徐艷麗，朱明睿，孫佳寧，張 莉，馬玉潔，王子榮

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

阿勒泰脂臀羊主要產(chǎn)區(qū)集中在新疆北部的阿勒泰地區(qū)福?？h、富蘊縣、清河縣等地，2012年被評為“地理標(biāo)志產(chǎn)品”[1]。阿勒泰脂臀羊尾部呈方圓形，尾臀合一且碩大，因此也被為“大尾羊”。阿勒泰脂臀羊臀脂主要為飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸[2]。何鑫等[3]研究發(fā)現(xiàn)阿勒泰脂臀羊臀脂中含18種脂肪酸成分，包括不飽和脂肪酸8種，共占比49.30%，主要成分油酸（37.40%），還有少量的亞油酸（2.23%），單不飽和脂肪酸含量為4.70%，以亞油酸（2.23%）、亞麻酸（0.91%）及共軛亞油酸（1.56%）為主；飽和脂肪酸10種，占比50.70%，主要為棕櫚酸（20.39%）、硬脂酸（19.37%）、肉豆蔻酸（4.57%）。較高含量油酸的攝入，能夠軟化血管、促進機體新陳代謝有利于健康[4]。亞油酸作為人體必需脂肪酸對人體心血管疾病具有較好的預(yù)防作用[5]。棕櫚酸具有降血脂、抗動脈粥樣硬化、抗血小板聚集以及抗血栓形成等作用[6]。

目前對于阿勒泰羊臀脂的研究多見于提取精煉、脂肪酸組成、貯藏及綜合加工利用等方面[7-15]，而對于阿勒泰羊臀脂及其分提產(chǎn)物的營養(yǎng)健康性研究卻鮮有報道。故本研究以阿勒泰脂臀羊臀脂及其分提產(chǎn)物為實驗材料，探討脂臀羊臀脂及其不同分提產(chǎn)物的攝入對小鼠肝臟脂質(zhì)水平和氧化應(yīng)激的影響，初步探索阿勒泰脂臀羊臀脂及其分提產(chǎn)物對機體食用健康性可能產(chǎn)生的影響，為分提油脂的健康合理的運用提供理論依據(jù)，同時也為脂臀羊臀脂資源的開發(fā)和利用奠定生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿勒泰脂臀羊臀脂 購自新疆烏魯木齊華凌市場；福臨門非轉(zhuǎn)基因純香菜籽油 市售；阿勒泰脂臀羊原脂、阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物 自制；SPF級4周齡雄性昆明種（Kunming，KM）小鼠 平均體質(zhì)量（18±3）g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物通過新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物福利委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)編號：2019019；低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、甘 油 三 酯（Triglyceride，TG）、TG、HDL-C、SOD、MDA、TAOC、GSH-Px、CAT、蛋白定量測定試劑盒 南京建成生物科技有限公司。

DZF-6050LC真空干燥箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；DL-3010低溫冷卻液循環(huán)泵 上海市百典儀器廠；HS-S型組織切片機 沈陽恒松科技有限公司；HRS-22D高清恒染染色機 武漢漢谷醫(yī)療科技有限公司；Xmark酶標(biāo)儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；T6新世紀紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原脂及臀脂分提產(chǎn)物的制備 原脂的制備采用何鑫[3]的真空加熱抽提法，置于真空干燥箱70 ℃、5 h粗提得到原脂（未分提的阿勒泰脂臀羊臀脂油），密封-20 ℃凍藏備用。

阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物的制備：改進李濤[16]的溶劑法，以丙酮：原脂按2：1的比例置于冷卻液循環(huán)泵中，設(shè)置溫度32 ℃、恒溫16 h，待其充分結(jié)晶真空后抽提得到32 ℃固脂；迅速將剩余液脂置于22 ℃冷卻液循環(huán)泵中恒溫16 h使其充分結(jié)晶后真空抽提得到22 ℃固脂；12 ℃、2 ℃固脂分提操作同22 ℃固脂。得到的32、22、12、2 ℃固脂減壓揮發(fā)殘余丙酮，密封-20 ℃凍藏備用。

1.2.2 小鼠灌胃劑量的設(shè)定 中國營養(yǎng)學(xué)會的統(tǒng)計結(jié)果顯示，我國居民烹調(diào)油脂有5%～10%的居民高達95 g[17]。本研究采用魏偉[18]的方法以居民烹調(diào)油最高攝入量95 g折算為0.15 mL/10 g的灌胃劑量灌服小鼠。

1.2.3 動物實驗分組 84只雄性KM小鼠基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼喂1周，按空腹體重隨機分為灌胃20 d和灌胃40 d兩個批次，每批7組（n = 6），分別設(shè)為空白組、菜籽油組、原脂組、2 ℃固脂、12 ℃固脂、22 ℃固脂、32 ℃固脂組，自由采食飲水，單籠喂養(yǎng)。每日稱重灌胃1次，環(huán)境溫度維持在（22±2）℃，相對濕度50%～60%，每日12 h晝夜交替。

1.2.4 實驗油脂灌胃方法 菜籽油常溫下為液態(tài)，按照劑量直接灌服小鼠。原脂、32、22、12、2 ℃固脂在室溫下呈固態(tài)，參照GB/T 12766-2008中方法對原脂、32、22、12、2 ℃固脂熔點進行了測定，熔點分別 為（39.46±0.75）℃、（47.83±0.53）℃、（41.13±0.69）℃、（39.50±0.62）℃、（25.30±0.65）℃。灌胃前依次根據(jù)熔點溫度恒溫水浴加熱（1～2 min）至液態(tài)。12、2 ℃固脂熔化至液態(tài)后直接灌服小鼠，原脂、32、22 ℃固脂熔化后冷卻至小鼠體溫（38.0±1.0）℃后灌服小鼠（此時原脂、32、22 ℃固脂依舊為液態(tài)），空白組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，實驗油脂組以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)+0.15 mL/10 g的油脂灌服小鼠。

1.2.5 樣品采集及處理 分別在20、40 d結(jié)束后對小鼠禁食不禁水12 h，稱重，乙醚麻醉后斷頸處死解剖，剪取肝臟組織，生理鹽水清洗表面血液，用濾紙拭干用于后續(xù)各項指標(biāo)測定。

1.2.6 肝指數(shù)的測定 小鼠肝臟沖洗濾紙拭干后稱重，記錄肝臟濕重，用于計算肝指數(shù)。

1.2.7 肝臟組織病理學(xué)觀察 取小鼠肝左葉于5%中性甲醛溶液中固定24 h，梯度脫水，浸蠟包埋，采用蘇木精伊紅染色法染色，置數(shù)碼顯微鏡下進行病理學(xué)觀察。

1.2.8 肝臟組織脂質(zhì)含量及氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 稱取0.2 g肝組織，1:9加入預(yù)冷生理鹽水，冰水浴勻漿制備10%的肝組織勻漿，4 ℃、3000 r/min離心10 min，吸取上清液，置于4 ℃冰箱保存，以待后續(xù)各項肝臟指標(biāo)的檢測。依據(jù)試劑盒標(biāo)注的方法測定肝臟TC、TG、HDL-C、LDL-C、MDA、總蛋白含量以及SOD、T-AOC、GSH-Px、CAT活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，相同時間多組間比較采用One way ANOVA檢驗，同組不同時間上差異對比采用配對樣本T檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝指數(shù)的影響

肝臟指數(shù)是一項能夠大體地初步判斷肝臟病變程度的常用指標(biāo)。如表1所示，肝指數(shù)在20 d和40 d時各組間均無顯著性差異。隨著攝入時間的增長，菜籽油組肝指數(shù)顯著升高8.21%。本實驗結(jié)果與雷紅等[19]研究發(fā)現(xiàn)菜籽油使小鼠肝指數(shù)升高的結(jié)果一致。

表1 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝指數(shù)的影響（%）Table 1 Effects of Altay sheep buttocks fat extract on liver index of mice（%）

2.2 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝臟組織顯微病理學(xué)的影響

對20 d和40 d小鼠肝臟組織解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，各組小鼠肝臟均色澤紅潤，大小正常，外形齊整，分葉清晰，肝葉邊緣銳利，未見明顯腫大、淤血、脂肪顆粒聚集等實質(zhì)性損傷或病變。從圖1和圖2中可以看出，小鼠肝臟切片中，肝小葉位置、肝細胞索、門管區(qū)均可明顯區(qū)分，肝細胞形態(tài)正常，細胞間隙適中，無明顯脂肪組織的浸潤，肝細胞無壞死，均未造成小鼠肝臟器質(zhì)性病變。說明高膳食的菜籽油與原脂及其分提產(chǎn)物均不會造成小鼠肝臟組織器質(zhì)性病變。孫宗揚等[20]以牛羊油脂0.2 mL/10 g的劑量灌胃小鼠研究發(fā)現(xiàn)牛羊油脂不影響小鼠肝臟正常結(jié)構(gòu)，這與本實驗中原脂組小鼠肝臟病理解剖學(xué)觀察結(jié)果相近。

圖1 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對20 d小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察（200×）Fig.1 Histopathological observation of 20 d mice liver by the Altay sheep buttocks fat extract（200×）

圖2 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對40 d小鼠肝臟組織病理學(xué)觀察（200×）Fig.2 Histopathological observation of 40 d mice liver by the Altay sheep buttocks fat extract（200×）

2.3 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響

肝臟是脂類代謝主要器官[21]，在脂類合成的消化和吸收、合成、分解與運輸中均具有重要作用。人體的TC主要是由肝臟合成，檢測肝細胞中的TC含量可一定程度上反映肝臟合成內(nèi)源性TC的總量，并間接反映機體TC的代謝情況[22]。儲存在肝臟中的脂肪更多是TG，大量攝入的外源脂肪會增加肝臟中脂肪酸的合成、氧化紊亂、脂質(zhì)分解和輸出減少，均可引起TG在肝臟內(nèi)的貯積[23]。肝臟中可將過量TG轉(zhuǎn)變?yōu)橹?，逐漸積聚并膨脹肝細胞，從而引起脂肪肝的發(fā)生[24]。通過檢測肝細胞中TG的含量，可以在一定程度上反映肝細胞脂肪病變的狀態(tài)。臨床上以肝臟中的TC、TG、HDL-C、LDL-C基礎(chǔ)指標(biāo)檢測肝臟脂質(zhì)水平。

20 d肝臟脂質(zhì)水平如表2所示，與空白組對比，菜籽油組、原脂組TC、LDL-C、HDL-C水平無顯著差異（P＞0.05），而TG水平顯著降低（P＜0.05），羊臀脂分提產(chǎn)物TC、TG水平均顯著低于空白組（P＜0.05），各組TC含量下降水平：12 ℃固脂組（31.31%）、2 ℃固脂組（20.20%）、22 ℃固脂組（12.12%）、32 ℃固脂組（10.10%），TG含量下降順序：12 ℃固脂組（72.50%）、22 ℃固脂組（63.75%）、2 ℃固脂組（59.75%）、32 ℃固脂組（45.25%）、菜籽油組（15.50%）、原脂組（8.00%）。與菜籽油和原脂相比，羊臀脂分提產(chǎn)物組小鼠肝臟TC、TG水平均顯著降低（P＜0.05）。與原脂組相比，羊臀脂分提產(chǎn)物HDL-C、LDL-C含量無顯著差異（P＞0.05）。以上實驗結(jié)果顯示短時間內(nèi)高劑量攝入菜籽油、原脂、2、12 ℃固脂均不會引起小鼠肝臟脂質(zhì)水平異常，且12 ℃固脂較菜籽油和未分提的原脂更加有效促進小鼠肝臟內(nèi)脂質(zhì)的分解代謝從而具有有效控制肝臟脂質(zhì)水平的特點。

表2 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝臟脂質(zhì)水平的影響Table 2 Effects of Altay sheep buttocks fat extract on liver lipid level in mice

40 d肝臟脂質(zhì)水平如表2所示，與空白組相比，實驗油脂組肝臟HDL-C、LDL-C水平無顯著差異（P＞0.05），TC、TG水平均顯著降低（P＜0.05）。原脂組與菜籽油組相比，TG水平顯著降低17.31%（P＜0.05），TC水平下降10.00%但差異不顯著。羊臀脂分提產(chǎn)物組與原脂組相比，除32 ℃固脂組無顯著差異外其余各組TG水平均顯著下降（P＜0.05），分別 為：2 ℃固 脂 組（35.75%）、12 ℃固 脂 組（30.23%）、22 ℃固脂組（9.59%）；2、12 ℃固脂組TC水平分別顯著下降58.33%、26.39%（P＜0.05）。羊臀脂分提產(chǎn)物組與菜籽油組相比，羊臀脂分提產(chǎn)物組TG、TC水平均顯著降低（P＜0.05）。羊臀脂分提產(chǎn)物組中，2 ℃固脂組TC、TG水平最低。以上實驗結(jié)果說明長時間攝入高膳食的原脂及其分提產(chǎn)物可降低小鼠肝臟TC、TG水平，控制HDL-C水平降低；分提產(chǎn)物較菜籽油可有效降低小鼠肝臟脂質(zhì)水平，其中2 ℃固脂效果更顯著，推測這與2 ℃固脂含有較高的不飽和脂肪酸有關(guān)。長時間攝入高劑量的油脂對小鼠肝臟TC無顯著影響，長時間攝入菜籽油會顯著增高小鼠肝臟TG水平，而原脂相反。李萍[25]研究發(fā)現(xiàn)菜籽油的芥酸含量對機體的健康也有一定的影響，高芥酸含量的菜籽油會使大鼠血液及肝臟TG水平顯著上升，與本實驗中菜籽油顯著升高小鼠肝臟TG水平的結(jié)果一致。

同組不同灌胃時間結(jié)果如表2所示，空白組小鼠肝臟脂質(zhì)水平前后無顯著變化。隨著實驗油脂攝入時間的增長，實驗油脂組TC含量顯著降低（P＜0.05）；原脂組小鼠TC水平顯著下降30.09%（P＜0.05），HDL-C水平顯著升高41.67%；說明攝入時間的長短對肝臟脂質(zhì)水平影響程度存在顯著影響，隨著攝入時間的增長，使原脂組TC顯著降低、HDLC水平顯著升高。低TC、高HDL-C有助于機體脂質(zhì)代謝平衡[26]，相比較菜籽油本實驗中的原脂更有益于人體健康，可長期食用。

2.4 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響

氧化應(yīng)激是發(fā)生在自由基傳遞與抗氧化系統(tǒng)之間的平衡[27]。肝臟中過量的脂肪積累常伴隨著抗氧化酶的下調(diào)從而引起氧化應(yīng)激[28]?？寡趸甘且唤M存在于細胞環(huán)境中的蛋白質(zhì)，用以促進和調(diào)節(jié)體內(nèi)抗氧化酶清除自由基[29]。肝臟也有幾種抗氧化酶，如SOD、CAT、GSH-Px等抵御氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的自由基從而使機體免受氧化損傷[30-31]。SOD是一種重要的抗氧化酶，可以及時修復(fù)細胞并阻斷脂質(zhì)過氧化過程，抵抗和阻止多種氧自由基引起的損傷[32]。GSH-Px可促進機體中過氧化氫的分解，維持細胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性，保護細胞免受氧自由基的破壞[33]。CAT是一種存在于紅細胞及某些組織細胞的微粒體中的酶[34]，其功能是將過氧化氫轉(zhuǎn)化為水和氧氣[35]，使機體免受自由基損傷。研究發(fā)現(xiàn)，T-AOC的強弱可以反映體內(nèi)抗氧化劑之間的相互協(xié)作能力以及機體的健康狀況[36]。

20 d飼養(yǎng)小鼠肝臟氧化應(yīng)激結(jié)果如表3所示，與空白組相比，菜籽油組、原脂組的CAT、GSHPx無顯著變化，SOD活性顯著上升27.79%、30.81%（P＜0.05），T-AOC顯著增強47.62%、52.38%（P＜0.05），菜籽油組的MDA顯著高于各實驗組（P＜0.05）；臀脂分提產(chǎn)物組CAT、GSH-Px活性顯著下降（P＜0.05），2、12、22 ℃固脂組的SOD活性無顯著差異（P＞0.05），32 ℃固脂組T-AOC顯著增強（P＜0.05）。與菜籽油組對比，臀脂及其分提產(chǎn)物組MDA均顯著降低（P＜0.05）；臀脂分提產(chǎn)物組間CAT差異不顯著（P＞0.05）；2 ℃固脂組與12 ℃固脂組間SOD活性無顯著差異（P＞0.05），22 ℃固脂組的GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05），32 ℃固脂組的T-AOC顯著高于各組。說明短時間攝入原脂或分提產(chǎn)物均可減少小鼠體內(nèi)MDA積累，雖然CAT、GSH-Px活力有所下降但肝臟中總抗氧化能力顯著上調(diào)。

40 d飼養(yǎng)小鼠肝臟氧化應(yīng)激結(jié)果如表3所示，與空白組相比，菜籽油組MDA含量最高（1.50±0.10），12 ℃固脂組MDA含量最低；原脂組GSH-Px、SOD顯著上升14.57%、17.02%（P＜0.05）；32 ℃固脂SOD顯著上升12.16%（P＜0.05）；與菜籽油組相比，2 ℃固脂組的CAT、SOD活性無顯著差異（P＞0.05），32 ℃固脂組的GSH-Px、T-AOC、SOD顯著上升（P＜0.05），2 ℃固脂的GSH-Px活性無顯著差異（P＞0.05）；12 ℃固脂組T-AOC活性顯著上升（P＜0.05）。與原脂組相比，2、32 ℃固脂組的CAT活性無顯著差異（P＞0.05）；32 ℃固脂GSHPx活性無顯著差異（P＞0.05）。說明長時間攝入菜籽油有升高MDA含量降低T-AOC使機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度升高的風(fēng)險，由于32 ℃固脂組SOD、CAT、GSH-Px活性及T-AOC水平較高，因此防止氧化損傷的作用更明顯。

同一油脂不同攝入時間對小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響如表3所示，隨著試驗油脂攝入時間的增長，32 ℃固脂組、22 ℃固脂組、菜籽油組的MDA含量均顯著降低（P＜0.05）；2 ℃固脂組的小鼠肝臟CAT、GSH-Px活力顯著升高47.29%、39.93%（P＜0.05）；12 ℃固脂組、22 ℃固脂組的小鼠肝臟CAT活力顯著升高29.37%、26.67%（P＜0.05）；32 ℃固脂組的小鼠肝臟CAT、GSH-Px、SOD活力顯著上升41.96%、25.61%、30.85%（P＜0.05）；原脂組的肝臟GSH-Px顯著升高6.97%；MDA含量顯著降低43.44%，其余指標(biāo)均無顯著變化（P＞0.05）。從同一油脂不同攝入時間對小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響分析可知，長時間攝入22 ℃固脂組、32 ℃固脂組均會使小鼠肝臟脂質(zhì)過氧化物MDA含量下降，12 ℃固脂組、2 ℃固脂組攝入時間的長短對MDA含量無顯著影響；32 ℃固脂組攝入時間的長短與清除氧自由基的SOD活力呈正相關(guān)，其中32 ℃固脂組攝入時間越長抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性越強。臀脂分提產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)各種抗氧化酶類活性抑制自由基產(chǎn)生從而減少氧化損傷，這種抗氧化效果在小鼠短時間攝入和較長時間攝入都有所表現(xiàn)。在本試驗中長時間攝入菜籽油組的小鼠肝臟GSHPx活性以及T-AOC均顯著低于原脂組，這與孫海燕[37]的研究結(jié)果一致。

表3 阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對小鼠肝臟氧化應(yīng)激的影響Table 3 Effects of Altay sheep buttocks fat extract on liver oxidative stress in mice

3 結(jié)論

本研究模擬我國部分人群油脂高攝入量，以未分提的臀脂和植物油中的菜籽油為對照，研究阿勒泰脂臀羊臀脂分提產(chǎn)物對高膳食油脂攝入的小鼠肝指數(shù)、肝組織病理變化、肝臟脂質(zhì)代謝水平及氧化應(yīng)激的影響。結(jié)合各項指標(biāo)變化得出短時間內(nèi)攝入菜籽油、原脂及其分提產(chǎn)物均不會引起小鼠肝臟脂質(zhì)水平異常；原脂組TC含量隨著攝入時間的增長顯著降低而HDL-C含量顯著上升；分提產(chǎn)物中2 ℃固脂降低小鼠肝臟脂質(zhì)水平效果更顯著；而長時間高劑量攝入菜籽油會使肝臟中TG含量上升、肝指數(shù)升高，造成肝臟脂質(zhì)代謝異常的風(fēng)險，不建議長期高劑量攝入菜籽油。羊臀脂分提產(chǎn)物通過調(diào)節(jié)體內(nèi)各種抗氧化酶類活性抑制自由基產(chǎn)生從而減少氧化損傷，這種抗氧化效果在小鼠短時間攝入和較長時間攝入都有所表現(xiàn)，其中32 ℃固脂攝入時間越長抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活性越強，防止氧化損傷效果越突出。

羊臀脂分提產(chǎn)物作為改性動物油脂，模擬人體長時間的高劑量攝入未對小鼠肝臟造成器質(zhì)性損傷，具有控制小鼠肝臟脂質(zhì)的上升、改善小鼠肝臟抗氧化酶活性、減少氧化損傷的效果。研究結(jié)果與人們通常意識里認為動物油脂的攝入會引起脂質(zhì)代謝紊亂等疾病的觀念不一致，啟示動物油脂營養(yǎng)健康性的研究還需進一步的深入。