亢愷雯 尹發(fā)明 王 淵 袁 偉 魯 剛 白秋菊 王 強
1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,陜西咸陽 712046;2.青島市中醫(yī)醫(yī)院康復(fù)科,山東青島 266000;3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,陜西咸陽 712046
帕金森病(Parkinson disease,PD)又稱為震顫麻痹,多好發(fā)于中老年人,其發(fā)病率隨著年齡增長逐年升高[1]。臨床發(fā)現(xiàn)PD 大部分為散發(fā),約20%患者有家族遺傳史[2]。其典型臨床表現(xiàn)為肌肉強直、運動遲緩、震顫等運動系統(tǒng)癥狀,部分患者存在嗅覺障礙[3]。病理表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元大量丟失,紋狀體內(nèi)多巴胺水平顯著降低[4]。
還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)是小膠質(zhì)細胞激活后產(chǎn)生的氧化酶。胞質(zhì)內(nèi)的亞基p47phox 轉(zhuǎn)移至細胞膜與p22phox 共同產(chǎn)生損傷神經(jīng)元的超氧自由基O2-[5-6]。LPS 來源于細胞壁,可激活小膠質(zhì)細胞分泌炎癥因子損傷黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元[7]。本研究擬通過經(jīng)鼻滴注脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)構(gòu)建小鼠PD 模型,觀察“嗅三針”對PD 小鼠黑質(zhì)區(qū)NADPH 氧化酶亞基p22phox 及p47phox 蛋白表達的影響,探究“嗅三針”對PD 小鼠的抗氧化應(yīng)激作用機制。
選取40 只6~8 周清潔級成年健康雄性質(zhì)量22~25 g 的C57BL/6 小鼠,恒溫22℃,濕度40%~70%,適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。動物由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供,實驗使用許可證號:SYXK(陜)2018-001,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2020-001。對動物處理遵循2006 年國家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)規(guī)定[8]。
LPS(美國Sigma 公司,批號:SV30010);芐絲肼(美國Sigma 公司,批號:FSP100);左旋多巴(美國Sigma 公司,批號:GKT137831);抗p47phox 抗體兔來源多克?。ㄓ鴄bcam,批號:ab166930);抗p22phox抗體兔來源多克?。ㄓ鴄bcam,貨號:ab75941);SABC(兔IgG)免疫組織化學(xué)試劑盒(英國abcam,批號:SA1022);DAB 顯色劑(biosharp,貨號:AR1022);BA200Digital 數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng);組織切片機(德國Leica 公司);SDZ-Ⅱ型電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);小動物呼吸機(瑞沃德R407)。
按照隨機數(shù)字表法將40 只小鼠分為空白組、模型組、左旋多巴組、電針組,每組10 只,對除空白組外的小鼠進行造模。氣體乙醚麻醉小鼠后,提起頸部,將10 μl LPS(濃度:1 g/L,溶于0.9%氯化鈉溶液中)用移液槍緩慢滴加入鼻孔。每日1 次,共1 個月,出現(xiàn)PD體征視為造模成功??瞻捉M滴入等量的0.9%氯化鈉溶液[9]。
1.4.1 電針組 參照《實驗針灸學(xué)》進行穴位定位[10],“印堂”穴:內(nèi)眥連線中點上2 mm 處?!坝恪毖ǎ罕乔煌鈧?cè)向上被毛分界處。迎香穴為斜刺,指向內(nèi)上方約30°角,印堂穴為平刺,指向鼻根,進針均為3 mm。參數(shù)設(shè)置:疏密波,頻率為2 Hz/100 Hz;正極接印堂穴,負極接迎香穴(每側(cè)10 min,共20 min),電流強度為1 mA;電針干預(yù)與造模當(dāng)日同步進行,每日1 次,5 d為1 個療程,療程間休息2 d,總共2 個療程。
1.4.2 左旋多巴組 每日定時腹腔注射0.2 ml 復(fù)方左旋多巴注射液(2.5 mg/kg 的芐絲肼與10 mg/kg 的左旋多巴共同溶解于0.9%氯化鈉溶液中),每日1 次,5 d為1 個療程,療程間休息2 d,總共2 個療程。
1.4.3 模型組及空白組 模型組與空白組進行與電針組和左旋多巴組相同程度的抓取,不對其固定及進行其他干預(yù)。
自發(fā)交替行為(spontaneous alternation behavior,SAB)測試:采用Y-maze 裝置在黑暗環(huán)境中對小鼠進行自發(fā)交替行為的探索和空間記憶能力的評估。實驗前30 min 暗適應(yīng)。將小鼠放入Y-maze 的任一臂中,閉合上方遮光擋板,觀察并記錄其活動情況。每只小鼠測試1 次,每次10 min,記錄其進入不同臂的順序,統(tǒng)計總進臂次數(shù)及正確率。
4%多聚甲醛固定小鼠腦組織,包埋后以5 μm 厚度連續(xù)切片(黑質(zhì)部分),烘干處理。脫蠟水化,放入檸檬酸抗原修復(fù)液中,中火15 min,PBS 清洗,封閉,孵育一抗:抗p22phox(濃度1∶100),抗p47phox(濃度1∶50),4℃過夜。室溫放置30 min 后PBS 沖洗,孵育二抗,PBS 沖洗,滴加SABC 1 h,加顯色劑DAB 在暗處避光顯色。沖洗后蘇木精復(fù)染1 min,脫水后透明封片,鏡下觀察陽性細胞數(shù)目并拍片。
采用SPSS 17.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,多組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P <0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與空白組比較,模型組總進臂次數(shù)及正確率均明顯減少(P <0.01);與模型組比較,電針組總進臂次數(shù)增加,正確率提高(P <0.05)。見圖1。
與空白組比較,模型組黑質(zhì)區(qū)p47phox、p22phox蛋白陽性細胞數(shù)均明顯增加(P <0.01);與模型組比較,電針組中黑質(zhì)區(qū)p47phox、p22phox 蛋白陽性細胞數(shù)均降低(P <0.05)。見圖2~3。
圖2 各組小鼠黑質(zhì)中p47phox 蛋白表達比較
圖3 各組小鼠黑質(zhì)中p22phox 蛋白表達比較
NADPH 氧化酶的功能為傳遞細胞間信號、改善記憶,其胞膜含催化亞基p22phox,胞漿含調(diào)節(jié)蛋白p47phox 等[11-12]。激活時p47phox 磷酸化并結(jié)合p22phox導(dǎo)致胞質(zhì)蛋白移位至胞膜形成酶活性復(fù)合物[13],傳遞電子形成超氧化物并產(chǎn)生活性氧自由基(reactive oxyradical,ROS)[14]。本研究結(jié)果顯示p47phox、p22phox在LPS 誘導(dǎo)的PD 模型中表達增加,電針干預(yù)可減少關(guān)鍵性調(diào)節(jié)亞基表達。
PD 患者黑質(zhì)細胞遭受氧化應(yīng)激損傷[15],氧化應(yīng)激可促進致病蛋白質(zhì)聚集,干擾自噬[16]。多巴胺代謝失衡可破壞體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)[17],NADPH 復(fù)合物是細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的主要來源[18]。ROS 激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生大量毒性物質(zhì),對神經(jīng)元產(chǎn)生不可逆的損傷[19-21]。小膠質(zhì)細胞增殖后介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷可導(dǎo)致PD 慢性炎癥[22-23]。在MPP+誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元中加入NADPH 非特異性抑制劑加拿大麻素,可減緩神經(jīng)元損傷[24]。NADPH 氧化酶是潛在的PD干預(yù)靶點[25],電針干預(yù)可能通過相似機制作用于PD進展。
中醫(yī)認為PD 歸于“顫證”“痙病”。迎香穴屬手陽明大腸經(jīng)可治療嗅覺障礙;印堂穴屬督脈可醒腦開竅。本研究結(jié)果顯示,早期電針干預(yù)抑制了NADPH 氧化酶并減弱了氧化應(yīng)激所帶來的損傷,改善了LPS 誘導(dǎo)小鼠的探索和空間記憶能力障礙,為“嗅三針”治療PD 增加新的理論依據(jù)及治療靶向。