李佳美，徐 偉, ，張 雪，邵百琪，謝紅瑤，吳 凡，馬智宇，陳 華

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院, 黑龍江哈爾濱 150076；2.南通市天籟村農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司, 江蘇海門 226100）

枇杷葉又名巴葉，為薔薇科植物枇杷（Eriobobotryae japonica（Thunb.） Lindl.）的干燥葉片[1]。我國是世界上最大的枇杷生產(chǎn)國，枇杷樹是四季均枝繁葉茂的樹種，尤其初冬花芽分化前，對枇杷樹進行剪修會產(chǎn)生大量的枇杷葉。枇杷葉富含萜類、揮發(fā)油類、黃酮類、多酚類、有機酸類以及皂苷類等物質[2]。萜類是枇杷葉組織中的次生代謝物質，根據(jù)含有的異戊二烯單位數(shù)目的不同，可分為單萜、倍半萜、二萜、三萜和多萜等[3]。枇杷中主要含有的是由6個異戊二烯單位組成的熊果烷型、齊墩果烷型的五環(huán)三萜類，目前從枇杷葉中分離出的主要三萜類物質有：熊果酸、科羅索酸、委陵菜酸、齊墩果酸、山楂酸、樺木酸等[4-5]。

據(jù)《中國藥典》記載，藥用枇杷葉中齊墩果酸和熊果酸總含量大于0.70%[6]。葉廣億等[7]研究發(fā)現(xiàn)蜜炙枇杷葉水提物平喘效果明顯優(yōu)于醇提物。張娜等[8]研究了枇杷葉水提物的祛痰、止咳及抗炎作用，發(fā)現(xiàn)枇杷葉水提取物劑量為0.8～3.2 g/kg時有止咳活性。WU等[9]發(fā)現(xiàn)枇杷葉的水提物和醇提物均具有鎮(zhèn)咳祛痰作用，且黃酮含量較高的枇杷葉水提物具有較強的祛痰活性，而三萜含量較高的枇杷葉醇提物具有較強的鎮(zhèn)咳活性。HPLC-MS/MS在植物藥物分析領域被廣泛應用，不僅具有色譜的高效分離能力，同時還能得到化合物的分子量以及離子碎片等信息，可快速確定化合物的結構[10]。

2014年國家衛(wèi)健委發(fā)布關于批準枇杷葉等9種新食品原料的公告（2014年第20號），為枇杷葉用于食品加工原料提供了依據(jù)，但目前國內(nèi)外關于枇杷葉的研究主要集中在藥用成分的醇提物上，水溶性活性物質研究報道較少。本課題采用HPLC-MS/MS技術，確定枇杷葉水提組分中化合物的成分，并進一步對萜類化合物進行結構鑒定，為枇杷葉水提成分的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枇杷葉（2019年9～11月份） 采自江蘇省海門市枇杷園；纖維素酶 （ 1×104U/g ） 東恒華道生物科技有限公司；漆酶（1×105U/g） 河北仟盛生物科技有限公司；二氯苯丙氨酸 阿拉丁試劑公司；甲醇、乙腈 LC-MS級，Merck KGaA；甲酸 LC-MS級，山東西亞化學工業(yè)有限公司。

HX-MC-1實驗室微波合成儀 Thermo Vanquish UHPLC超高效液相色譜儀、Q-Exactive HF高分辨質譜儀 Thermo Fisher Scientific；Zorbax Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱Agilent Technologies。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 陰干枇杷葉粉碎過10目篩，置于潔凈的三角瓶中加入1%纖維素酶和1%漆酶，按水料比20:1 mL/g加入蒸餾水并將其攪拌均勻，置于微波反應裝置中，微波提取條件為：微波功率500 W，微波時間15 min，微波溫度50 ℃。將提取液過濾后進行旋轉蒸發(fā)濃縮，濃縮至原體積的1/5，旋轉蒸發(fā)儀設置真空度為-0.085 MPa，水浴溫度為60 ℃，轉速120 r/min[11]。

取2 mL枇杷葉水提組分于5 mL離心管中，加入1.5 mL的70%甲醇，渦旋1 min，室溫超聲提取10 min（溫度：50 ℃，功率200 W），于4 ℃冰箱冷藏浸提過夜，加入10 μL濃度為100 μg/mL的內(nèi)標溶液二氯苯丙氨酸，使樣品溶液中內(nèi)標濃度為1 μg/mL。之后4 ℃，5000 r/min離心5 min，取出上清液，根據(jù)物質內(nèi)含物含量進行稀釋，過膜上機。

1.2.2 液質條件 色譜條件：儀器分析平臺：LCMS（Thermo, Ultimate 3000LC, Q Exactive HF）；色譜柱：C18色譜柱（Zorbax Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm））；色譜分離條件為：柱溫為30 ℃；流速0.3 mL/min；流動相組成A：水+0.1%甲酸，B：純乙腈；進樣量為2 μL，自動進樣器溫度4 ℃；流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜流動相條件Table 1 Mobile phase conditions of liquid chromatography

質譜條件：正離子模式下加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；吹掃氣流速：1 Arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：330 ℃；SLens RF Level：55%。負例子模式下加熱器溫度325 ℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；吹掃氣流速：1 Arb；電噴霧電壓：3.5 kV；毛細管溫度：330 ℃；S-Lens RF Level：55%。

掃描模式：一級全掃描（Full Scan, m/z 100～1500）與數(shù)據(jù)依賴性二級質譜掃描（dd-MS2, TopN =10）；分辨率：120000（一級質譜）& 60000（二級質譜）。碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

質譜數(shù)據(jù)通過Xcalibur 2.0 for DSQ II軟件處理，結合質譜數(shù)據(jù)庫信息注釋和分類，再參考文獻報道和 PubChem，MassBank等數(shù)據(jù)庫中相同成分的碎片離子信息進行匹配分析，推測化學成分裂解規(guī)律。

2 結果與分析

2.1 枇杷葉水提組分總離子流測定結果

利用HPLC-MS/MS技術對枇杷葉水提組分在正、負離子模式下進行分析，得到的總離子流圖（TIC）如圖1、圖2所示，共檢測到120個化合物，本研究針對枇杷葉水提組分中的萜類化合物進行結構解析。包括18種萜類化合物，總相對含量1452.693 μg/mL；24種黃酮類化合物，總相對含量10378.081 μg/mL；18種酚類化合物，總相對含量36967.955 μg/mL；5種香豆素類化合物，總相對含量214.778 μg/mL；還包括16種揮發(fā)性物質、10種氨基酸、11種有機酸類和18種其他化合物。

圖1 枇杷葉水提組分正離子流圖Fig.1 Positive ion flow diagram of the water-extracted components of loquat leaves

圖2 枇杷葉水提組分負離子流圖Fig.2 Negative ion flow diagram of water-extracted components of loquat leaves

2.1.1 枇杷葉水提組分中黃酮類化合物種類及含量從枇杷葉水提組分中檢測到24種黃酮類化合物，總相對含量10378.081 μg/mL。主要包括黃酮醇類16種：槲皮素（112.970 μg/mL）、槲皮苷（25.693 μg/mL）、異槲皮苷（885.100 μg/mL）、二氫槲皮素（5.206 μg/mL）、蘆?。?273.691 μg/mL）、山奈酚（55.994 μg/mL）、二氫山奈酚（1.502 μg/mL）、金絲桃苷（22.906 μg/mL）、異鼠李素（0.537 μg/mL）、阿福豆苷（1867.205 μg/mL）、山奈酚-7-O-B-D-葡萄糖苷（13.435 μg/mL）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（12.804 μg/mL）、槲皮素-3,4'-二-O-葡糖苷（957.863 μg/mL）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（7.060 μg/mL）、萹蓄苷（槲皮素-3-O-A-L-吡喃阿拉伯糖苷）（1.704 μg/mL）、花旗松素-3-O-A-L-吡喃鼠李糖苷（440.546 μg/mL）；黃烷醇類4種：表兒茶素（83.833 μg/mL）、兒茶素（1330.307 μg/mL）、原花青素B1（2355.336 μg/mL）、原 花 青 素C1（666.048 μg/mL）；異黃酮類1種：葛根素（157.034 μg/mL）；黃酮類2種：木犀草素（47.249 μg/mL）、圣草酚（2.667 μg/mL）；二氫查爾酮1種：根皮苷（51.391 μg/mL）。

其中異鼠李素、異槲皮苷、蘆丁、葛根素等均為枇杷葉主要功效成分。異鼠李素具有抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗高血壓等作用；霍宇航等[12]對“大五星”枇杷葉中主要成分進行分析，發(fā)現(xiàn)異槲皮苷和蘆丁含量分別為8.08、3.86 mg/100 g，蘆丁作為枇杷葉中最主要的黃酮類物質，具有治療毛細血管的脆性、降膽固醇、糖尿病等作用；葛根素是一種異黃酮類物質，主要具有解酒毒、心肌保護等作用。

2.1.2 枇杷葉水提組分中酚類化合物種類及含量枇杷葉水提組分種檢測到18種多酚類化合物，總相對含量36967.955 μg/mL。主要包括羥基苯甲酸類5種：原兒茶酸（1.400 μg/mL）、沒食子酸（16.304 μg/mL）、4-甲氧基水楊酸（2.497 μg/mL）、龍膽酸（183.657 μg/mL）、高龍膽酸（56.682 μg/mL）；羥基肉桂酸類13種：咖啡酸（1.889 μg/mL）、綠原酸（219.009 μg/mL）、新綠原酸（5067.336 μg/mL）、綠原酸甲酯（31.764 μg/mL）、4-香豆酸（45.482 μg/mL）、右旋奎寧 酸（23875.628 μg/mL）、3-O-阿 魏 酰 奎 尼 酸（531.482 μg/mL）、2-羥基肉桂酸（15.804 μg/mL）、Caffeic acid hexoside（40.490 μg/mL）、Coumaroyl Hexoside（395.100 μg/mL）、Coumaroyl quinic acid（6386.499 μg/mL）、osmanthuside H（93.410 μg/mL）、反-3,5-二甲氧基-4-羥基肉桂（3.468 μg/mL）。

2.1.3 枇杷葉水提組分香豆素類化合物種類及含量5種香豆素類化合物，總相對含量214.778 μg/mL。香豆素（3.633 μg/mL）、5，7-二羥基-4-甲基香豆素（2.466 μg/mL）、羥甲香豆素（5.982 μg/mL）、7-羥基香豆素（198.719 μg/mL）、7-甲氧基香豆素（3.978 μg/mL）。香豆素類化合物常存在于白芷中，在枇杷葉水提物中首次被發(fā)現(xiàn)。袁園等[13]采用微波輔助法提取白芷中香豆素類成分發(fā)現(xiàn)其含量為11.94 mg/g。香豆素類物質具有重要生理活性：如防止凝血、抑制病毒、清除自由基、抗氧化和抗衰老等活性。

2.1.4 枇杷葉水提組分中揮發(fā)類及其他類物質 枇杷葉水提組分中還檢測到16種揮發(fā)性物質包括：大茴香醛（茴芹和山楂香氣）、茉莉酸甲酯（紅茶主體香氣）、環(huán)己基（苯基）甲醇、異佛爾酮（樟腦氣味）、麝香酮、對羥基苯甲醛、鄰苯二甲醛、3,4-二羥基苯甲醛、對羥基安息香醛、麥芽醇、4-吲哚甲醛、吲哚（茉莉花香）、4-羥基-3-甲氧基苯乙酮、苯乙酮（甜味）、呋喃酮（強烈的焦糖香氣，同時具有濃郁的水果香味及果醬味，稀釋后具有復盆子香味）、花椒油素。其中枇杷葉水提組分中麥芽醇含量最高為65.21 μg/mL，為主體呈香物質，具有草莓香氣。

此外，枇杷葉水提組分中還檢測到有機酸類11種，包括4-茴香酸、1-丁烯-2,3,4-三羧酸、檸檬酸、1-氨基環(huán)己烷羧酸、己二酸、壬二酸、α-桐酸、亞麻酸、2-羥基戊二酸、莽草酸、曲酸；氨基酸類10種，包括D-（+）-脯氨酸、谷氨酸、L-異亮氨酸、L-正亮氨酸、L-苯丙氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、2-羥基苯丙氨酸、N-果糖基異亮氨酸、2-哌啶甲酸；核苷類：鳥嘌呤、腺嘌呤；一種雙環(huán)單萘酮類：D-（+）-樟腦；一種檸檬苦素類物質：梣酮；生物堿3種：巴豆苷、甜菜堿、當歸堿；維生素類3種：泛酸、煙酸（維生素B3）、吡哆醇（維生素B6）。

2.2 萜類化合物的結構鑒定

再根據(jù)化合物的二級質譜信息，通過數(shù)據(jù)庫、分子量、質譜碎片、裂解規(guī)律、結合文獻信息等進行對比，進一步鑒定出了水提組分中18種萜類化合物的結構。萜類化合物的鑒定結果、質譜數(shù)據(jù)等信息見表2。18個萜類化合物，主要包括烏蘇烷型6種：化合物6、10、11、12、14、15；齊墩果烷型7種：7、8、9、13、16、17、18；3種倍半萜類物質：化合物3，4，5；1種二萜類物質：化合物2；1種特殊的環(huán)烯醚萜苷：化合物1?；瘜W結構式如圖3所示。

表2 枇杷葉水提組分中萜類物質的UPLC-MS /MS成分檢測鑒定結果Table 2 UPLC-MS/MS component detection and identification results of terpenoids in the water-extracted components of loquat leaves

圖3 枇杷葉水提組分中萜類化學成分結構式Fig.3 Structural formula of terpenoids in water extract of loquat leaves

根據(jù)化合物的保留時間和質譜數(shù)據(jù)，對化合物進行了鑒定。三萜皂苷類成分，在質譜中發(fā)生高能碰撞，容易脫去葡萄糖基，而對于三萜酸類成分容易失去H2O、CO等中性基團[21]。

化合物1，在正離子模式下的一級質譜為m/z 405.1408[M-H]-，提示其分子量為 406.1482。二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰243.4643，是（M-H）-脫去一個葡萄糖基后的特征碎片峰（M-H-Glu）－?；谫|譜數(shù)據(jù)、并結合文獻數(shù)據(jù)[22]比較分析最終鑒定化合物1為山梔苷甲酯，其二級質譜圖和裂解途徑解析如圖4所示。山梔苷甲酯在以往的枇杷葉活性物質中未見報道，是一種特殊的環(huán)烯醚萜類，具有鎮(zhèn)痛、抗炎和止血等功效[23]，這與枇杷葉主要功能相吻合?；衔?，其在正離子模式下的一級質譜為m/z 425.1422 [M+H]+，提示其分子量為 424.1349。二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰407.1098和365.0654，分別是（M+H）+脫去一分子水后的特征碎片峰（M+H-H2O）+和（M+H-H2O-H2-CO2）+基于質譜數(shù)據(jù)，并結合文獻數(shù)據(jù)[15-16]比較分析最終鑒定化合物2為銀杏內(nèi)酯B，其二級質譜圖和裂解途徑解析如圖5所示。

圖4 山梔苷甲酯二級質譜圖及裂解途徑Fig.4 MS spectrum and cleavage pathway of kaempferol methyl ester

圖5 銀杏內(nèi)酯B二級質譜圖及裂解途徑Fig.5 Ginkgolide B secondary mass spectrum and its cleavage pathway

銀杏內(nèi)酯B是一種二萜內(nèi)酯，為銀杏葉的主要活性物質，在以往的枇杷葉活性物質中未見報道，是有效的血小板激活因子拮抗劑，被廣泛應用于心腦血管疾病[15]。

化合物4，在正離子模式下的一級質譜為m/z 221.1906 [M+H]+，提示其分子量為 220.1830。二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰203.1797，是（M+H）+脫去一分子水后的特征碎片峰（M+H-H2O）+。基于質譜數(shù)據(jù)、并結合文獻數(shù)據(jù)比較分析最終鑒定化合物4為石竹素。化合物5，在正離子模式下的一級質譜為m/z 205.1952 [M+H]+，提示其分子量為204.1880。二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰149.1327，是（M+H）+脫 去C4H8的 特 征 碎 片 峰（M+H-C4H8）+?；谫|譜數(shù)據(jù)、并結合文獻數(shù)據(jù)[17]比較分析最終鑒定化合物5為Prespatane。

以化合物12為例，其在負離子模式下的一級質譜為m/z 487.3439[M-H]-，提示其分子量為 488.3511，二級質譜中現(xiàn)明顯的碎片離子峰487.3437?；谫|譜數(shù)據(jù)、色譜tR、并結合文獻數(shù)據(jù)[18]比較分析最終鑒定化合物12為積雪草酸，其二級質譜圖和裂解途徑解析如圖6所示?；衔?4、15、11、6、10、18、8、7、16、13結構與積雪草酸類似，皆為五環(huán)三萜類，有相似的質譜裂解規(guī)律，此處不再贅述，推測為熊果酸、科羅索酸、（1α,2α,3β,5ξ,9ξ,18ξ）-1,2,3,19-Tetrahydroxyurs-12-en-28-oicacid（熊果酸衍生物）、（3β,5ξ,9ξ）-3,6,19-Trihydroxyurs-12-en-28-oic acid（熊果酸衍生物）、3,19-Dihydroxyurs-12-ene-23,28-dioic acid（熊果酸衍生物）、齊墩果酸、三羥基齊墩果酸、光甘草內(nèi)酯、18β-甘草次酸、（3β,5ξ,9ξ）-3,23-Dihydroxy-1-oxoolean-12-en-28-oic acid（齊墩果酸衍生物）。

圖6 積雪草酸二級質譜圖及裂解途徑Fig.6 Asiatic acid secondary mass spectrum and its cleavage pathway

熊果酸及其衍生物、齊墩果酸及其衍生物均為枇杷葉主要功能成分，具有抗炎、降血糖等功效。莫穎華等[24]采用醇回流法提取枇杷葉中熊果酸和齊墩果酸總量為8.21 μg/mL，本實驗檢測到水提枇杷葉組分中熊果酸和齊墩果酸總量為16.51 μg/mL；與以往報道相比，積雪草酸、光甘草內(nèi)酯、18β-甘草次酸為首次在枇杷葉中發(fā)現(xiàn)。積雪草酸來源于積雪草，李伊莎等[25]采用HPLC法檢測醇提法提取積雪草中積雪草酸含量為1.155 g/kg，本實驗檢測到水提枇杷葉組分中積雪草酸含量為220.031 μg/mL。據(jù)報道，積雪草酸具有治療皮膚創(chuàng)傷、抗抑郁、抗阿爾茨海默病、修復神經(jīng)損傷等多種藥理作用[26]。光甘草內(nèi)酯和18β-甘草次酸是甘草的特征性成分，PELLATTI等[27]發(fā)現(xiàn)，18β-甘草次酸是持續(xù)外陰陰道念珠菌病局部治療的一種有前途的生物成分；且對引起呼吸道感染的病毒有體外抗病毒作用，如流感病毒和嚴重急性呼吸綜合征（SARS）冠狀病毒。

化合物17，其在正離子模式下的一級質譜為m/z 441.3134 [M+H]+，提示其分子量為 440.3659。二級質譜中出現(xiàn)明顯的碎片離子峰423.3627和395.3679，是（M+H）+脫去一分子水后和CO的特征碎片峰（M+H-H2O）+、（M+H-H2O-CO）+，基于質譜數(shù)據(jù)、色譜tR、并結合文獻數(shù)據(jù)[19-20]比較分析最終鑒定化合物17為櫟癭酸，其二級質譜圖和裂解途徑解析如圖7所示。

圖7 櫟癭酸二級質譜圖及裂解途徑Fig.7 Quercus acid secondary mass spectrum and cleavage pathway

櫟癭酸為A環(huán)開裂的五環(huán)三萜類化合物，常從大葉秦艽的脂溶性成分中被分離出來[28]，陳玉芬等[29]發(fā)現(xiàn)櫟癭酸可使被動皮膚過敏反應小鼠耳朵的染色變淺、腫脹程度減輕，具有體內(nèi)抗炎活性。

3 結論

利用高效液相色譜-質譜對提枇杷葉水提組分進行分析檢測及主要成分的結構鑒定，正、負離子模式下水提組分中共檢測到120個化合物。包括18種萜類化合物，總相對含量1452.693 μg/mL；24種黃酮類化合物，總相對含量10378.081 μg/mL；18種酚類化合物、總相對含量36967.955 μg/mL；5種香豆素類化合物，總相對含量214.778 μg/mL；通過數(shù)據(jù)庫、分子量、質譜碎片、裂解規(guī)律、結合文獻信息等進行對比，鑒定出18種萜類化合物的結構，主要包括烏蘇烷型6種、齊墩果烷型6種、3種倍半萜、1種二萜類物質和1種特殊的環(huán)烯醚萜苷類物質。與以報道的枇杷葉萜類物質相比，櫟癭酸、銀杏內(nèi)酯B、Prespatane、山梔苷甲酯、Icariside B5、皂皮酸、積雪草酸、18β-甘草次酸。本研究為全面解析枇杷葉水提組分提供參考，為枇杷葉水提物應用于功能食品開發(fā)研究提供依據(jù)。