李瀟然 王雪瑩 張 華 王世東 鄭曉艷

1.東直門醫(yī)院腎病內(nèi)分泌科二區(qū)，北京 100700；2.北京電力醫(yī)院老年病科，北京 100073

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病微血管并發(fā)癥之一，是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因。近年來，DN 患病率逐年提高，我國(guó)成人2 型糖尿病患病率為10.4%，其中20%～40%的2 型糖尿病患者合并DN[1]。目前，尿蛋白被認(rèn)為是DN 進(jìn)展以及導(dǎo)致不良腎臟結(jié)局的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素，與腎小球?yàn)V過率的降低及死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加密切相關(guān)[2]。

DN 中醫(yī)屬消渴病腎病范疇，為消渴病日久，耗氣傷陰，五臟受損，兼夾痰熱郁瘀而致病[3]，國(guó)醫(yī)大師呂仁和教授認(rèn)為消渴病進(jìn)入消癉期，痰熱郁瘀積聚于腎之絡(luò)脈，形成“微型癥瘕”，久而腎體受損，腎元不固，尿中蛋白流失，形成蛋白尿[4]。故臨床在重視活血消癥治法的基礎(chǔ)上，配伍芡實(shí)、金櫻子以固腎澀精，減少蛋白尿[5]。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)在降低DN 尿蛋白方面的靶點(diǎn)，為深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及藥物-疾病靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）、中醫(yī)百科全書數(shù)據(jù)庫（encyclopaedia of traditional Chinese medicine，ETCM）檢索藥物活性成分，設(shè)定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18，通過PubChem 網(wǎng)站獲得活性成分結(jié)構(gòu)，利用Swiss Target Prediction 數(shù)據(jù)庫獲得藥物靶點(diǎn)，將所得靶點(diǎn)錄入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫完成靶點(diǎn)篩選。在GeneCards 數(shù)據(jù)庫及OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索“diabetic nephropathy”得到DN 疾病靶點(diǎn)。

1.2 藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將藥物靶點(diǎn)及DN 相關(guān)靶點(diǎn)取交集獲得藥物-疾病交集靶點(diǎn)，并將藥物、藥物成分及藥物-疾病交集靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件進(jìn)行可視化分析，形成藥物靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 交集靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?/h3>

將交集靶點(diǎn)通過STRING 11.0 平臺(tái)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“highest confidence”。通過Cytoscape 軟件中NetworkAnalyzer 插件進(jìn)行PPI 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，并篩選前20 的核心靶點(diǎn)。

1.4 基因本體（gene ontology，GO）及京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

應(yīng)用RGUI 3.61 軟件及Bioconductor-clusterProfiler 3.14 工具對(duì)交集基因進(jìn)行GO 富集分析，包括分子功能、生物學(xué)過程及細(xì)胞組分的富集，利用Bioconductor-pathview 1.26 工具獲取KEGG 通路，限定pvalue＜0.01，qvalue＜0.05，提取前5 條GO 富集結(jié)果，生成柱狀圖，提取前20 條KEGG 通路生成點(diǎn)圖，完成主要KEGG 通路圖后，將交集基因標(biāo)記在通路上。

1.5 核心成分、靶點(diǎn)的分子對(duì)接

檢索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫獲取核心成分、靶點(diǎn)3D 結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Mgltools 軟件確定活性口袋范圍，通過VINA 軟件完成分子對(duì)接，通過Pymol 軟件獲得對(duì)接模式圖，并計(jì)算最小結(jié)合能。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分

通過對(duì)TCMSP、ETCM 檢索及篩選，得到芡實(shí)活性成分2 個(gè)，金櫻子活性成分7 個(gè)。見表1。

表1 芡實(shí)-金櫻子活性成分

2.2 藥物-疾病靶點(diǎn)

檢索篩選后共得到藥物靶點(diǎn)353 個(gè)，DN 靶點(diǎn)2746 個(gè)。共獲得藥物與疾病交集靶點(diǎn)196 個(gè)，其中金櫻子單獨(dú)關(guān)聯(lián)DN 靶點(diǎn)162 個(gè)，芡實(shí)單獨(dú)關(guān)聯(lián)7 個(gè)，藥對(duì)共同關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)27 個(gè)。

2.3 靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

構(gòu)建芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，見圖1。圖中196 個(gè)藥物疾病交集靶點(diǎn)以矩形標(biāo)記，9 個(gè)藥物活性成分以六邊形標(biāo)記，兩者連線共438 條。藥物活性成分方面，槲皮素、山柰酚、廿碳-11-烯酸具有較多DN 相關(guān)作用靶點(diǎn)。靶點(diǎn)方面，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1、雄激素受體等靶點(diǎn)具有較高的活性成分關(guān)聯(lián)度。

圖1 芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)靶點(diǎn)關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)模型，通過拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)分析，篩選前20 的核心靶點(diǎn)，構(gòu)建核心靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)圖，得到主要核心靶點(diǎn)：絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）1、轉(zhuǎn)錄因子AP1（Jun）、MAPK3 等。見圖2。

圖2 藥物-疾病交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)蛋白網(wǎng)絡(luò)

2.5 核心靶點(diǎn)的GO 及KEGG 通路富集分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)作用靶點(diǎn)主要分子功能為核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性以及類固醇激素受體活性，主要參與對(duì)抗生素應(yīng)答、對(duì)脂多糖應(yīng)答以及對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)應(yīng)答等生物學(xué)過程，主要存在于膜筏、膜微區(qū)以及膜區(qū)域等細(xì)胞組分，見圖3。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn)AGE-RAGE 通路為核心通路，見圖4，導(dǎo)出該通路圖并將藥對(duì)作用靶點(diǎn)標(biāo)記為灰色，見圖5。

圖3 藥對(duì)-疾病相關(guān)靶點(diǎn)GO 富集分析結(jié)果

圖5 AGE-RAGE 通路圖

2.6 核心成分靶點(diǎn)分子對(duì)接

選取AGE-RAGE 通路多條核心通路為切入點(diǎn)，分別選取MAPK 通路核心靶點(diǎn)MAPK1 與主要成分槲皮素進(jìn)行分子對(duì)接（結(jié)合能為-8.0 kcal/mol），PI3K-Akt 通路核心靶點(diǎn)Akt1 與成分山柰酚分子對(duì)接（結(jié)合能為-8.1 kcal/mol），下游核心炎癥因子轉(zhuǎn)錄因子AP1（Jun）與山柰酚分子對(duì)接（結(jié)合能為-9.2 kcal/mol），NF-κB 家族蛋白R(shí)ELA 靶點(diǎn)與槲皮素分子對(duì)接（結(jié)合能為-7.4 kcal/mol），構(gòu)建分子對(duì)接模式圖。見圖6。

圖6 核心成分靶點(diǎn)分子對(duì)接模式圖

3 討論

DN 屬中醫(yī)消渴病腎病范疇，是由于脾虛無力統(tǒng)攝精微、腎虛封藏失職，痰熱郁瘀積聚于腎之絡(luò)脈，導(dǎo)致精氣下瀉，即出現(xiàn)蛋白尿[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為DN 的發(fā)病機(jī)制與晚期糖基化終末產(chǎn)物生成增多[7]、蛋白激酶C激活、多元醇活躍及氧化應(yīng)激增強(qiáng)等多種糖脂代謝密切相關(guān)[8]，可導(dǎo)致腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞凋亡、系膜細(xì)胞外基質(zhì)堆積及腎小球基底膜增厚，從而出現(xiàn)尿蛋白增多及腎功能惡化[9]。

芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)出自水陸二仙丹，芡實(shí)可益腎固精，金櫻子可固精縮尿，兩者相須為用，具有平補(bǔ)脾腎、收斂固攝之效[10]。金櫻子的核心成分槲皮素、山柰酚，在DN 的治療中發(fā)揮著主要作用。槲皮素可以抑制凋亡蛋白半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、白細(xì)胞介素-1β 的表達(dá)，起到抗凋亡作用[11]，抑制足細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子[12]，起到腎臟保護(hù)作用。山柰酚可抑制DN 大鼠腫瘤壞死因子-α 等炎癥因子的表達(dá)，對(duì)DN 大鼠腎功能起保護(hù)作用[13]。除此之外，金櫻子多種成分均關(guān)聯(lián)了靶點(diǎn)AR、孕酮受體，發(fā)揮著類固醇激素受體功能。而有研究證實(shí)，調(diào)節(jié)機(jī)體性激素水平，可一定程度上改善腎臟損傷[14]。而芡實(shí)主要活性成分如β-胡蘿卜素及維生素E，具有一定的抗氧化作用[15]，在兩藥配伍中發(fā)揮著協(xié)同增效的抗氧化作用。

通過GO 富集分析，本研究發(fā)現(xiàn)芡實(shí)、金櫻子靶點(diǎn)主要位于細(xì)胞膜區(qū)，發(fā)揮著細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及核轉(zhuǎn)錄在內(nèi)的多種生物功能，完成對(duì)脂多糖、氧化應(yīng)激的多重調(diào)控作用。通過對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG 通路富集分析及分子對(duì)接驗(yàn)證，本研究發(fā)現(xiàn)芡實(shí)、金櫻子主要作用于AGE-RAGE 信號(hào)通路，及其下游MAPK、PI3k-Akt、NF-κB 等多個(gè)信號(hào)通路，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抗纖維化等多重腎臟保護(hù)功能。

AGE-RAGE 通路，可致活性氧的產(chǎn)生增加，加重腎小球系膜細(xì)胞損傷及足細(xì)胞凋亡[16]。MAPK 通路是細(xì)胞生長(zhǎng)及炎癥反應(yīng)應(yīng)答的重要通路，可激活下游復(fù)雜炎癥反應(yīng)通過轉(zhuǎn)錄因子AP1（Jun）、NF-κB，起到增加活性氧、激活RAS 系統(tǒng)、調(diào)節(jié)炎癥因子釋放等多種病理作用[17]，是DN 發(fā)展惡化的重要反應(yīng)通路[18]。PI3k-Akt 通路是AGE-RAGE 下游重點(diǎn)通路之一，是保腎藥物抑制細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵通路[19]。研究發(fā)現(xiàn)，PI3k在DN 模型大鼠組織中高表達(dá)[20]，同時(shí)尿蛋白定量的降低與PI3K-Akt 通路中的PI3K、Akt、mTOR 蛋白表達(dá)作用相關(guān)[21]，可見該通路發(fā)揮了延緩DN 患者腎臟損傷的作用。

作為MAPK、PI3k-Akt 通路下游共有的核心通路，NF-κB 信號(hào)通路在DN 發(fā)展過程中，參與免疫、炎癥及細(xì)胞凋亡多種重要生物學(xué)過程[22]，而MCP-1 蛋白在通路中起重要的介導(dǎo)作用[23]。有研究指出，DN 病程中機(jī)體內(nèi)炎癥因子NF-κB、MCP-1 水平與尿蛋白的水平呈正相關(guān)[24]，在DN 炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用[25]。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步分析了芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)治療DN 的可能機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，芡實(shí)-金櫻子藥對(duì)的調(diào)控作用主要涉及AGE-RAGE信號(hào)通路及其下游MAPK、PI3k-Akt、NF-κB 等多個(gè)信號(hào)通路，涵蓋了多途徑、多靶點(diǎn)調(diào)控復(fù)雜炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激過程，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床藥理研究提供線索和依據(jù)。