周 楠，黃 鈞，文 平，何 培，劉記堂，周榮清,

（1.四川大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院, 四川成都 610065；2.四川閬州醋業(yè)有限公司, 四川南充 637455）

四川麩醋曲以大麥、次粉、麩皮、玉米等為原料，其生產(chǎn)工藝類似中國(guó)清香型白酒大曲[1]。作為粗酶制劑和菌劑，醋曲是發(fā)酵的源動(dòng)力，促進(jìn)大分子水解和各級(jí)代謝產(chǎn)物生成，這些物質(zhì)將直接或間接地影響食醋的風(fēng)味特征和功能特性。因此，優(yōu)質(zhì)醋曲對(duì)釀造高品質(zhì)食醋具有重要意義。除原料和工藝外，大曲質(zhì)量與微生態(tài)環(huán)境密切相關(guān)，而季節(jié)是影響其品質(zhì)的主要因素之一[2-5]。FU等[6]對(duì)特香型大曲的研究結(jié)果表明，夏、秋季生產(chǎn)的大曲不僅理化性質(zhì)差異顯著，而且后者的真菌多樣性比前者更高。類似地，朱文優(yōu)等[7]對(duì)夏秋兩季生產(chǎn)的高溫大曲進(jìn)行研究，結(jié)果同樣揭示了季節(jié)對(duì)群落變遷的規(guī)律是其顯著影響了真菌群落的多樣性。姚霞等[8]以可培法跟蹤冬夏兩季酒曲主要微生物的交替，得到了相似的規(guī)律。HAN等[9]研究桃花曲（春曲）和伏曲（夏曲）的微生物結(jié)構(gòu)、酶活性和風(fēng)味成分差異的結(jié)果表明，春曲的質(zhì)量高于夏曲，經(jīng)復(fù)配用于釀酒可提高基酒的產(chǎn)率和質(zhì)量。對(duì)大曲質(zhì)量的相關(guān)研究主要以酒曲為對(duì)象，然而迄今關(guān)于醋曲的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。

醋曲通常由未滅菌的谷物生料在開(kāi)放環(huán)境下生產(chǎn)，其微生物組成復(fù)雜而難以分離培養(yǎng)，應(yīng)用Illumina MiSeq測(cè)序技術(shù)能更全面且高效地獲得生物學(xué)信息。高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分別是研究非揮發(fā)組分和揮發(fā)性組分的理想手段，二者具有進(jìn)樣量小、靈敏度高、分離效率好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。因此，Illumina MiSeq測(cè)序和色譜技術(shù)被廣泛結(jié)合應(yīng)用于研究傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落多樣性及風(fēng)味物質(zhì)，如白酒、食醋、醬油等[10-13]。

本文描述了以閬州醋曲為對(duì)象，應(yīng)用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)和色譜等現(xiàn)代技術(shù)研究其理化參數(shù)、代謝組分、微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的季節(jié)特征，以及兩種不同工藝生產(chǎn)的春曲的主要差異。通過(guò)多變量統(tǒng)計(jì)方法揭示優(yōu)勢(shì)種屬與代謝組分的相關(guān)性，旨在為醋曲的生產(chǎn)及管理技術(shù)的優(yōu)化奠定重要的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋曲 春、夏、秋、冬4個(gè)季節(jié)的醋曲（分別于2019年3、6、9和12月生產(chǎn)），由四川閬州醋業(yè)有限公司提供；千禾春曲（2019年3月生產(chǎn)） 由四川千禾味業(yè)食品股份有限公司提供，接種黑曲霉強(qiáng)化所得；草酸（≥99.99%）、檸檬酸（≥99.50%）、酒石酸（≥99.50%）、L-蘋果酸（≥99.00%）、L-焦谷氨酸（≥99.50%）、琥珀酸（≥99.50%）、乙酸（≥99.70%）、乳酸（≥98.00%）及辛酸甲酯（≥99%）等 標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司；Fast DNA SPIN提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司；Agencourt AMPure Beads核酸純化試劑盒 美國(guó)Beckman Coulter公司；C18E小柱Swell科學(xué)儀器有限公司；內(nèi)標(biāo)物 準(zhǔn)確配制濃度為0.0079 g/100 mL的辛酸甲酯溶液；其它化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于本地化學(xué)試劑公司。

Trace 1300-TSQ 9000氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)Thermo Fisher Electron公司，配備VF-WAXMS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm） 美國(guó)Bellefonte公司；Agilent 1260 infinity高效液相色譜儀 美國(guó)Agilent technologies公司，配備Alltech OA-1000有 機(jī) 酸 柱（300 mm×7.8 mm） 美 國(guó)Alltech公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭美國(guó)Supelco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品取樣 在曲房常溫貯存3個(gè)月后，分別從曲堆上、中、下各層隨機(jī)取樣三塊醋曲。粉碎并混合均勻，四分法取樣500 g，分為2份。其中一份置于＜10 ℃的冰箱保存，用于常規(guī)及代謝組分分析檢測(cè)，另一份置于-80 ℃用于微生物群落多樣性等檢測(cè)。閬州春曲、夏曲、秋曲、冬曲及千禾春曲分別簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)1、L2、L3、L4和Q曲。

1.2.2 Illumina MiSeq高通量測(cè)序

1.2.2.1 DNA提取 用Fast DNA SPIN提取試劑盒，按照供應(yīng)商提供的操作步驟提取醋曲的DNA后，用1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定純度，取3 μL經(jīng)NanoDropDN-1000分光光度計(jì)測(cè)定A260和A280吸光值，根據(jù)比值確定是否有RNA和蛋白質(zhì)污染。

1.2.2.2 PCR擴(kuò)增及測(cè)序 用引物338F和806R擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因高變區(qū)V3～V4區(qū)域，使用引物ITS5F和ITS1R擴(kuò)增真菌ITS5和ITS1區(qū)域。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增操作程序按照HE等[14]所述步驟。擴(kuò)增的PCR經(jīng)Agencourt AMPure Beads純化后，送上海派森諾有限公司測(cè)序（2x300 Illumina Miseq）。

1.2.2.3 生物信息學(xué)分析 使用QIME pipeline處理原始數(shù)據(jù)，經(jīng)DATA2完成質(zhì)控、去噪、拼接和去嵌合體后，用UCLUST把相似長(zhǎng)度≥150 bp及相似度大于97%的序列聚類成可操作性單元（OTU）。通過(guò)Greengenes數(shù)據(jù)庫(kù)（Release13.8, http://greengenes.secondgenome.com/）及UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)（Release 8.0,https://unite.ut.ee/）搜尋比對(duì)完成真菌和細(xì)菌不同水平的分類。應(yīng)用PICRUSt2 （Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）軟件結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)代謝通路及組間功能差異分析。

1.2.3 水分 參照QB/T 4257-2011所述方法。用分析天平稱取5 g醋曲，置于105 ℃下烘干至恒重，計(jì)算其水分含量。

1.2.4 酸度 參照方法同上。采用電位滴定法，以pH8.2為終點(diǎn)，用0.1 mol/L的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定。

1.2.5 液化力及糖化力 參照方法同上。分別表示1 g絕干曲在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（35 ℃，pH4.6）中每小時(shí)液化淀粉和生成葡萄糖的含量，前者利用淀粉與碘的特征反應(yīng)，后者采用菲林法滴定。

1.2.6 酯化力 參照方法同上。指在35 ℃下，25 g絕干曲在7 d內(nèi)將一定量的乙醇和己酸催化成己酸乙酯的能力。

1.2.7 發(fā)酵力 參照方法同上。在30 ℃下，0.5 g醋曲中微生物利用糖發(fā)酵生成CO2和酒精，以72 h內(nèi)產(chǎn)生CO2的質(zhì)量衡量發(fā)酵力的強(qiáng)弱。

1.2.8 有機(jī)酸分析 參考ZHANG等[1]所述方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8.1 樣品的預(yù)處理 準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，加入4倍體積流動(dòng)相超聲萃取1 h后，離心（4 ℃，12000 r/min，10 min）收集上清液。以活化后的C18E小柱純化濾清液，再經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取10 μL濾液進(jìn)行分析檢測(cè)。

1.2.8.2 高效液相色譜條件 用9 mmol/L的H2SO4溶液作為流動(dòng)相，等梯度洗脫30 min，流速為0.60 mL/min，柱溫箱溫度為75 ℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)置為215 nm。

1.2.8.3 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及計(jì)算方法 將草酸、酒石酸、L-蘋果酸、L-焦谷氨酸、琥珀酸、乙酸及乳酸標(biāo)準(zhǔn)試劑分別配制成不同濃度的溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以確定樣品中有機(jī)酸種類，并通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算有機(jī)酸含量。

1.2.9 揮發(fā)性組分分析 按照Z(yǔ)HANG等[15]所述方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.9.1 預(yù)處理步驟 稱取0.50 g樣品置于15 mL頂空瓶中，加10 μL內(nèi)標(biāo)，在（60±1）℃下平衡15 min，將萃取頭插入并吸附45 min，于氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的進(jìn)樣口解析5 min，按下述操作條件測(cè)定其揮發(fā)性組分。

1.2.9.2 色譜條件 進(jìn)樣口溫度為270 ℃，升溫程序：40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至100 ℃，隨后以6 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。載氣為高純氦氣（純度≥99.99%），流速為1 mL/min，不分流模式。

1.2.9.3 質(zhì)譜條件 離子源溫度300 ℃，傳輸線溫度250 ℃；電離方式為電子電離，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍35～400 amu。

1.2.9.4 定性及定量方法 將質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST2017數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)比對(duì)鑒定揮發(fā)性組分，對(duì)于匹配度大于800的物質(zhì)予以分析。采用峰面積歸一化確定揮發(fā)性組分的相對(duì)定量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究使用SPSS 24.0軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）中Duncan檢驗(yàn)法分析其顯著性（P＜0.05, n=3）。使用Simca 14.1軟件對(duì)醋曲揮發(fā)性組分進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis，PLS-DA）。采用Origin 2018軟件作圖。應(yīng)用R語(yǔ)言Vegan和ggplot2軟件完成非度量多維尺度分析（Non-metric multidimensional scaling，NMDS）。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落結(jié)構(gòu)差異

2.1.1α-多樣性差異 樣品細(xì)菌和真菌的有效序列分別為67290～98632條和55336～66381條，其高質(zhì)量序列分別為45116～80332條和45244～62129條，其高質(zhì)量序列與有效序列的比例分別為67.05%～89.76%和81.76%～94.57%。樣品的稀疏曲線隨著測(cè)序深度的增加而趨于平緩，表明該測(cè)序結(jié)果可足夠反映其群落組成的范圍。

微生物群落的α-多樣性指數(shù)如表1所示。L1曲真菌、細(xì)菌的Chao1和Observed species指數(shù)均高于Q曲，這表明前者微生物種類更豐富。L2曲細(xì)菌的Shannon和Simpson指數(shù)最高，真菌的Simpson指數(shù)也最高，說(shuō)明夏曲微生物物種分布最均勻。不同季節(jié)L曲間，L4曲的細(xì)菌和真菌的Chao1和Observed species指數(shù)均為最低，表明冬曲微生物的豐富度最低。細(xì)菌和真菌的Chao1和Observed species指數(shù)最高的醋曲分別為L(zhǎng)2和L1曲，這表明夏曲細(xì)菌類群最多，而春曲真菌類群最多。相關(guān)的研究表明，季節(jié)引起的氣候變化中，溫度是決定微生物組成和功能的關(guān)鍵季節(jié)性因素[16-18]。夏季溫度較高，曲塊進(jìn)入曲房時(shí)初溫較高，細(xì)菌生長(zhǎng)快，夏曲細(xì)菌類群最多。而春季氣溫較低，濕度較大，有利于真菌富集、生長(zhǎng)和繁殖，從而春曲真菌類群最多。

表1 微生物群落的α-多樣性指數(shù)Table 1 α-diversity indexes of microbial community

2.1.2β-多樣性分析 樣品微生物群落組成的NMDS分析結(jié)果如圖1所示。L2、L3及L4三種醋曲的細(xì)菌群落均在第一象限，三者間存在一定距離，與L1曲的距離均較遠(yuǎn)，表明季節(jié)顯著影響醋曲細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)。L1及L2曲真菌群落距離較近，L3和L4曲間的距離較近，則前兩者真菌結(jié)構(gòu)類似，后兩者也類似，而春夏曲與秋冬曲兩個(gè)組間的真菌結(jié)構(gòu)差異較大。NMDS排序結(jié)果顯示，無(wú)論是真菌還是細(xì)菌群落，L1與Q曲的距離均較遠(yuǎn)，因而不同生產(chǎn)工藝導(dǎo)致同一季節(jié)的醋曲微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

圖1 微生物NMDS排序結(jié)果Fig.1 Non-metric multidimensional ordination results of microbiota

2.1.3 優(yōu)勢(shì)微生物群落組成輪廓的差異 各樣品優(yōu)勢(shì)真菌屬組成輪廓如圖2（a）所示。這些樣品中共檢出了13種真菌屬（OTU＞0.5%）。L曲的主要優(yōu)勢(shì)真菌屬是曲霉屬（Aspergillus）、根毛霉屬（Rhizomucor）、毛霉屬（Mucor）和生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia），其豐 度 分 別 是36.11%～70.74%、10.81%～36.93%、1.12%～8.03%和2.38%～7.36%。而Q曲的主要優(yōu)勢(shì)真菌屬是嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、曲霉屬（Aspergillus）及嗜熱真菌屬（Thermomyces），其豐度分別是51.83%、34.43%和5.36%。如圖2（a）所示，Q和L1曲真菌屬組成間存在明顯差異，L1曲檢出的根毛霉屬（Rhizomucor）、毛霉屬（Mucor）、青霉屬（Penicillium）及生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）等真菌屬均未在Q曲中檢出，而嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、畢赤酵母屬（Pichia）、節(jié)菌屬（Wallemia）及Rasamsonia僅在Q曲檢出。曲霉屬（Aspergillus）在L1曲的豐度最高，為70.74%。作為重要的功能種屬，該屬可分泌多種水解酶，尤其是大量的糖化酶[19-20]。在L1、L3和L4曲中均檢出的生絲畢赤酵母屬（Hyphopichia）則豐度不同，分別是2.38%、7.36%及5.53%，在秋冬曲的豐度較高。在所有醋曲中，根霉屬（Rhizopus）僅在L1和Q曲中檢出，豐度分別為2.91%和3.72%，該屬分泌多種水解酶，可促進(jìn)原料淀粉的分解利用[21]。

各樣品優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬組成的輪廓如圖2（b）所示。這些樣品共檢出了17種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬（OTU＞0.5%）。L曲的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬包括葡萄狀球菌屬（Staphylococcus）、糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）和鏈霉菌屬（Streptomyces），其豐度分別是11.02%～74.91%、20.14%～28.61%及4.90%～38.76%。Q曲的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為魏斯氏菌屬（Weissella）、高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）和乳桿菌屬（Lactobacillus），豐度分別是43.31%、22.25%和21.81%。由此可見(jiàn)，Q曲和L1曲的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬組成具有顯著差異。葡萄狀球菌屬（Staphylococcus）是L3和L4曲最主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，豐度分別是56.41%和74.91%。糖多孢菌屬（Saccharopolyspora）是L1和L2曲的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，豐度分別是28.60%和20.14%，在其余醋曲中未檢出。該屬可分泌水解酶，尤其產(chǎn)維生素和纖維素降解促進(jìn)因子等[22]。芽孢桿菌屬（Bacillus）僅在L2曲中檢出，豐度是2.71%。乳桿菌屬（Lactobacillus）和乳球菌屬（Lactococcus）僅分別在Q和L1曲檢出，對(duì)酸和乙醇的耐受能力強(qiáng)，其主要代謝產(chǎn)物為乳酸[23-24]。

圖2 屬水平真菌（a）和細(xì)菌（b）的相對(duì)豐度（OTU＞0.5%）Fig.2 Relative abundance of fungal （a） and bacterial （b）community at genus level （OTU＞0.5%）

2.2 理化性質(zhì)的差異

如表2所示，這些樣品的主要理化參數(shù)除水分外，其余的差異都較大。樣品水分間的差異可能與其發(fā)酵過(guò)程的溫度和濕度變化密切相關(guān)。醋曲酸度的差異可能與腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）以及魏斯氏菌屬（Weissella）等產(chǎn)酸細(xì)菌屬的豐度及產(chǎn)酸能力有關(guān)。L1和L2曲的糖化力均略高于L3和L4曲，并且前兩者的液化力顯著高于后兩者(P＜0.05)。其中，L1曲的糖化力和液化力均為最高，可能是L1曲中曲霉屬（Aspergillus）和根霉屬（Rhizopus）的豐度高，其分泌的水解酶活力高所致[22]。L3和L4曲生絲畢赤酵母（Hyphopichia）的豐度較高，從而發(fā)酵力顯著高于其余醋曲(P＜0.05)。樣品酯化力在（578.08±1.63）～（692.05±3.27）U之間，L曲間酯化力差異較小。L1與Q曲的理化性質(zhì)差異顯著，前者的酸度、糖化力、液化力和酯化力均明顯高于后者，而發(fā)酵力略低于后者。

表2 不同醋曲理化性質(zhì)差異Table 2 Differences on physicochemical properties of different Cuqus

2.3 有機(jī)酸組成及含量差異

這些醋曲所含有機(jī)酸的種類及含量如表3所示。L曲的有機(jī)酸總量在（138.66±0.67）～（180.76±0.47）mg/g間，而Q曲的僅有（71.49±0.36）mg/g。L1曲的有機(jī)酸總量為Q曲的2.46倍，前者乙酸、琥珀酸及酒石酸含量均顯著高于后者(P＜0.05)。所有醋曲的優(yōu)勢(shì)有機(jī)酸組分均為乙酸、琥珀酸、酒石酸和乳酸，其中乙酸和乳酸是四川麩醋重要的呈味組分[25]。L4曲中酒石酸含量高達(dá)（34.24±0.41）mg/g，其乳酸的含量也是L曲中最高的（8.31±0.09）mg/g）。L1曲中則琥珀酸含量高達(dá)（25.99±0.04）mg/g，乳酸的含量?jī)H（1.03±0.00）mg/g。琥珀酸可增強(qiáng)食醋的鮮味，與乳酸均可緩沖乙酸帶來(lái)的刺激感，賦予食醋更加綿柔的口感，而酒石酸稍有澀感、酸味強(qiáng)烈[26]。由此可見(jiàn)，生產(chǎn)工藝顯著影響了醋曲有機(jī)酸的組成，而不同季節(jié)醋曲間乳酸含量差異最為顯著。

表3 不同醋曲有機(jī)酸含量（mg/g）Table 3 Contents of organic acids in different Cuqus（mg/g）

2.4 揮發(fā)性組分種類及含量差異

各醋曲揮發(fā)性組分總含量如圖3（a）所示。L1～L4曲 及Q曲 中 分 別 檢 出 了44種、35種、41種、35種及29種揮發(fā)性組分，其總含量的高低順序分別是Q曲（6885.46 ng/g）＞L1曲（6419.37 ng/g）＞L2曲（3996.85 ng/g）＞L3曲（3733.67 ng/g）＞L4曲（2981.57 ng/g）。如圖3（b）所示，酯類是優(yōu)勢(shì)組分，其比例在66.74%～88.38%間。Q曲的酯類組分比例最高，為88.38%，L1曲次之，為83.12%。優(yōu)勢(shì)酯類組分均為棕櫚酸甲酯（918.57～2632.42 ng/g）、亞油酸甲酯（609.87～1801.62 ng/g）和（Z）-油酸甲酯（401.78～1176.32 ng/g），以上三種酯類在Q曲的含量均略高于L1曲的。醇類物質(zhì)的相對(duì)含量在6.67%～11.30%間，L2、L3及L4曲中醇類含量最高的組分均為鯨蠟醇（114.34～332.77 ng/g），而L1和Q曲中醇類含量最高的組分分別為十五醇（452.94 ng/g）和苯乙醇（270.99 ng/g）。

圖3 不同醋曲揮發(fā)性組分總含量（a）及相對(duì)含量（b）Fig.3 Total （a） and relative （b） contents of volatile compositions in different Cuqus

基于各樣品揮發(fā)性組分的PLS-DA如圖4（a）所示。前2個(gè)主成分共解釋了63.8%的總變量，Q2值為0.951，證明該關(guān)系模型可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的預(yù)測(cè)。由PLS-DA載荷圖可知，Q與L1曲間離散程度大，可推測(cè)因制曲工藝、小生境等因素，二者的揮發(fā)性組分差異顯著。不同季節(jié)L曲的揮發(fā)性組分間存在差異，春、夏兩季醋曲與秋、冬曲間差異較明顯。而春夏曲間揮發(fā)性組分較類似，與其微生物群落結(jié)構(gòu)相似的結(jié)果是一致的。

圖4 基于醋曲揮發(fā)性組分含量的PLS-DA分析（a）和VIP值（b）Fig.4 PLS-DA analysis （a） and VIP （b） based on volatiles contents of different Cuqus

VIP值（Variable Importance in the Projection）源于變量對(duì)兩組差異的貢獻(xiàn)值，VIP值＞1表明對(duì)模型的總體貢獻(xiàn)較大。如圖4（b）所示，VIP值＞1的揮發(fā)性組分有28種，主要是酯類和醇類組分。酯類組分中，棕櫚酸甲酯、亞油酸甲酯和8,11,14-十七碳三烯酸甲酯等9種組分的貢獻(xiàn)相對(duì)較大。苯乙醇、正己醇、2,3-丁二醇等8種醇類成分的VIP值＞1，其中2,3-丁二醇和正己醇僅在Q曲中檢出。Q曲中苯乙醇的含量高達(dá)（270.99±65.18）ng/g，而在L1曲中其含量?jī)H為（37.08±3.53）ng/g。吡嗪類是食醋中重要的成分，曾報(bào)道是發(fā)酵過(guò)程中由生物轉(zhuǎn)化和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)[27-29]。2,6-二甲基吡嗪及川芎嗪在Q曲中檢出，而未在L1曲中檢出。

2.5 核心微生物代謝途徑分析

圖5 為醋曲中優(yōu)勢(shì)微生物的代謝途徑及其與風(fēng)味成分的關(guān)系。與淀粉水解相關(guān)的酶，五種醋曲中僅注釋到α-淀粉酶（EC 3.2.1.1），該酶在L1和Q曲的真菌類群中注釋到較高的相對(duì)豐度，這與醋曲中曲霉屬（Aspergillus）、根霉屬（Rhizopus）及芽孢桿菌屬（Bacillus）可分泌大量的α-淀粉酶有關(guān)[21]。與纖維素水解相關(guān)的酶注釋到葡萄糖內(nèi)切酶（EC 3.2.1.4）及β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21），主要與曲霉屬（Aspergillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）相關(guān)。α-淀粉酶及纖維素酶與原料的分解關(guān)系密切，較高的淀粉分解率有利于微生物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖、能源利用和物質(zhì)轉(zhuǎn)化。在乳酸桿菌屬（Lactobacillus）和乳酸球菌屬（Lactococcus）等微生物分泌的L-乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.27）和D-乳酸脫氫酶（EC 1.1.1.28）作用下，丙酮酸經(jīng)還原反應(yīng)可得到L-乳酸和D-乳酸[30]。芳香物質(zhì)苯乙醇的合成與苯丙氨酸的代謝相關(guān)[31]，L1曲在I和II途徑中相關(guān)酶的表達(dá)程度相對(duì)較高，而Q曲在三種合成途徑中相關(guān)酶的表達(dá)程度均較高。

圖5 醋曲微生物的代謝途徑及其與風(fēng)味成分關(guān)系Fig.5 Relationship of microbial metabolic pathways and flavor compounds in Cuqu

3 結(jié)論

基于Illumina MiSeq高通量和色譜等現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)研究季節(jié)對(duì)閬州醋曲品質(zhì)的影響及不同工藝春曲的特點(diǎn)。結(jié)果表明，不同季節(jié)L曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間存在顯著差異，L1和L2曲的真菌群落結(jié)構(gòu)和揮發(fā)性組分輪廓均類似，二者的微生物豐富度、糖化力和液化力均高于L3和L4曲的，但后兩者發(fā)酵力顯著高于前兩者。L1和Q曲的理化參數(shù)、代謝組分及微生物群落結(jié)構(gòu)間差異顯著，尤其是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落組成。前者的微生物種類更豐富，其中根霉屬（Rhizopus）是兩者具有特色的真菌。本研究結(jié)果為基于優(yōu)質(zhì)醋曲為模板，模擬和優(yōu)化培養(yǎng)條件，改善醋曲的質(zhì)量奠定了理論基礎(chǔ)。