)外對(duì)影響綿羊多胎性狀的基因已有大量研究?;蚴且呀?jīng)確定的能夠影響綿羊多胎的基因。、和也相繼被證實(shí)為影響綿羊多胎性狀的相關(guān)基因。但在國(guó)內(nèi)綿羊品種中存在并發(fā)現(xiàn)的高繁殖力基因突變較少。狄冉等利用PCR-SSCP技術(shù)在8個(gè)品種的山羊、綿羊中并未檢測(cè)到FecXR突變。金慧慧等通過(guò)測(cè)序法與PCR-RFLP技術(shù)在綿羊與山羊中檢測(cè)G7和FecGV突變情況,結(jié)果均不存在突變。王金鑫等利用PCR-RFLP技術(shù)在17個(gè)綿羊品種中檢測(cè)到基因FecTT位點(diǎn)無(wú)突變。
杜泊羊以長(zhǎng)勢(shì)快、肉質(zhì)嫩而聞名國(guó)內(nèi)外,其遺傳性較其他綿羊品種更穩(wěn)定,在純繁或是改良后代性狀方面,都表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)繁殖性能。然而,杜泊羊的產(chǎn)羔數(shù)較少、產(chǎn)羔率低,極大影響了其作為肉羊的經(jīng)濟(jì)性狀。因此,尋找與杜泊羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因尤為重要。湖羊因其高產(chǎn)而舉世聞名,是中國(guó)優(yōu)良的綿羊品種,這些年來(lái)由湖羊生產(chǎn)的羊肉在中國(guó)羊肉市場(chǎng)占比較大。但是直到現(xiàn)在,湖羊多胎基因研究通常僅限于檢測(cè)單個(gè)突變,關(guān)于湖羊其他基因位點(diǎn)多態(tài)性的信息很少。因此,開(kāi)展綿羊多羔性狀相關(guān)基因的研究,對(duì)比高繁殖力與低繁殖力羊品種突變位點(diǎn)多態(tài)性異同對(duì)于揭示綿羊高繁殖力的機(jī)制、利用分子標(biāo)記輔助選擇來(lái)迅速提高杜泊羊等產(chǎn)羔數(shù)少的綿羊種類(lèi)的繁殖性能具有重要意義。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用60只黑頭杜泊羊均來(lái)自山東省濰坊市某種羊場(chǎng);47只湖羊均來(lái)自山東省聊城市某種羊場(chǎng),杜泊羊與湖羊分別處于同一飼養(yǎng)環(huán)境,健康狀況良好。用75%酒精棉球?qū)⒍挪囱蚨壉砻鎻氐紫?,稱(chēng)取耳組織10 g,放入裝有無(wú)水乙醇的2 mL離心管中,標(biāo)好序號(hào),并與羊耳號(hào)一一對(duì)應(yīng);帶回實(shí)驗(yàn)室放置-20℃保存。湖羊與杜泊羊產(chǎn)仔記錄參照各羊場(chǎng)中產(chǎn)仔數(shù)記錄,統(tǒng)計(jì)母羊每胎平均產(chǎn)羔數(shù)。
1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 組織基因組DNA提取試劑盒(天根);DL2000 DNA Marker、2×Pro Taq預(yù)混液(含染料)由TaKaRa公司提供;核酸染料(生工);恒溫?fù)u床;離心機(jī);電泳儀。
1.3 實(shí)驗(yàn)方法
1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)所研究的基因位點(diǎn)上下游約200 bp序列設(shè)計(jì)引物,引物由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列見(jiàn)表1。
表1 引物序列信息
1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增以綿羊基因組DNA為模板。PCR反應(yīng)體系20 μL:PCR預(yù)混液10 μL,上下游引物(10 mol/L)各0.5 μL,DNA模板為1 μL,Rnase free HO為8 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性30 s,98℃變性10 s,退火30 s,72℃延伸1 min,共25個(gè)循環(huán);72℃最終延伸2 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 利用DNAStar軟件中的EditSeq翻譯測(cè)序得到的基因序列,使用protean預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。
1.3.4 遺傳變異分析 統(tǒng)計(jì)基因頻率、基因型頻率、Hardy-Weinberg平衡,并分析群體純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)。
1.3.5 基因位點(diǎn)多態(tài)性與綿產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)性分析 利用GraphPad Prism 6軟件將杜泊羊基因位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析,結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示,以<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。
2.1 DNA檢測(cè)結(jié)果 綿羊基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且明亮,如圖1所示。利用核酸蛋白儀檢測(cè)DNA濃度,A260/A280比值在1.8~2.0區(qū)間內(nèi)。DNA質(zhì)量與濃度均符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。稀釋DNA使DNA范圍處于30~60 μg/mL。
“哼哼嘰嘰”、“唱唱咧咧”這兩個(gè)詞中的“哼”和“唱”是可以單獨(dú)成詞的,而“嘰”和“咧”不可以。重疊后也是一樣,AA式“哼哼”和“唱唱”是可以獨(dú)立使用的,而B(niǎo)B式“嘰嘰”和“咧咧”一般不能單獨(dú)使用。但“嘰嘰”作為疊音詞時(shí)改變聲調(diào),音為“jìji”時(shí)變成動(dòng)詞是可以單獨(dú)成詞的,當(dāng)然,這種情況是比較少見(jiàn)的。
圖1 綿羊基因組DNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果
2.2 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分別在343、358 bp處有清晰明亮的條帶;基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在421 bp處有清晰條帶;基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分別在167、516 bp處有清晰條帶;基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分別在354、361 bp處有清晰條帶;基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分別在208、496 bp處有清晰條帶。以上所有條帶均與預(yù)期片段大小一致。
圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
2.3基因測(cè)序結(jié)果 由圖3可知,基因RS42 8438934位點(diǎn)處發(fā)生T→C的突變,此突變?yōu)殄e(cuò)義突變,導(dǎo)致了氨基酸改變。
圖3 ESR2基因測(cè)序結(jié)果
2.4基因蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)基因RS4284 38934位點(diǎn)TT與CT、CC與CT基因型序列的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)結(jié)果如圖4所示,TT基因型氨基酸序列與CT基因型相比較發(fā)現(xiàn):在區(qū)域和區(qū)域分別缺少一個(gè)氨基酸,且在兩性區(qū)上氨基酸存在部分缺失情況,位于蛋白質(zhì)表面的可能性和抗原決定簇比例也不同。CC基因型氨基酸序列與CT基因型氨基酸序列相比在兩性區(qū)上存在較大不同,且在區(qū)域也存在著差異。TT、CC與CT相比較來(lái)說(shuō),TT、CC都在氨基酸位置5~10區(qū)間內(nèi)缺少螺旋結(jié)構(gòu)。綜上,TT與CT、CC與CT基因型的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比較差異均較大。
圖4 ESR2基因CT、TT與CC基因型的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)比對(duì)
2.5 遺傳多態(tài)性分析 2個(gè)綿羊群體、、、、基因多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,實(shí)驗(yàn)所研究的基因中的RS603752979位點(diǎn)在杜泊羊與湖羊中均呈現(xiàn)1種相同的基因型GG,無(wú)突變類(lèi)型,處于平衡狀態(tài)。RS418841713在杜泊羊中存在2種基因型GG、AA,在湖羊中存在AA、GG、GA3種基因型,均處于不平衡狀態(tài)。RS398521635、RS402413016、G7、G8、RS417060437、RS604746425在杜泊羊與湖羊中均只有1種基因型,無(wú)突變類(lèi)型,處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。RS428438934在杜泊羊中存在3種基因型CC、TT、CT,處于不平衡狀態(tài)。
表2 綿羊群體BMPR-IB、BMP15、GDF9、ESR2、ADAMTS1基因位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率、MAF
2.6 綿羊群體遺傳變異分析結(jié)果 由表3可知,不同基因不同群體的遺傳Ho均較高,湖羊群體中、基因中的位點(diǎn)均為中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5);在杜泊綿羊群體中,RS418841713、RS422930632、G1為低度多態(tài)(PIC<0.25),RS428438934、RS405617034為中度多態(tài)(0.25<PIC<0.5)。
表3 綿羊群體不同位點(diǎn)遺傳變異分析
2.7不同基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析 由表4可知,杜泊羊基因3種基因型群體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.408、1.015、1.336只,CC與CT、TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異顯著。湖羊基因2種基因型群體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為2.041、2.035只,TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異不顯著。
表4 ESR2基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析
目前研究發(fā)現(xiàn)在新吉細(xì)毛羊、小尾寒羊、蒙古羊以及甘肅現(xiàn)代肉羊群體中基因存在與多胎性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)。前人研究發(fā)現(xiàn),RS599417043、RS109219782、RS402413016和RS398 521635位點(diǎn)在小尾寒羊、灘寒雜交羊、杜泊羊和灘羊群體中都分別只有一種相同的基因型且處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài),這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本實(shí)驗(yàn)在黑頭杜泊羊與湖羊群體中均未檢測(cè)到相應(yīng)位置上的位點(diǎn)具有多態(tài)性,說(shuō)明這4個(gè)位點(diǎn)不是影響杜泊羊與湖羊產(chǎn)羔數(shù)差異的原因,由此推測(cè)并不是影響杜泊羊與湖羊群體多胎性狀的主效基因。
基因和基因?qū)儆谕粋€(gè)家族,其在卵泡的生長(zhǎng)分化過(guò)程中發(fā)揮極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn),在Cambridge羊中存在G8突變,此突變與Cambridge羊和Belclare高排卵數(shù)(突變雜合體)和不育(純合體)都密切相關(guān)。劉永斌等蒙古羊群體中未檢測(cè)到G8位點(diǎn)具有多態(tài)性。金慧慧等通過(guò)測(cè)序法與RFLP-PCR在綿羊與山羊中檢測(cè)G7和FecGV突變情況,結(jié)果均不存在突變。此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示G7在杜泊羊與湖羊中都只有1種基因型。
是卵母細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子,是與綿羊多胎性狀相關(guān)的主效基因。FecB就是基因突變導(dǎo)致第249位置上的谷氨酸突變成精氨酸的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)在杜泊羊與湖羊中均未檢測(cè)到相應(yīng)位置上的多態(tài)性位點(diǎn),這與張坤研究結(jié)果一致。RS418841713位點(diǎn)在杜泊羊中無(wú)突變情況,只有AA 1種基因型,但是在湖羊中具有GG、GA、AA 3種基因型,處于不平衡狀態(tài),猜測(cè)原因可能是樣本數(shù)量較少所致。
雖然研究較其他基因時(shí)間較晚但受到越來(lái)越多的關(guān)注。何小龍等在單羔與雙羔蒙古羊的卵巢中發(fā)現(xiàn)存在表達(dá)差異推測(cè)基因可能是影響蒙古羊多胎性狀的基因。蔡倩方等發(fā)現(xiàn)排卵時(shí)在卵巢顆粒細(xì)胞層中的轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng),而孕激素受體基因敲除小鼠卵巢局部后表達(dá)顯著下降,有明顯的排卵障礙。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示在杜泊羊與湖羊中只存在1種基因型,顯示位于外顯子2與外顯子8上的位點(diǎn)并不是影響杜泊羊與湖羊多胎的位點(diǎn)。且烏吉斯古楞研究也證實(shí)在蒙古羊中基因外顯子3的位點(diǎn)不是影響產(chǎn)羔性狀的主效基因。
ESR在生殖生物學(xué)中起著重要作用。研究表明在魯中肉羊品種選育中基因g.73324006C>T位點(diǎn)具有可靠的標(biāo)記作用。儲(chǔ)明星等利用PCR-SSCP技術(shù)研究表明基因可能是控制小尾寒羊多胎性狀的主效基因之一。張坤發(fā)現(xiàn)RS405617034、RS428438934位點(diǎn)具有多態(tài)性,RS405617034、RS428438934在小尾寒羊、灘寒羊和杜泊羊中突變極顯著高于灘羊。以上研究結(jié)果說(shuō)明基因中位點(diǎn)與多胎性狀密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在杜泊羊中在RS428438934位點(diǎn)處存在的TT、CT、CC 3種基因型相對(duì)應(yīng)的產(chǎn)羔數(shù)分別是1.336、1.015、1.408,CC基因型比CT基因型平均產(chǎn)羔數(shù)多0.393只,TT基因型比CT基因型平均產(chǎn)羔數(shù)多0.321只。CC與CT、TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異顯著。另外RS428438934位點(diǎn)在杜泊羊與湖羊中相同位置都出現(xiàn)了TT、CT基因型,但發(fā)現(xiàn)只有在杜泊羊中出現(xiàn)CC基因型,猜測(cè)此位點(diǎn)或許是影響杜泊羊多胎的原因。在對(duì)突變序列的蛋白質(zhì)二級(jí)的預(yù)測(cè)中,發(fā)現(xiàn)RS428438934位點(diǎn)CC與CT之間、TT與CT之間,RS405617034位點(diǎn)AA與GG基因型之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)均存在差異。這進(jìn)一步說(shuō)明這2個(gè)突變位點(diǎn)存在著一定的生物學(xué)意義。
本實(shí)驗(yàn)利用測(cè)序法對(duì)60只黑頭杜泊羊進(jìn)行位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè),以46只湖羊做對(duì)照,研究發(fā)現(xiàn):
1)RS428438934位點(diǎn)處CC與CT、TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異顯著,可以作為杜泊羊多胎標(biāo)記位點(diǎn)。
2)RS405617034位點(diǎn)處AA與GG基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比無(wú)顯著差異,不能作為杜泊羊多胎標(biāo)記位點(diǎn)。
3)RS603752979、RS402413016、RS418841713、RS417060437、RS422930632、RS604746425、RS55628000、RS398521635、G1、G7、G8并不能作為杜泊羊多胎標(biāo)記位點(diǎn)。