樊 榮，馬國華，于珊珊

（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院, 遼寧沈陽 110032）

近年來大量的研究表明，過量的脂肪攝入會(huì)導(dǎo)致機(jī)體增加罹患非酒精性脂肪肝和糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重威脅了公眾健康[1-2]。非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是由脂質(zhì)代謝異常和脂肪過度堆積而引起的肝臟代謝紊亂性綜合征[3-4]，是一種臨床常見的慢性疾病[5]，并且患病率在全球范圍內(nèi)逐年上升，已經(jīng)成為威脅人民健康的最常見的三大肝病之一[6-7]。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制并不是完全清楚，有學(xué)者提出的“二次打擊”學(xué)說已經(jīng)得到普遍認(rèn)同[8]，即不健康的生活方式和飲食習(xí)慣會(huì)引起肝部脂肪積聚，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性及細(xì)胞持續(xù)損傷（一次打擊），進(jìn)而誘發(fā)炎性細(xì)胞因子、線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激的相互作用，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷和脂肪性肝炎（二次打擊），并且已經(jīng)證明了氧化應(yīng)激、脂質(zhì)在肝部過度貯積及炎癥反應(yīng)等方面與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)[9-10]。研究表明，NAFLD若不及時(shí)干預(yù)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化和肝癌，然而目前尚缺乏明確的藥物治療手段。因此，尋找高效治療NAFLD病癥的藥物是全人類健康事業(yè)的共同挑戰(zhàn)。

天麻（Gastrodia elataBlume）又名赤箭、獨(dú)搖芝、離母等[11]，為蘭科（Orchiidaceae）植物天麻的干燥塊莖，被《神農(nóng)本草經(jīng)》列于上品，是我國傳統(tǒng)名貴中藥，主要分布于四川、陜西、河南等地。我國傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為天麻具有平肝熄風(fēng)、鎮(zhèn)靜安眠的功效[12]，并且現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，天麻具有強(qiáng)效的鎮(zhèn)靜、抗驚厥、改善血管微循環(huán)及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[13-17]，因而天麻具有廣泛的藥用價(jià)值。此外，天麻還是重要的藥食兩用資源，已被我國食品藥品監(jiān)督管理局（CFDA）列入可用于保健食品的名錄[18]。值得一提的是，我國民間自古以來就有食用天麻的習(xí)慣，傳統(tǒng)食用方式主要是作為煲湯或蒸煮直接食用。隨著生活水平的提高和人們健康意識(shí)的增強(qiáng)，以天麻為主要原料的高檔補(bǔ)益和保健產(chǎn)品已被廣泛研究和開發(fā)。目前，市場上銷售的天麻保健品多種多樣，被CFDA批準(zhǔn)的保健食品達(dá)30余個(gè)品種，主要有復(fù)方的保健品和營養(yǎng)液，其他劑型主要有膠囊劑、顆粒劑、片劑和散劑等[19]。此外，天麻加工食品主要有蜜餞片、咀嚼片和天麻果脯等，許多已獲得國家發(fā)明專利，市場前景非常廣闊。

天麻的主要成分為天麻素、酚類、有機(jī)酸類、多糖類及甾體類等[20]，但目前大多數(shù)對天麻的研究主要集中在天麻素及其苷類和酚類成分[21]，對天麻多糖及其組分研究報(bào)道甚少。天麻中多糖含量豐富，占天麻中總成分的25%[22]。近年來，大量的研究已經(jīng)證明，天麻多糖具有多種藥理活性，如抗炎、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫功能、保肝及降血脂等重要的藥理作用[23-27]。然而，到目前為止并未見天麻多糖對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD的改善研究。同時(shí)，由于NAFLD發(fā)病常會(huì)伴隨機(jī)體炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞凋亡加劇[28]，因此本項(xiàng)研究建立在天麻多糖多種藥理作用的基礎(chǔ)上，以高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型為研究對象，研究天麻多糖對NAFLD小鼠炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷及細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用，探索天麻多糖改善NAFLD癥狀的可能機(jī)制，同時(shí)評價(jià)天麻多糖的保肝效果，以期為開發(fā)治療NAFLD的新藥和保健產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SpectraMax M2型酶標(biāo)儀 美國Molecular Devices；Mx3000P型 熒 光 定 量PCR儀 美 國Aligent公司；Fresco 21型微量離心機(jī)、NanoDrop 2000型核酸/蛋白定量儀 美國Thermo公司；BUCHI R300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、AOD-756PC型紫外分析儀、B-585型真空冷凍干燥機(jī) 瑞士步琪（Buchi）有限公司；Olympus BX-60型光學(xué)顯微鏡 日本Tokyo公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供試藥液的制備 稱取天麻樣品粉末藥材100.10 g，加入5倍體積的70%乙醇溶液，常溫條件下攪拌提取3 h，8000 r/min離心15 min。去除上清液，取沉淀，加入8倍體積的水，90 ℃水浴2 h，間歇攪拌，待冷卻后，于8000 r/min離心45 min。取上清液進(jìn)行濃縮，濃縮液加入3倍體積的無水乙醇進(jìn)行醇沉，靜置過夜，8000 r/min離心30 min，取沉淀并凍干，得到天麻多糖樣品，備用。采用劉濤等[29]方法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品通過苯酚-濃硫酸法于490 nm處測定吸光度值建立多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用回歸方程y=0.0037x+0.0471 （R2=0.9954）計(jì)算得天麻多糖的含量為86.4%。

1.2.2 分組及處理 所有實(shí)驗(yàn)程序經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)執(zhí)行。所有動(dòng)物飼養(yǎng)在具備動(dòng)物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)許可的專業(yè)動(dòng)物房內(nèi)，在特定的無病原體條件下（控制溫度18～28 ℃，濕度30%～80%），每籠飼養(yǎng)4～5只，并飼喂標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室食品且保證自由飲水喂食。

所有實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為正常組（Normal）、脂肪肝模型組（Model）、天麻多糖低劑量組（50 mg/kg，GBP-L）、天麻多糖中劑量組（100 mg/kg，GBP-M）、天麻多糖高劑量組（200 mg/kg，GBP-H），每組12只[30-31]。除正常組小鼠給予標(biāo)準(zhǔn)飼料（玉米粉27%、麩皮19%、大米16%、豆餅16%、魚粉13%、鈣粉3%、骨粉3%、酵母粉2.3%、食鹽0.5%、復(fù)合維生素0.1%、微量元素0.1%）外，其余各組小鼠給予高脂飼料（10.0%豬油、20.0%蔗糖、10.0%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉和59.5%常規(guī)飼料）飼養(yǎng)。同時(shí)，各給藥組小鼠以灌胃給藥的方式給予相應(yīng)劑量的藥物（灌胃體積為0.1 mL/10 g），正常組及模型組小鼠均以相同的給藥方式給予0.9%生理鹽水，每 d給藥1次，連續(xù)10周。

末次給藥30 min后，稱取小鼠體質(zhì)量，之后將所有小鼠脫頸椎處死，收集血液，4 ℃、4000 r/min離心10 min，分取血清，按照試劑盒說明書方法測定生化指標(biāo)。同時(shí)，迅速將收集的肝臟，脾臟及腎臟用生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，用于計(jì)算各臟器指數(shù)。并從每只小鼠肝左葉的相同部分切除一小塊肝組織，然后固定于10%的福爾馬林溶液中用于病理學(xué)染色分析。剩下的肝臟樣本徹底洗凈后保存于-80 ℃，用于勻漿制備和蛋白質(zhì)印跡分析[32]。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 將肝臟樣品用10%甲醛緩沖液固定24 h以上。用石蠟包埋后切片成5 μm厚的切片，常規(guī)H&E染料對肝組織進(jìn)行染色并使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。通過Ridit分析法來分析肝細(xì)胞壞死程度[33]。

1.2.4 生化指標(biāo)的檢測 依據(jù)生化試劑盒說明書測定血清中兩個(gè)重要的肝功能指標(biāo)：ALT和AST；同時(shí)測定血清中脂質(zhì)代謝水平，包括TC、TG、HDLC和LDL-C 四個(gè)生物活性指標(biāo)。

使用商業(yè)試劑盒測定肝組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、CAT和GSH，從-80 ℃取出肝臟樣本，并用冰冷的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.4）進(jìn)行勻漿，然后在4 ℃下離心10 min，利用上清測定SOD、CAT和GSH水平[34]。此外，勻漿液用于測定MDA含量。

微表處作為一種常見的養(yǎng)護(hù)維修技術(shù)，具備經(jīng)濟(jì)、快速的優(yōu)點(diǎn)，一般用來修復(fù)裂縫與車轍等病害[1]。本文首先介紹纖維微表處中纖維的作用機(jī)理，對纖維微表處提出施工建議，并基于某高速實(shí)際路面養(yǎng)護(hù)維修技術(shù)進(jìn)行應(yīng)用研究，提高養(yǎng)護(hù)維修工程的施工質(zhì)量，以增加路面的使用壽命。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定肝臟中NF-κB, TNFα和IL-1β稱取小鼠肝組織50 mg，置于經(jīng)過高壓滅菌的研缽中，加入液氮進(jìn)行充分研磨；將研磨好的粉末分取放入1.5 mL離心管中，靜置5 min，加入1 mL的裂解液裂解1 min，再按照提取總RNA試劑盒提取組織中RNA；分取1 μL總RNA加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA模版，并以此為模版利用SYBR?Premix Ex Taq TM II試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)所使用的引物序列如表1，反應(yīng)條件在95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，退火溫度為55 ℃、30 s，并進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。相對mRNA表達(dá)=2-△△Ct。

表1 引物序列Table 1 Sequence of the primes for RT-PCR amplification

1.2.6 免疫印跡分析 稱取部分肝組織，加入RIPA裂解液（1:10，m/v）對肝組織進(jìn)行勻漿，離心，提取總蛋白。再利用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測量蛋白質(zhì)濃度并統(tǒng)一至5 mg/mL。上樣量為20 μL，轉(zhuǎn)膜后用含有5%的脫脂奶粉封閉至少1 h。將膜于4 ℃下用一抗iNOS（1:3000），COX-2（1:2000），Bax（1:2000），Bcl-2（1:2000）和β-action（1:2000）孵育過夜[32]。然后，于二抗中在室溫下孵育1 h。使用ECL發(fā)光液檢測信號，條帶的強(qiáng)度通過光密度進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用t檢驗(yàn)對各組數(shù)據(jù)的差異性進(jìn)行比較，P＜0.05表示差異顯著，所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SEM）表示。結(jié)果數(shù)據(jù)圖表用（GraphPad Prism 6.0（ISI?, USAISI?,USA）制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻多糖對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

如表2所示，與正常組相比，模型組小鼠體重顯著升高（P＜0.01）。但是，經(jīng)天麻多糖（GBP）治療后，各給藥組小鼠體重明顯減輕并趨于正常組，其中GBP-高劑量組極顯著（P＜0.01）。同時(shí)，與正常組相比，模型組小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。然而，在經(jīng)三個(gè)給藥治療組（50、100和200 mg/kg）改善治療后，雖然小鼠的肝臟和脾臟指數(shù)與模型組相比有一定程度地降低，但結(jié)果并不顯著。這些結(jié)果表明，天麻多糖對非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟和脾臟具有保護(hù)作用。

表2 天麻多糖對小鼠體重及臟器指數(shù)的影響Table 2 Effect of GBP on body weights and organ indices in mice

2.2 天麻多糖對小鼠肝組織病理學(xué)的影響

通過H&E染色對NAFLD模型肝臟組織切片進(jìn)行分析檢查。如圖1和表3所示，正常組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰、完整。肝細(xì)胞規(guī)則排列，細(xì)胞核形態(tài)無異常且位于細(xì)胞中央，胞漿完整均勻。然而模型組小鼠肝細(xì)胞有輕度水腫，輕度脂肪變性和少量炎性浸潤，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的脂滴空泡現(xiàn)象，還有少數(shù)的細(xì)胞核消失，這些典型的病理特征證實(shí)了長期高脂誘導(dǎo)非酒精性脂肪肝模型的成功建立。經(jīng)天麻多糖高、中、低三個(gè)劑量組治療的肝臟結(jié)構(gòu)清晰，排列較為整齊，水腫和脂滴空泡現(xiàn)象均有不同程度的改善。同時(shí)，結(jié)合表3的組織損傷等級評分和Ridit分析，結(jié)果均表明天麻多糖治療后顯著改善了肝臟病理學(xué)損傷，進(jìn)一步證實(shí)了天麻多糖對NAFLD模型肝臟損傷的改善作用。

圖1 各組肝組織蘇木精-伊紅染色（H&E）切片F(xiàn)ig.1 Liver sections of each group after hematoxylin-eosin（H&E）staining

表3 肝臟的病理學(xué)改變及Ridit分析Table 3 Pathological changes in the liver and Ridit analysis

2.3 天麻多糖對血清生化指標(biāo)的影響

為評估天麻多糖（GBP）對NAFLD小鼠肝功能的影響，本研究檢測了血清中兩種重要肝損傷標(biāo)志物酶（ALT和AST）的水平。如圖2A和B所示，與正常組相比，持續(xù)高脂飼料誘導(dǎo)后ALT和AST活力極顯著上升（P＜0.01），這說明NAFLD模型小鼠肝部受損嚴(yán)重；與脂肪肝模型組相比，用天麻多糖（GBP）處理能顯著緩解這兩個(gè)指標(biāo)的增加（P＜0.05、P＜0.01），表明天麻多糖（GBP）能有效改善高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型肝功能損傷。同時(shí)，為考察NAFLD模型小鼠脂質(zhì)代謝水平，本研究還測定了TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。由圖2C～F可知，與正常組相比，模型組小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量均極顯著升高（P＜0.01），而HDL-C含量則極顯著降低（P＜0.01）。然而，與脂肪肝模型組相比，天麻多糖各劑量組（50、100和200 mg/kg）可顯著降低TG、TC和LDL-C的含量（P＜0.05），同時(shí)顯著升高HDLC含量（P＜0.05），并且天麻多糖高劑量組（200 mg/kg）具有更好的效果。

圖2 天麻多糖對小鼠血清中ALT、AST（A、B）和脂代謝指標(biāo)TC、TG、HDL-C和LDL-C（C、D、E和F）的影響Fig.2 Effect of GBP on ALT, AST （A, B） and lipid metabolism indicators TC, TG, HDL-C and LDL-C （C, D, E and F） in serum

2.4 天麻多糖對氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

NAFLD模型肝組織中會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，如圖3 A～D研究結(jié)果表明，高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型會(huì)導(dǎo)致小鼠肝臟組織中GSH的消耗，降低SOD和CAT活性，并使MDA水平極顯著升高（P＜0.01），而用天麻多糖（GBP）處理后，肝臟中SOD、CAT活性和GSH含量顯著升高（P＜0.05），MDA水平則顯著降低（P＜0.05）。

圖3 天麻多糖對小鼠肝臟中MDA水平和SOD、GSH、CAT活性的影響Fig.3 Effects of GBP on level of MDA and the activities of SOD, GSH, CAT in liver tissues of mice

另外，已經(jīng)證明持續(xù)性高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD模型引發(fā)的肝毒性疾病中，線粒體功能和過氧化物酶體氧化不飽和脂肪過程中會(huì)引起活性氧（ROS）的過度激活，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量自由基，并與氧化磷酸化特定位點(diǎn)結(jié)合，加劇肝細(xì)胞中氧化應(yīng)激損傷[9]。因此，本研究評估了天麻多糖（GBP）對幾種氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙標(biāo)志物mRNA表達(dá)的影響，如圖4 A～D所示，與模型組相比，天麻多糖（GBP）預(yù)處理會(huì)顯著增加Nrf2、GPx1、GPx2和GRmRNA表達(dá)量（P＜0.05）。這些數(shù)據(jù)表明，天麻多糖具有明顯的抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

圖4 天麻多糖對小鼠肝臟中Nrf2、GPx1、GPx2、GR mRNA表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of GBP on the mRNA expression of Nrf2, GPx1,GPx2 and GR in liver tissues of mice

2.5 天麻多糖對脂質(zhì)代謝水平的影響

為進(jìn)一步證明天麻多糖（GBP）對脂肪沉積清除和改善能力的分子機(jī)制，對NAFLD模型小鼠脂肪肝相關(guān)信號分子的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。如圖5 A～E所示，與正常組相比，模型組中PPARγ、SREBP1c、FAS、HMGCRmRNA表達(dá)水平極顯著升高（P＜0.01），AMPKα2則極顯著降低（P＜0.01）。相比之下，經(jīng)天麻多糖（GBP）灌胃后，PPARγ、SREBP1c、FAS、HMGCRmRNA表達(dá)量則極顯著下調(diào)（P＜0.01），并且AMPKα2基因表達(dá)顯著上調(diào)（P＜0.05）。這表明，天麻多糖（GBP）通過調(diào)節(jié)多種與脂質(zhì)積累相關(guān)的基因表達(dá)水平改善了脂質(zhì)代謝水平，從而緩解了脂肪肝疾病。

圖5 天麻多糖對小鼠肝臟中AMPKα2、PPARγ、FAS、SREBP 1c和HMGCR mRNA表達(dá)量的影響Fig.5 Effects of GBP on the mRNA expression of AMPKα2, PPARγ, FAS, SREBP 1c and HMGCR in liver tissues of mice

2.6 天麻多糖對小鼠肝部炎癥因子的影響

研究表明，NAFLD模型引起肝細(xì)胞脂肪變性及損傷，進(jìn)而誘發(fā)炎癥因子表達(dá)。在目前的研究中，通過RT-PCR分析肝組織中促炎因子NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)的NAFLD模型會(huì)導(dǎo)致NF-κB、TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），而通過GBP灌胃后則顯著（P＜0.05）抑制NF-κB、TNF-α和IL-1β的過渡表達(dá)（圖6A、B和C）。重要的是，為進(jìn)一步檢測天麻多糖對NAFLD模型的抗炎作用，本實(shí)驗(yàn)采用Western-blotting來檢測肝組織中促炎因子iNOS和COX-2蛋白表達(dá)水平。如圖6 D～F所示，脂肪肝模型組小鼠肝臟中iNOS和COX-2蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01）。然而，給予50 、 100和200 mg/kg劑量的天麻多糖可使肝組織中iNOS和COX-2的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。這些研究結(jié)果說明，天麻多糖（GBP）的保肝作用也可能在一定程度上與其抗炎作用有關(guān)。

圖6 天麻多糖對小鼠肝臟中NF-κB、TNF-α、IL-1β（A、B和C）mRNA表達(dá)和iNOS、COX-2（D、E和F）蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of GBP on NF-κB, TNF-α, IL-1β（A, B and C）mRNA expressions and iNOS, COX-2（D, E and F ）protein expressions in liver

2.7 天麻多糖對小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步分析脂肪肝細(xì)胞變性和凋亡程度的影響，采用Western-blotting分析方法測定凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)。如圖7A～C所示，脂肪肝模型組肝臟中的Bax蛋白表達(dá)極顯著升高（P＜0.01），天麻多糖給藥組中的Bax表達(dá)則顯著低于模型組（P＜0.05），而抗凋亡因子Bcl-2的表達(dá)則與Bax相反。這些數(shù)據(jù)表明，天麻多糖對NAFLD模型引起肝細(xì)胞凋亡具有明顯的改善作用。

圖7 天麻多糖對Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of GBP on the protein expression of Bax and Bcl-2

3 討論與結(jié)論

非酒精性脂肪肝病（NAFLD）是一種代謝紊亂性疾病，在世界范圍內(nèi)都具有極高的發(fā)病率，但又因其發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜且尚未完全闡明，目前尚缺乏明確的藥物治療策略[35]。近年來，大量的研究者通過高脂飲食誘導(dǎo)建立的非酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，具有成模率高、穩(wěn)定性好和死亡率低等優(yōu)點(diǎn)[36-36]。在本研究中，長期飼喂高脂飼料導(dǎo)致小鼠肥胖，肝脂肪變性和脂代謝異常，氧化應(yīng)激損傷和線粒體功能障礙，并伴隨著炎癥因子分泌增加，炎癥因子通過刺激肝臟發(fā)生炎癥，引起肝細(xì)胞壞死和凋亡，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[37-38]，這些組織病理學(xué)特征類似于NAFLD患者的臨床表現(xiàn)。而天麻多糖作為天麻中重要的活性成分，藥理學(xué)研究表明其具有抗炎、抗氧化、降血脂及保肝作用，但相關(guān)機(jī)制尚未闡明，因此，本文評估了天麻多糖對高脂誘導(dǎo)的NAFLD小鼠的保肝作用及其機(jī)制。在研究中，高脂飲食持續(xù)造模10周，結(jié)果表明高劑量天麻多糖能極顯著降低NAFLD小鼠的體重（P＜0.01）。組織病理學(xué)顯示模型組小鼠肝細(xì)胞明顯變性和炎癥細(xì)胞明顯增多；肝小葉邊界不清楚，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，肝組織呈彌漫性并空泡和氣球狀，肝組織損傷明顯和肝細(xì)胞的凋亡數(shù)量加劇。經(jīng)天麻多糖治療后能夠顯著降低凋亡細(xì)胞的數(shù)量和炎癥水平（P＜0.05）。

NAFLD是一種與血脂異常密切相關(guān)的代謝紊亂性肝損傷病，而高脂血癥是脂肪肝危害健康的重要因素，90%左右的高脂血癥患者患有脂肪肝[39]。因此血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平與脂肪肝密切相關(guān)。研究結(jié)果表明，模型組小鼠的血清中AST、ALT活性及LDL-C、TG、TC含量與正常組相比極顯著增加（P＜0.01），HDL-C含量極顯著降低（P＜0.01），而天麻多糖則顯著改善了這種改變，表明天麻多糖對脂肪肝損傷具有顯著的保護(hù)作用，并有積極的降血脂作用，改善脂質(zhì)代謝，保護(hù)肝細(xì)胞質(zhì)膜。

此外，NAFLD的嚴(yán)重程度和氧化應(yīng)激相關(guān)標(biāo)志物在肝臟中的異常表達(dá)密切相關(guān)[40]，這也是NAFLD的發(fā)病機(jī)制之一[41]。GPx是抗氧化系統(tǒng)的重要組成部分，其在肝組織中的活性最高，可以清除ROS和防止氧化應(yīng)激性肝損傷。Nrf2可調(diào)節(jié)SOD、CAT、GPX、GR等多種抗氧化酶的表達(dá)，CAT、GPx與SOD是機(jī)體內(nèi)重要的細(xì)胞保護(hù)酶，在細(xì)胞內(nèi)協(xié)調(diào)工作，共同構(gòu)建了細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，可防止細(xì)胞內(nèi)活性氧升高。本文的結(jié)果顯示，天麻多糖預(yù)處理可有效地減緩肝組織中SOD、GSH和CAT活性的降低，并降低MDA的含量，同時(shí)調(diào)節(jié)Nrf2及其下游靶基因GPx、GRmRNA的表達(dá)，表明天麻多糖可能是通過上調(diào)Nrf2/GPx信號途徑改善氧化應(yīng)激損傷、提高機(jī)體的抗氧化酶活性和抑制氧化應(yīng)激損傷對NAFLD的發(fā)生形成保護(hù)作用。

在以往的研究中發(fā)現(xiàn)，參與脂肪肝形成的大多數(shù)基因與PPAR信號通路相關(guān)，并參與到脂肪細(xì)胞分化[42]。脂聯(lián)素已被證明激活了幾乎所有主要類型的靶組織，包括骨骼肌、肝臟、和大腦中的AMPK基因家族等[43]。有研究表明，AMPKα2活化直接磷酸化SREBP-1c，從而抑制SREBP-1c前體的裂解和核移位，進(jìn)而抑制SREBP-1c介導(dǎo)的脂肪生成[44-45]。SREBP-1c主要參與脂肪酸代謝和葡萄糖代謝。葡萄糖經(jīng)糖酵解轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a，再轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶a。最后，在FAS的作用下，乙酰輔酶a和丙二酰輔酶a催化生成脂肪酸，脂肪酸經(jīng)酯化合成甘油三酯，進(jìn)而加速脂肪生成。膽固醇主要是由一系列以乙酰輔酶a為底物的酶反應(yīng)在肝臟中合成的。HMGCR是合成反應(yīng)中的限速酶[46]。本研究結(jié)果顯示，天麻多糖下調(diào)SREBP-1c，以及其下游靶基因FAS和HMGCR的RNA表達(dá)，通過抑制HMGCR達(dá)到降膽固醇的作用，表明天麻多糖可通過調(diào)節(jié)脂代謝水平改善NAFLD。

炎癥反應(yīng)在NAFLD中起著重要的作用。核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）作為一種廣泛存在于機(jī)體各種細(xì)胞的誘導(dǎo)性核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)受到外界刺激時(shí)可被激活，進(jìn)入細(xì)胞核參與炎性反應(yīng)[47]。當(dāng)NF-κB被激活后，可加強(qiáng)TNF-α和IL-1β等基因轉(zhuǎn)錄，致使其產(chǎn)生、釋放增加，最終使炎癥反應(yīng)加劇[48]。目前，NFκB被認(rèn)為是應(yīng)激反應(yīng)尤其是炎癥過程中關(guān)鍵性調(diào)控因子[49]。研究發(fā)現(xiàn)，作為重要的前炎癥基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子NF-κB，氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡與再生在肝組織中起著重要作用[50]。近年來，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB信號通路以改善肝細(xì)胞脂肪性炎性可能。反之，活化NF-κB亦可進(jìn)一步加重脂肪性肝炎的形成。而TNF-α、IL-1β作為重要的促炎因子，在加劇慢性炎癥惡性循環(huán)的同時(shí)，對維持和延續(xù)炎癥反應(yīng)起到重要作用[51-53]。在本研究中，通過RTPCR分析顯示，天麻多糖能顯著抑制NAFLD引起的炎癥細(xì)胞因子NF-κB、TNF-α和IL-1β的過度表達(dá)，這表明天麻多糖在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝毒性中具有潛在的抗炎作用。此外，免疫印跡（Westernblotting）分析結(jié)果還表明，天麻多糖預(yù)處理可有效抑制iNOS和COX-2的過度表達(dá)，這與上述研究結(jié)論相一致。

通常，細(xì)胞凋亡是平衡人體生理功能的最基本特征之一[54-55]。因此，Western-blotting分析用于證實(shí)天麻多糖的抗凋亡作用。結(jié)果顯示，天麻多糖治療后脂肪肝組織中Bax蛋白水平明顯下降，而Bcl-2蛋白表達(dá)相對升高，以上數(shù)據(jù)表明，天麻多糖能明顯抑制高脂飲食引起NAFLD肝細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果清晰地表明，天麻多糖通過調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的炎癥小體通路及降低TNFα和IL-1β促炎因子的表達(dá)水平來減輕炎癥損傷，并通過上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2及抑制Bax蛋白表達(dá)水平來抑制肝細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)Nrf2/GPx信號途徑緩解氧化應(yīng)激損傷來保護(hù)和延緩高脂飲食引起的NAFLD癥狀，具有明顯的肝臟保護(hù)作用。更重要的是，這些數(shù)據(jù)也為天麻多糖用于臨床上脂肪肝疾病的治療以及開發(fā)護(hù)肝保健藥物提供理論依據(jù)。