孫新穎，李美玉，孫 鵬，顏 碩，朱新遠(yuǎn)，董煥聲*，潘慶杰*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東濰坊 261061）

目前國內(nèi)外對影響綿羊多胎性狀的基因已有大量研究?；蚴且呀?jīng)確定的能夠影響綿羊多胎的基因。、和也相繼被證實為影響綿羊多胎性狀的相關(guān)基因。但在國內(nèi)綿羊品種中存在并發(fā)現(xiàn)的高繁殖力基因突變較少。狄冉等利用PCR-SSCP技術(shù)在8個品種的山羊、綿羊中并未檢測到FecXR突變。金慧慧等通過測序法與PCR-RFLP技術(shù)在綿羊與山羊中檢測G7和FecGV突變情況，結(jié)果均不存在突變。王金鑫等利用PCR-RFLP技術(shù)在17個綿羊品種中檢測到基因FecTT位點(diǎn)無突變。

杜泊羊以長勢快、肉質(zhì)嫩而聞名國內(nèi)外，其遺傳性較其他綿羊品種更穩(wěn)定，在純繁或是改良后代性狀方面，都表現(xiàn)出優(yōu)良的生產(chǎn)繁殖性能。然而，杜泊羊的產(chǎn)羔數(shù)較少、產(chǎn)羔率低，極大影響了其作為肉羊的經(jīng)濟(jì)性狀。因此，尋找與杜泊羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)的候選基因尤為重要。湖羊因其高產(chǎn)而舉世聞名，是中國優(yōu)良的綿羊品種，這些年來由湖羊生產(chǎn)的羊肉在中國羊肉市場占比較大。但是直到現(xiàn)在，湖羊多胎基因研究通常僅限于檢測單個突變，關(guān)于湖羊其他基因位點(diǎn)多態(tài)性的信息很少。因此，開展綿羊多羔性狀相關(guān)基因的研究，對比高繁殖力與低繁殖力羊品種突變位點(diǎn)多態(tài)性異同對于揭示綿羊高繁殖力的機(jī)制、利用分子標(biāo)記輔助選擇來迅速提高杜泊羊等產(chǎn)羔數(shù)少的綿羊種類的繁殖性能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗所用60只黑頭杜泊羊均來自山東省濰坊市某種羊場；47只湖羊均來自山東省聊城市某種羊場，杜泊羊與湖羊分別處于同一飼養(yǎng)環(huán)境，健康狀況良好。用75%酒精棉球?qū)⒍挪囱蚨壉砻鎻氐紫?，稱取耳組織10 g，放入裝有無水乙醇的2 mL離心管中，標(biāo)好序號，并與羊耳號一一對應(yīng)；帶回實驗室放置-20℃保存。湖羊與杜泊羊產(chǎn)仔記錄參照各羊場中產(chǎn)仔數(shù)記錄，統(tǒng)計母羊每胎平均產(chǎn)羔數(shù)。

1.2 實驗試劑和儀器 組織基因組DNA提取試劑盒（天根）；DL2000 DNA Marker、2×Pro Taq預(yù)混液（含染料）由TaKaRa公司提供；核酸染料（生工）；恒溫?fù)u床；離心機(jī)；電泳儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)所研究的基因位點(diǎn)上下游約200 bp序列設(shè)計引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.3.2 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增以綿羊基因組DNA為模板。PCR反應(yīng)體系20 μL：PCR預(yù)混液10 μL，上下游引物（10 mol/L）各0.5 μL，DNA模板為1 μL，Rnase free HO為8 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性30 s，98℃變性10 s，退火30 s，72℃延伸1 min，共25個循環(huán)；72℃最終延伸2 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用DNAStar軟件中的EditSeq翻譯測序得到的基因序列，使用protean預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

1.3.4 遺傳變異分析 統(tǒng)計基因頻率、基因型頻率、Hardy-Weinberg平衡，并分析群體純合度（Ho）、雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）和多態(tài)信息含量（PIC）。

1.3.5 基因位點(diǎn)多態(tài)性與綿產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)性分析 利用GraphPad Prism 6軟件將杜泊羊基因位點(diǎn)多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)之間進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，以＜0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果分析

2.1 DNA檢測結(jié)果 綿羊基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳條帶清晰且明亮，如圖1所示。利用核酸蛋白儀檢測DNA濃度，A260/A280比值在1.8～2.0區(qū)間內(nèi)。DNA質(zhì)量與濃度均符合后續(xù)實驗的要求。稀釋DNA使DNA范圍處于30～60 μg/mL。

“哼哼嘰嘰”、“唱唱咧咧”這兩個詞中的“哼”和“唱”是可以單獨(dú)成詞的，而“嘰”和“咧”不可以。重疊后也是一樣，AA式“哼哼”和“唱唱”是可以獨(dú)立使用的，而BB式“嘰嘰”和“咧咧”一般不能單獨(dú)使用。但“嘰嘰”作為疊音詞時改變聲調(diào)，音為“jìji”時變成動詞是可以單獨(dú)成詞的，當(dāng)然，這種情況是比較少見的。

圖1 綿羊基因組DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在343、358 bp處有清晰明亮的條帶；基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在421 bp處有清晰條帶；基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在167、516 bp處有清晰條帶；基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在354、361 bp處有清晰條帶；基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在208、496 bp處有清晰條帶。以上所有條帶均與預(yù)期片段大小一致。

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.3基因測序結(jié)果 由圖3可知，基因RS42 8438934位點(diǎn)處發(fā)生T→C的突變，此突變?yōu)殄e義突變，導(dǎo)致了氨基酸改變。

圖3 ESR2基因測序結(jié)果

2.4基因蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測基因RS4284 38934位點(diǎn)TT與CT、CC與CT基因型序列的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比對結(jié)果如圖4所示，TT基因型氨基酸序列與CT基因型相比較發(fā)現(xiàn)：在區(qū)域和區(qū)域分別缺少一個氨基酸，且在兩性區(qū)上氨基酸存在部分缺失情況，位于蛋白質(zhì)表面的可能性和抗原決定簇比例也不同。CC基因型氨基酸序列與CT基因型氨基酸序列相比在兩性區(qū)上存在較大不同，且在區(qū)域也存在著差異。TT、CC與CT相比較來說，TT、CC都在氨基酸位置5～10區(qū)間內(nèi)缺少螺旋結(jié)構(gòu)。綜上，TT與CT、CC與CT基因型的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比較差異均較大。

圖4 ESR2基因CT、TT與CC基因型的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)比對

2.5 遺傳多態(tài)性分析 2個綿羊群體、、、、基因多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率、基因頻率結(jié)果見表2。由表2可知，實驗所研究的基因中的RS603752979位點(diǎn)在杜泊羊與湖羊中均呈現(xiàn)1種相同的基因型GG，無突變類型，處于平衡狀態(tài)。RS418841713在杜泊羊中存在2種基因型GG、AA，在湖羊中存在AA、GG、GA3種基因型，均處于不平衡狀態(tài)。RS398521635、RS402413016、G7、G8、RS417060437、RS604746425在杜泊羊與湖羊中均只有1種基因型，無突變類型，處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)。RS428438934在杜泊羊中存在3種基因型CC、TT、CT，處于不平衡狀態(tài)。

表2 綿羊群體BMPR-IB、BMP15、GDF9、ESR2、ADAMTS1基因位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率、MAF

2.6 綿羊群體遺傳變異分析結(jié)果 由表3可知，不同基因不同群體的遺傳Ho均較高，湖羊群體中、基因中的位點(diǎn)均為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）；在杜泊綿羊群體中，RS418841713、RS422930632、G1為低度多態(tài)（PIC＜0.25），RS428438934、RS405617034為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）。

表3 綿羊群體不同位點(diǎn)遺傳變異分析

2.7不同基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析 由表4可知，杜泊羊基因3種基因型群體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為1.408、1.015、1.336只，CC與CT、TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異顯著。湖羊基因2種基因型群體的平均產(chǎn)羔數(shù)分別為2.041、2.035只，TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異不顯著。

表4 ESR2基因不同基因型與產(chǎn)羔數(shù)相關(guān)性分析

3 討 論

目前研究發(fā)現(xiàn)在新吉細(xì)毛羊、小尾寒羊、蒙古羊以及甘肅現(xiàn)代肉羊群體中基因存在與多胎性狀相關(guān)的突變位點(diǎn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，RS599417043、RS109219782、RS402413016和RS398 521635位點(diǎn)在小尾寒羊、灘寒雜交羊、杜泊羊和灘羊群體中都分別只有一種相同的基因型且處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)，這與本實驗結(jié)果一致。本實驗在黑頭杜泊羊與湖羊群體中均未檢測到相應(yīng)位置上的位點(diǎn)具有多態(tài)性，說明這4個位點(diǎn)不是影響杜泊羊與湖羊產(chǎn)羔數(shù)差異的原因，由此推測并不是影響杜泊羊與湖羊群體多胎性狀的主效基因。

基因和基因?qū)儆谕粋€家族，其在卵泡的生長分化過程中發(fā)揮極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，在Cambridge羊中存在G8突變，此突變與Cambridge羊和Belclare高排卵數(shù)（突變雜合體）和不育（純合體）都密切相關(guān)。劉永斌等蒙古羊群體中未檢測到G8位點(diǎn)具有多態(tài)性。金慧慧等通過測序法與RFLP-PCR在綿羊與山羊中檢測G7和FecGV突變情況，結(jié)果均不存在突變。此結(jié)果與本實驗結(jié)果一致，本實驗結(jié)果顯示G7在杜泊羊與湖羊中都只有1種基因型。

是卵母細(xì)胞中的一種轉(zhuǎn)化生長因子，是與綿羊多胎性狀相關(guān)的主效基因。FecB就是基因突變導(dǎo)致第249位置上的谷氨酸突變成精氨酸的結(jié)果。本實驗在杜泊羊與湖羊中均未檢測到相應(yīng)位置上的多態(tài)性位點(diǎn)，這與張坤研究結(jié)果一致。RS418841713位點(diǎn)在杜泊羊中無突變情況，只有AA 1種基因型，但是在湖羊中具有GG、GA、AA 3種基因型，處于不平衡狀態(tài)，猜測原因可能是樣本數(shù)量較少所致。

雖然研究較其他基因時間較晚但受到越來越多的關(guān)注。何小龍等在單羔與雙羔蒙古羊的卵巢中發(fā)現(xiàn)存在表達(dá)差異推測基因可能是影響蒙古羊多胎性狀的基因。蔡倩方等發(fā)現(xiàn)排卵時在卵巢顆粒細(xì)胞層中的轉(zhuǎn)錄活性顯著增強(qiáng)，而孕激素受體基因敲除小鼠卵巢局部后表達(dá)顯著下降，有明顯的排卵障礙。本實驗研究結(jié)果顯示在杜泊羊與湖羊中只存在1種基因型，顯示位于外顯子2與外顯子8上的位點(diǎn)并不是影響杜泊羊與湖羊多胎的位點(diǎn)。且烏吉斯古楞研究也證實在蒙古羊中基因外顯子3的位點(diǎn)不是影響產(chǎn)羔性狀的主效基因。

ESR在生殖生物學(xué)中起著重要作用。研究表明在魯中肉羊品種選育中基因g.73324006C＞T位點(diǎn)具有可靠的標(biāo)記作用。儲明星等利用PCR-SSCP技術(shù)研究表明基因可能是控制小尾寒羊多胎性狀的主效基因之一。張坤發(fā)現(xiàn)RS405617034、RS428438934位點(diǎn)具有多態(tài)性，RS405617034、RS428438934在小尾寒羊、灘寒羊和杜泊羊中突變極顯著高于灘羊。以上研究結(jié)果說明基因中位點(diǎn)與多胎性狀密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在杜泊羊中在RS428438934位點(diǎn)處存在的TT、CT、CC 3種基因型相對應(yīng)的產(chǎn)羔數(shù)分別是1.336、1.015、1.408，CC基因型比CT基因型平均產(chǎn)羔數(shù)多0.393只，TT基因型比CT基因型平均產(chǎn)羔數(shù)多0.321只。CC與CT、TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異顯著。另外RS428438934位點(diǎn)在杜泊羊與湖羊中相同位置都出現(xiàn)了TT、CT基因型，但發(fā)現(xiàn)只有在杜泊羊中出現(xiàn)CC基因型，猜測此位點(diǎn)或許是影響杜泊羊多胎的原因。在對突變序列的蛋白質(zhì)二級的預(yù)測中，發(fā)現(xiàn)RS428438934位點(diǎn)CC與CT之間、TT與CT之間，RS405617034位點(diǎn)AA與GG基因型之間的二級結(jié)構(gòu)均存在差異。這進(jìn)一步說明這2個突變位點(diǎn)存在著一定的生物學(xué)意義。

4 結(jié) 論

本實驗利用測序法對60只黑頭杜泊羊進(jìn)行位點(diǎn)多態(tài)性檢測，以46只湖羊做對照，研究發(fā)現(xiàn)：

1）RS428438934位點(diǎn)處CC與CT、TT與CT基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比差異顯著，可以作為杜泊羊多胎標(biāo)記位點(diǎn)。

2）RS405617034位點(diǎn)處AA與GG基因型之間產(chǎn)羔數(shù)相比無顯著差異，不能作為杜泊羊多胎標(biāo)記位點(diǎn)。

3）RS603752979、RS402413016、RS418841713、RS417060437、RS422930632、RS604746425、RS55628000、RS398521635、G1、G7、G8并不能作為杜泊羊多胎標(biāo)記位點(diǎn)。