湯海霞，王爽爽，郝 果，宋宇軒，張 磊，葛武鵬,

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院, 陜西楊凌 712100；2.陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 陜西富平 711700；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 陜西楊凌 712100）

高血壓以體循環(huán)動(dòng)脈血壓（收縮壓或舒張壓）升高為主要特征（收縮壓≥140 mmHg，舒張壓≥90 mmHg）。高血壓病人會(huì)出現(xiàn)清晨頭痛、流鼻血和耳朵嗡嗡作響等癥狀，如果不及時(shí)治療，會(huì)導(dǎo)致持續(xù)的胸痛（也稱(chēng)為心絞痛）、心臟病發(fā)作、心力衰竭和心律不齊，從而導(dǎo)致猝死[1]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin-I-Converting Enzyme，ACE）是血管緊張素系統(tǒng)中的一種關(guān)鍵酶，可以催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)大的血管收縮作用的血管緊張素Ⅱ，并且使具有降血壓作用的緩激肽失活[2]。因此，可以通過(guò)抑制ACE活性來(lái)治療高血壓。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（Angiotensin-I-converting enzyme inhibitors，ACEI）已被廣泛研究用于預(yù)防和控制高血壓。但人工合成的ACEI具有不良副作用，例如持續(xù)性干咳、皮疹和味覺(jué)障礙等[3]。為了解決上述問(wèn)題，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始聚焦于天然來(lái)源的ACE抑制肽研究，目前人們已經(jīng)從乳[4]、豌豆[5]、雞蛋[6]、刺參[7]和紅松仁[8]等天然食物中分離得到ACE抑制肽。

很多研究已經(jīng)從不同乳源來(lái)源的酪蛋白中分離得到ACE抑制肽，例如，CHEN等[9]使用復(fù)合蛋白酶水解牛乳，鑒定得到2條新的ACE抑制肽VLPVPQ和VAPFPE；ESPEJO-CARPIO等[10]利用枯草桿菌蛋白酶和胰蛋白酶水解羊乳酪蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1條新ACE抑制肽WY。UGWU等[11]將胃蛋白酶和胰蛋白酶混合分別水解駝乳和馬乳來(lái)源的酪蛋白，得到的酪蛋白水解液有顯著的ACE抑制率。我國(guó)綿羊乳產(chǎn)量位居世界第二位，綿羊乳中酪蛋白平均含量為4.5%，乳清蛋白僅占1%左右[12]，目前關(guān)于綿羊乳酪蛋白的研究較少。酶解法因其設(shè)備要求簡(jiǎn)單，條件溫和易于控制并且可以根據(jù)蛋白酶的酶切位點(diǎn)得到特定的肽類(lèi)等特點(diǎn)，常用于活性肽的制備[13]。

因此，本文首次以綿羊乳酪蛋白為原料制備ACE抑制肽，為開(kāi)發(fā)綿羊乳降血壓功能性食品提供了理論依據(jù)及技術(shù)參考。本文選擇堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K水解綿羊乳酪蛋白，篩選ACE抑制率最高的酪蛋白水解物進(jìn)行氨基酸結(jié)構(gòu)鑒定，最后采用Linewaver-Burk作圖和分子對(duì)接模擬對(duì)肽段抑制機(jī)理進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綿羊乳 采自甘肅省金昌奶綿羊試驗(yàn)示范基地；胰蛋白酶（2500 U/mg） 上海源葉公司；蛋白酶K（40 mAnsom U/mg） 德國(guó)默克公司；堿性蛋白酶（2.4LFG） 諾維信公司；胃蛋白酶（≥250 U/mg）、鄰苯二甲醛（OPA）、L-絲氨酸 北京索萊寶有限公司；馬尿酸-組氨酸-亮氨酸（HHL） 上海麥克林公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE≥2.0 U/mg）、乙腈 色譜級(jí)，美國(guó)Sigma公司。

?KTA蛋白純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；5417R高速冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；LGJ-25C真空冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng)有限公司；LTQ Orbitrap Velos 賽默飛世爾科技；1100型高效液相色譜 美國(guó)Agilent公司；UV-1900紫外分光光度計(jì) 日本島津。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分離制備綿羊奶酪蛋白 綿羊乳離心脫脂（5000 r/min，15 min，4 ℃）重復(fù)兩次，用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH至4.2，室溫靜置30～60 min后離心（4700 r/min，10 min，4 ℃）棄上清液，得到的沉淀即為酪蛋白粗品，依次用酸性水（pH4.2）清洗3次，用蒸餾水清洗3次[14]，然后進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.2.2 蛋白酶的篩選 將綿羊乳酪蛋白粉末配成底物濃度為5%的溶液，調(diào)節(jié)溶液到每種酶的最適酶解條件（蛋白酶K，pH7.5，37 ℃；堿性蛋白酶，pH7.0，55 ℃；胃蛋白酶，pH3.0，37 ℃；胰蛋白酶，pH8.0，37 ℃），試驗(yàn)前期查閱文獻(xiàn)[15]，綜合考慮選擇酶添加量為3%，用1 mol/L NaOH維持酶解體系的pH不變，反應(yīng)1 h取一次樣品，在95 ℃下滅活15 min，冷卻至室溫調(diào)pH到7.0，離心（10000 r/min，15 min，4 ℃）取上清液，測(cè)定樣品的水解度和ACE抑制率。

1.2.3 綿羊乳酪蛋白水解液水解度的測(cè)定 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的測(cè)定采用OPA法[16]。向1 mL的OPA試劑（40 mg OPA溶解在1 mL的甲醇中，加入0.95 g的四硼酸鈉，0.5 g的SDS，100 μL的β-疏基乙醇，去離子水定容到50 mL）中加入100 μL的絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液（濃度為0.9516 meqv/L）、樣品和去離子水渦旋5 s，室溫避光條件下精確反應(yīng)2 min后在340 nm下測(cè)吸光度（OD）。DH的計(jì)算方程如式（1）～式（3）：

式中：Serine-NH2：每克蛋白中Serine-NH2的量；V：樣品的總體積；N：樣品的稀釋倍數(shù)；X：樣品的質(zhì)量；P（%）：樣品中蛋白質(zhì)的含量。

式中：h：樣品水解過(guò)程中每克酪蛋白被斷裂的肽鍵數(shù)；α、β：是常數(shù)分別為1.039、0.383。

式中：htot：每克酪蛋白所含的總肽鍵數(shù)為8.2。

1.2.4 ACE抑制率的測(cè)定 ACE抑制率的測(cè)定在CUSHMAN等[15]的方法上稍作修改。向離心管中加入10 μL樣品和30 μL 2.5mmol/L HHL，37 ℃培養(yǎng)5 min，加入20 μL的50 mU/mL ACE，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min，加入60 μL的1 mol/L HCl終止反應(yīng)。HHL釋放的馬尿酸（HA）濃度通過(guò)HPLC測(cè)定。通過(guò)公式4計(jì)算

式中：ΔAControl和ΔAsample分別代表空白（緩沖液）和樣品中HA的峰面積。

HPLC檢測(cè)條件：分析柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；上樣量：10 μL；流動(dòng)相A：含有0.05% TFA的超純水；流動(dòng)相B：乙腈；洗脫條件：78%流動(dòng)相A和22%流動(dòng)相B等度洗脫30 min；檢測(cè)器波長(zhǎng)：228 nm。

1.2.5 酪蛋白酶解液中分子量的測(cè)定 將冷凍干燥后的多肽樣品配成濃度為20 mg/mL的溶液，過(guò)0.22 μm的濾膜，試驗(yàn)采用?KTA pure 100蛋白純化系統(tǒng)，分離凝膠柱為：SuperdexPeptide10/300GL柱（300 mm×10 mm，GE公司）。洗脫條件：流動(dòng)相:乙腈:水:三氟乙酸=30:70:0.1 （v/v），上樣量：500 μL，流速0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。同時(shí)，選擇牛乳白蛋白 （6800 Da）、α-乳白蛋白 （14186 Da）、維生素B12（1355 Da）、氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、甘氨酸（75 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=-0.1192x+7.2412（R2=0.9963）。

1.2.6 綿羊乳酪蛋白酶水解液超濾分離 使用10 kDa和3 kDa的超濾管在4 ℃對(duì)酪蛋白水解液進(jìn)行初步分離，獲得＞10 kDa、10～3 kDa、＜3 kDa 3個(gè)組分，冷凍干燥后測(cè)各組分ACE抑制活性的IC50。

1.2.7 酪蛋白酶解液中肽段結(jié)構(gòu)鑒定 將小于3 kDa組分的多肽粉末重新溶解在0.1%三氟乙酸中，用Thermo-DionexUltimate3000高效液相色譜和LTQOrbitrapVelos質(zhì)譜儀分析多肽結(jié)構(gòu)。分析柱是石英毛細(xì)管柱（15 mm×75 μm）；流動(dòng)相A為含有0.1%甲酸的水，流動(dòng)相B含有0.1%甲酸和80%乙腈的水；梯度洗脫程序?yàn)?～2 min，8%～18%B；2～32 min，18%～35%B；32～34 min，35%～100%B；34～42 min，100%B；進(jìn)樣量：6 μL；流速：0.3 μL/min，全掃描質(zhì)譜（350～1500 m/z，60000分辨率）。

1.2.8 化學(xué)合成ACE抑制肽及其IC50的測(cè)定 篩選和預(yù)測(cè)的潛在的ACE抑制肽在上海生工生物工程股份有限公司采用固相合成法進(jìn)行合成，經(jīng)高效液相色譜法驗(yàn)證，該肽的純度≥98%。將合成的肽配成濃度為2、5、10、15、25 μmol/L的溶液，按照1.2.4的方法測(cè)定肽的ACE抑制率。

1.2.9 ACE抑制動(dòng)力學(xué)測(cè)定 使用1/V和1/HHL的Linewaver-Burk做圖分析KYIPIQY對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制模式，方法在SUTOPO等[17]基礎(chǔ)上稍有修改。將KYIPIQY（0、3、8 μmol/L）和不同濃度的HHL（0.5、2、2.5、3.5 mmol/L）與ACE按1.2.4方法混合培養(yǎng)，測(cè)定馬尿酸的含量，根據(jù)主圖的Y軸和X軸截距計(jì)算Vmax和Km。

1.2.10 分子對(duì)接肽KYIPIQY的結(jié)構(gòu) 由Discovery-Studio2019clien軟件生成，用CHARMm力場(chǎng)對(duì)配體進(jìn)行能量最小化；從RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)下載ACE晶體結(jié)構(gòu)（代碼：1O8A，PDB），用軟件中的Clean-Protein模塊對(duì)ACE進(jìn)行加氫、去水處理，定義活性坐標(biāo)為（X: 38.977，Y: 38.645，Z: 50.183），對(duì)接半徑為 10?，選擇程序CDOCKER進(jìn)行半柔性分子對(duì)接[18]，根據(jù)對(duì)接結(jié)果中“-CDOCKEREnergy”和“-CDOCKERInteractionEnergy”的值確定肽與ACE結(jié)合最佳方式，然后分析肽與ACE的相互作用位點(diǎn)和相互作用力類(lèi)型評(píng)估分子對(duì)接的結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)重復(fù)三次并采用Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適蛋白酶的篩選

在一定范圍內(nèi)，水解度的大小與蛋白質(zhì)水解釋放的肽段含量成正比，蛋白質(zhì)的水解程度影響著水解產(chǎn)物的功能和生物活性，因此測(cè)定酶解過(guò)程中水解物的水解度具有重要意義。圖1a顯示，四種蛋白酶在水解60、120、180 min后酪蛋白水解液的水解度都隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，水解度在2.02%和16.69%之間。其中堿性蛋白酶的綿羊乳酪蛋白水解液的水解度最大，胰蛋白酶和蛋白酶K沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），胃蛋白酶的酪蛋白水解液的水解度最小。四種蛋白酶的酪蛋白水解液的水解度的顯著差異（P＜0.05）可能與酶促反應(yīng)的速率或酶和底物親和力的特定作用有關(guān)[19]。

4種蛋白酶在不同水解時(shí)間獲得的水解產(chǎn)物的ACE抑制率為78.3%至94.3%（圖1b）。除蛋白酶K的酪蛋白水解液ACE抑制率最大值在60 min為92.6%，其余3種蛋白酶的酪蛋白水解液的ACE抑制率都隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，這些結(jié)果表明，酶處理的程度影響水解物的ACE抑制率，與舒國(guó)偉等[20]使用蛋白酶水解山羊乳酪蛋白制備ACE抑制肽結(jié)果類(lèi)似，可能是肽段的分子量在酪蛋白水解液降血壓中發(fā)揮重要作用。堿性蛋白酶120 min的ACE抑制率最大為94.3%。因此，試驗(yàn)測(cè)定了四種酪蛋白水解物在不同水解時(shí)間的分子量分布，結(jié)果如圖1c所示，雖然所有水解產(chǎn)物中仍含有＞10 kDa的蛋白，但與未水解的酪蛋白對(duì)比，蛋白質(zhì)分解明顯，并且隨著酪蛋白水解液水解度的增大小分子肽逐漸分解，將具有ACE抑制活性的肽逐漸水解為不具有ACE活性的肽段，導(dǎo)致酪蛋白水解液的抑制活性降低。

圖1 不同蛋白酶水解對(duì)酪蛋白水解度（a）、ACE抑制率（b）和分子量分布（c）的影響Fig.1 Effects of different proteases on degree of hydrolysis （a）,ACE inhibition rate （b） and molecular weight distribution（c） of casein hydrolysate

2.2 不同分子質(zhì)量酪蛋白肽組分對(duì)ACE抑制率的影響

使用超濾管對(duì)J120 綿羊乳酪蛋白水解液進(jìn)行截留，得到組分I（＞10 kDa）、組分II（3～10 kDa）和組分III（＜3 kDa），冷凍干燥后配成濃度800 μg/mL的溶液測(cè)ACE抑制率。結(jié)果如圖2所示，各組分均有ACE抑制活性，但隨著組分分子量減小，ACE抑制率增高，其中組分III的ACE抑制率為84.5%。馬瑩等[21]用超濾管對(duì)乳清蛋白水解液進(jìn)行超濾分離，顯示＜3 kDa組分的ACE抑制活性最高。本研究結(jié)果與YU等[22]的研究結(jié)果相一致，相比于大分子量的多肽，小分子量的多肽顯示出更高的ACE抑制活性。因此選擇＜3 kDa的組分進(jìn)行下一階段實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同分子質(zhì)量多肽組分對(duì)ACE抑制率的影響Fig.2 Effect of casein peptides with different molecular weights on ACE inhibition rate

2.3 ACE抑制肽質(zhì)譜鑒定分析

使用LTQOrbitrapVelos質(zhì)譜儀對(duì)小于3 kDa的組分進(jìn)行肽鑒定，共鑒定出411條肽段，其中源自αs1-、αs2-、β-和κ-酪蛋白分別為84、116、137和74，表1列出了分子量小于1300 Da的肽，經(jīng)過(guò)在BIOPEP和SwePep數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)驗(yàn)證ACE抑制活性的肽段有19條，是酪蛋白水解液具有高ACE抑制率的主要原因。

表1 酪蛋白水解物肽譜的質(zhì)譜鑒定Table 1 Identification of peptide spectrum of casein hydrolysate by mass spectrometry

通過(guò)閱讀文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)一條肽段含有ACE抑制活性肽的片段，那么這條肽段也可能具有ACE抑制活性。例如，KAI等[23]證明了來(lái)自牦牛κ-酪蛋白的肽KYIPIQ具有ACE抑制活性，其IC50為7.8 μmol/L；同樣GóMEZ-RUIZ等[24]用蛋白酶水解綿羊乳酪蛋白得到κ-酪蛋白肽YIPIQY也顯示了抗高血壓的功能，ACEI的IC50為10.0 μmol/L。新鑒定的7肽KYIPIQY來(lái)源于目前的酪蛋白水解物，包含具有ACEI活性的片段，即KYIPIQ和YIPIQY。因此，7肽-KYIPIQY極有可能具有ACE抑制活性，為了驗(yàn)證此肽段是否具有ACEI活性，試驗(yàn)選擇KYIPIQY進(jìn)行人工合成肽。圖3為其二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖3 KYIPIQY的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 Secondary mass spectra of KYIPIQY

2.4 ACE抑制肽活性的IC50值測(cè)定

采用高效液相色譜法測(cè)定了7-KYIPIQY的ACEI活性和IC50值。不同濃度肽的ACEI活性如圖4所示。IC50值由回歸方程確定：Y =（-0.08811）X2+4.04501X+29.69037（R2=0.999）。結(jié) 果 表 明，KYIPIQY是一種新穎高效的ACE抑制肽，其IC50值為5.73 μmol/L，活性明顯高于從酪蛋白中鑒 定 的ACEI肽LLYQEPVLGPVR（IC50=274.0±5.0 μmol/L）[25]和MVPYPQR（IC50=30 μmol/L）[26]。

圖4 KYIPIQY的ACE抑制活性Fig.4 ACE inhibitory activity of KYIPIQY

2.5 肽段KYIPIQY的抑制類(lèi)型

通過(guò)Linewaver-Burk圖分析7肽KYIPIQY對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的抑制模式。如表2所示，Vmax值隨著肽濃度的增加而降低，說(shuō)明ACEI肽可能阻斷了底物與ACE活性位點(diǎn)的結(jié)合。隨著ACEI濃度的增加，Km值升高，這表明更高濃度肽段有利于A(yíng)CE催化反應(yīng)。圖5顯示ACEI肽表現(xiàn)出混合類(lèi)型的酶抑制模式，表明7-KYIPIQY可以與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的活性和非活性位點(diǎn)的位置結(jié)合，降低了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的催化活性，達(dá)到降血壓的作用。類(lèi)似的，從南瓜子中分離鑒定的肽段RFPLL也為混合抑制模式[27]。

圖5 KYIPIQY對(duì)ACE的Lineweaver-Burk圖Fig.5 Lineweaver-Burk plot of ACE inhibition by the peptide LFRQFY

表2 KYIPIQY在不同濃度下的Vmax和KmTable 2 2Vmax and Km of KYIPIQY at different concentrations

2.6 KYIPIQY與ACE的分子對(duì)接分析

分子對(duì)接是通過(guò)計(jì)算相互作用能和分子間作用力來(lái)預(yù)測(cè)配體與受體活性位點(diǎn)的低能結(jié)合模式的有效方法[28]。為了進(jìn)一步解釋KYIPIQY的ACEI機(jī)制，通過(guò)DiscoveryStudio2019 軟件對(duì)抑制肽和ACE進(jìn)行了分子對(duì)接，形成的ACE-KYIPIQY復(fù)合體的三維結(jié)構(gòu)、局部圖、2D圖如圖6所示。分子對(duì)接結(jié)果中-CDOCKER_Energy表示肽和ACE之間緊密結(jié)合強(qiáng)度，表3所示，KYIPIQY的-CDOCKER_Energy大于KYIPIQ和YIPIQ，顯示出更高的親和力，這表明KYIPIQY可能比其他兩肽發(fā)揮更高的ACE抑制作用，它們的ACE抑制的IC50值證明了推測(cè)。ACE的三個(gè)主要的活性位點(diǎn)口袋，分別是S1（Ala354、Glu384和Tyr523殘基）、S2 （Gln281、His353、Lys511、His513和Tyr520殘基）和S1’（Glu162）[29]。此外，Zn2+也是ACE活性位點(diǎn)，與ACE殘基His383、His387和Glu411形成四面配位體，在A(yíng)CE和抑制劑之間的結(jié)合親和力中起重要作用[30]。在表4中，KYIPIQY與ACE殘基共形成10個(gè)氫鍵，10個(gè)疏水作用力和兩個(gè)靜電力，研究表明氫鍵是維持 ACE 與抑制肽結(jié)合的主要作用力，疏水作用力和靜電力也有助于A(yíng)CE-結(jié)合肽的穩(wěn)定[31]，KYIPIQY與ACE的S1和S2活性口袋中的Ala354和His353形成2個(gè)氫鍵和3個(gè)疏水作用力，表明KYIPIQY能與 S1和S2口袋形成緊密的結(jié)合，與 ACE 殘基His383、His387 和 Glu411之間形成3個(gè)氫鍵和一個(gè)疏水作用力可能會(huì)導(dǎo)致四面體配位的 Zn2+的扭曲，造成 ACE 催化活性的失活[32]而發(fā)揮高效的ACE抑制活性。

圖6 KYIPIQY與ACE的分子對(duì)接結(jié)果Fig.6 Molecular docking results of KYIPIQY and ACE

表3 KYIPIQY、KYIPIQ和YIPIQY與ACE分子對(duì)接評(píng)分Table 3 “-CDOCKER ENERGY” of KYIPIQY、KYIPIQ and YIPIQ

表4 ACE-KYIPIQY復(fù)合物在最佳構(gòu)象中觀(guān)察到的氫鍵以及靜電和疏水相互作用Table 4 Hydrogen bonds and electrostatic and hydrophobic interactions observed in the best peptide poses based on the ACE-KYIPIQY complex

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過(guò)堿性蛋白酶水解綿羊乳酪蛋白得到的水解液的ACE抑制率為94.3%±0.86%，在體外展現(xiàn)出極高的ACE抑制活性。然后通過(guò)LTQ Orbitrap Velos質(zhì)譜儀從酪蛋白水解液中鑒定出一種新的ACEI肽，KYIPIQY（源自κ-酪蛋白）顯示出強(qiáng)有力的ACEI活性，IC50值為5.73 μmol/L，并對(duì)ACE具有混合型抑制作用。此外，分子對(duì)接模擬表明KYIPIQY與ACE的S1、S2的活性口袋氨基酸殘基形成強(qiáng)結(jié)合力,并與Zn2+的四面配位體ACE殘基形成3個(gè)氫鍵導(dǎo)致四面體配位的 Zn2+的扭曲，進(jìn)而造成 ACE 催化活性的失活，而展現(xiàn)出顯著的體外降血壓活性。本研究表明綿羊乳酪蛋白是制備食源性降血壓肽的極佳原料，可為綿羊乳新型功能食品的開(kāi)發(fā)和抗高血壓保健品提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。