李嫚 溫曉東 張立燕 劉軍

中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四一醫(yī)院燒傷整形科（西寧810007）

瘢痕疙瘩是臨床常見的一種皮膚纖維化疾病，其主要特征為成纖維細(xì)胞增殖過度與膠原等細(xì)胞外基質(zhì)沉積過度，目前瘢痕疙瘩形成的分子機制尚未闡明，且缺乏有效治療藥物，手術(shù)切除后患者復(fù)發(fā)率較高且預(yù)后較差，因而探究瘢痕疙瘩的形成機制對尋找其有效治療靶點具有重要意義［1-5］。LncRNA 在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，并可參與瘢痕疙瘩形成過程［6-10］。LncRNA SNHG14 在宮頸癌中表達(dá)水平升高，其高表達(dá)量與患者預(yù)后不良有關(guān)［11］。生物信息學(xué)分析顯示SNHG14 與miR?148a?3p 存在結(jié)合位點，研究表明miR?148a?3p 在食管癌中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可通過靶向DNMT1 抑制食管癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［12］。生物信息學(xué)分析顯示miR?148a?3p與Podocalyxin 樣 蛋 白（podocalyxin?like protein，PODXL）存在結(jié)合位點，PODXL 屬于唾液酸糖蛋白且屬于CD34 家族成員，研究表明PODXL 在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中表達(dá)量升高，下調(diào)其表達(dá)可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡，并可抑制細(xì)胞增殖［13］。因此，本研究主要探討SNHG14 是否可通過靶向調(diào)控miR?148a?3p/PODXL 軸而參與瘢痕疙瘩形成過程。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑研究對象為2018年2月至2020年3月診治的42 例皮膚瘢痕疙瘩患者，所有患者均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為瘢痕疙瘩，均為首次診治的患者；未合并其他皮膚疾病或惡性腫瘤，其中男22例，女20例，年齡（38.56±3.65）歲。選取同期42 例良性皮膚疾?。ㄆつw外傷或植皮）患者為對照，其中男28 例，女14 例，年齡（38.18 ± 5.49）歲。兩組研究對象年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。術(shù)中切除正常皮膚組織、瘢痕疙瘩組織后于液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱內(nèi)保存?；颊呋蚱浣H屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco；胎牛血清購自美國Hyclone；雙熒光素酶報告基因檢測購自美國Promega；MTT 試劑、RNA 提取試劑、蛋白提取試劑盒與山羊抗兔IgG 二抗購自武漢博士德生物；Lipofectamine2000、逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR 試劑購自美國Thermo Fisher；si?NC、si?SNHG14、miR?NC、miR?148a?3p mimics、anti?miR?NC、anti?miR?148a?3p 購自廣州銳博生物；Transwell 小室、Matrigel 基質(zhì)膠購自北京索萊寶；兔抗人PODXL 多克隆抗體購自武漢艾美捷科技；兔抗人ProcollagenⅠ單克隆抗體購自上海遠(yuǎn)慕生物；兔抗人α?SMA、Col1 抗體購自美國Pro?teintech。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時用Lipofectamine2000 說明書對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染si?NC（si?NC 組）、si?SNHG14（si?SNHG14 組），轉(zhuǎn)染6 h 后將無血清培養(yǎng)基更換為DMEM 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2 qRT?PCR 檢測SNHG14、miR?148a?3p 的表達(dá)水平用RNA 提取試劑盒提取正常皮膚組織、瘢痕疙瘩組織與各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的總RNA，用cDNA 第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以2 μL cDNA 為模板，用SYBR Green 熒光定量PCR 試劑盒進行qPCR 擴增，SNHG14 以GAP?DH 為內(nèi)參，miR?148a?3p 以U6 為內(nèi)參，用2?ΔΔCt法計算SNHG14、miR?148a?3p 的相對表達(dá)量。

1.2.3 MTT 檢測細(xì)胞增殖收集各組處理后的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，每孔分別加入20 μL MTT溶液，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)液，每孔分別加入150 μL DMSO，室溫振蕩溶解5 min，用酶標(biāo)儀檢測各孔OD值（490 nm）。

1.2.4 平板克隆形成實驗各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞培養(yǎng)2 周后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS 洗滌，用5%甲醛固定30 min，PBS 洗滌，用0.1%結(jié)晶紫染色液染色30 min，PBS洗滌，晾干后于顯微鏡下計數(shù)≥50個細(xì)胞的菌落數(shù)量。

1.2.5 Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲轉(zhuǎn)染后的各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞（1 × 106個/mL）分別加入預(yù)先鋪制Matrigel 基質(zhì)膠稀釋液（侵襲實驗）或未鋪制Matrigel 基質(zhì)膠稀釋液（遷移實驗）的小室的上室（200 μL/孔），其中重懸細(xì)胞所用培養(yǎng)基均為不含血清的培養(yǎng)基，小室的下室中分別加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后取出小室，PBS 洗滌后多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，于顯微鏡下計數(shù)。

1.2.6 雙熒光素酶報告基因檢測SNHG14 與miR?148a?3p 的靶向關(guān)系，以及miR?148a?3p 與PODXL的靶向關(guān)系將pmirGLO?WT?SNHG14與pmirGLO?MUT?SNHG14 分別與miR?148a?3p mimics 或其陰性對照（miR?NC）在Lipofectamine2000 的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，48 h 后用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測細(xì)胞中的熒光素酶活性。將pmirGLO?WT?PODXL 與pmirGLO?MUT?PODXL 分別與miR?148a?3p mimics 或其陰性對照（miR?NC）在Lipofectamine2000 的介導(dǎo)下共轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，48 h 后用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測細(xì)胞中的熒光素酶活性。

1.2.7 Western blot 檢測PODXL、ProcollagenⅠ、α?SMA、Col1 蛋白表達(dá)用蛋白提取試劑盒提取瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織以及各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞總蛋白，用BCA 法測定蛋白濃度，SDS?PAGE分離蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉PVDF 膜1 h，加入稀釋的PODXL（1∶1 000）、

Procollagen Ⅰ（1∶800）、α?SMA（1∶600）、Col1（1∶800）、GAPDH（1∶1 000）一抗4 ℃孵育過夜，加入稀釋的二抗（1∶2 000）室溫下孵育PVDF 膜1 h，ECL 顯色試劑盒顯影，ImageJ 軟件分析目的條帶與內(nèi)參GAPDH 條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以（）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；Pearson 法檢測瘢痕疙瘩組織中SNHG14 與miR?148a?3p 的相關(guān)性，以及miR?148a?3p 與PODXL 的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中SNHG14、miR?148a?3p 及PODXL 表達(dá)量比較與正常皮膚組織比較，瘢痕疙瘩組織中SNHG14 與PODXL 的表達(dá)量升高（P＜0.05），miR?148a?3p 的表達(dá)量降低（P＜0.05）；Pearson 法檢測瘢痕疙瘩組織中SN?HG14 與miR?148a?3p 的相關(guān)性，以及miR?148a?3p與PODXL 的相關(guān)性，結(jié)果顯示，SNHG14 與miR?148a?3p呈負(fù)相關(guān)（r=-0.803 1，P＜0.001），miR?148a?3p 與PODXL 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.855 9，P＜0.001），SNHG14與PODXL呈正相關(guān)（r=0.724 1，P＜0.001），見圖1-2 及表1。

圖1 Western blot 法檢測PODXL 表達(dá)量Fig.1 Western blot was used to detect the expression of PODXL

圖2 瘢痕疙瘩組織中SNHG14、miR?148a?3p 及PODXL 表達(dá)量之間的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis between SNHG14,miR?148a?3p and PODXL expression in keloid tissue

表1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中SNHG14、miR?148a?3p 比較Tab.1 Comparison of SNHG14 and miR?148a?3p in keloid tissue and normal skin tissue ±s

表1 瘢痕疙瘩組織與正常皮膚組織中SNHG14、miR?148a?3p 比較Tab.1 Comparison of SNHG14 and miR?148a?3p in keloid tissue and normal skin tissue ±s

注：與正常皮膚組織比較，*P ＜0.05

組別正常皮膚組織瘢痕疙瘩組織t 值P 值SNHG14 1.00±0.07 2.51±0.56*17.340＜0.001 miR?148a?3p 1.00±0.09 0.37±0.10*30.348＜0.001

2.2 干擾SNHG14 表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、克隆的影響與si?NC 組比較，si?SNHG14 組SNHG14 與PODXL 的表達(dá)量降低（P＜0.05），miR?148a?3p 的表達(dá)水平升高（P＜0.05），細(xì)胞活力降低（P＜0.05），克隆形成數(shù)減少（P＜0.05），見圖3、表2。

表2 干擾SNHG14 表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、克隆的影響Tab.2 The effect of interference with SNHG14 expression on the proliferation，cloning of keloid fibroblasts±s

表2 干擾SNHG14 表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、克隆的影響Tab.2 The effect of interference with SNHG14 expression on the proliferation，cloning of keloid fibroblasts±s

注：與si?NC 組比較，*P ＜0.05

組別si?NC si?SNHG14 t值P值SNHG14 1.00±0.05 0.26±0.05*31.396＜0.001 miR?148a?3p 1.00±0.07 2.94±0.43*13.359＜0.001 OD值0.82±0.03 0.30±0.04*31.200＜0.001克隆形成數(shù)（個）121.44±11.27 52.33±7.38*15.390＜0.001

圖3 Western blot 法檢測PODXL 表達(dá)量Fig.3 Western blot was used to detect the expression ofPODXL

2.3 干擾SNHG14 表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移、侵襲及膠原合成相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響與si?NC 組比較，si?SNHG14 組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少（P＜0.05），ProcollagenⅠ、α?SMA、Col1 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖4、表3。

圖4 Western blot 法檢測Procollagen Ⅰ、α?SMA、Col1 表達(dá)量Fig.4 Western blot method was used to detect the expression of Procollagen Ⅰ，α?SMA，and Col1

表3 干擾SNHG14 表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移、侵襲的影響Tab.3 The effect of interference with SNHG14 expression on the migration and invasion of keloid fibroblasts±s

表3 干擾SNHG14 表達(dá)對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移、侵襲的影響Tab.3 The effect of interference with SNHG14 expression on the migration and invasion of keloid fibroblasts±s

注：與si?NC 組比較，*P ＜0.05

組別si?NC si?SNHG14 t 值P 值遷移細(xì)胞數(shù)（個）116.22±10.47 43.11±5.88*18.265＜0.001侵襲細(xì)胞數(shù)（個）122.22±12.98 49.67±10.93*12.826＜0.001

2.4 SNHG14 靶向調(diào)控miR?148a?3p，以及miR?148a?3p 靶向調(diào)控PODXLSNHG14 與miR?148a?3p 存在結(jié)合位點，miR?148a?3p 與PODXL 存在結(jié)合位點，見圖5A、B。轉(zhuǎn)染miR?148a?3p mimics 可降低含有WT?SNHG14 或WT?PODXL 的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的熒光素酶活性（P＜0.05），而未能抑制含有MUT?SNHG14 或MUT?PODXL 的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的熒光素酶活性，見圖5C。

圖5 SNHG14 靶向調(diào)控miR?148a?3p，以及miR?148a?3p 靶向調(diào)控PODXLFig.5 SNHG14 targeted miR?148a?3p and miR?148a?3p targets PODXL

3 討論

SNHG14 可通過調(diào)節(jié)miR?206/YWHAZ 分子軸促進宮頸癌的進展［14］。SNHG14 通過充當(dāng)miR?613的競爭性內(nèi)源RNA，調(diào)節(jié)膜聯(lián)蛋白A2 的表達(dá)而促進胰腺癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移［15］。SNHG14 通過充當(dāng)miR?655?3p 的競爭性內(nèi)源RNA 促進子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖［16］。本研究結(jié)果顯示，瘢痕疙瘩組織SNHG14 的表達(dá)量升高，干擾SNHG14 表達(dá)后可明顯降低瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞活力，還可促使克隆形成數(shù)減少，提示干擾SNHG14 表達(dá)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及克隆形成。瘢痕疙瘩類似于腫瘤生物學(xué)特性，膠原蛋白生成量增多可造成局部皮膚纖維組織過度增生而促使病理性瘢痕的形成，Procollagen Ⅰ、α?SMA、Col1 在瘢痕疙瘩中表達(dá)量升高，抑制其表達(dá)可能抑制膠原蛋白合成，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積［17-18］。本研究結(jié)果顯示，干擾SNHG14 表達(dá)后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，Procollagen Ⅰ、α?SMA、Col1 蛋白水平降低，提示干擾SNHG14 表達(dá)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞遷移、侵襲及膠原蛋白合成，進而減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

為進一步探究SNHG14 在瘢痕疙瘩形成過程中的分子機制，本研究證實SNHG14 可靶向結(jié)合miR?148a?3p，瘢痕疙瘩組織中miR?148a?3p 的表達(dá)量降低，且SNHG14 與miR?148a?3p 呈負(fù)相關(guān)，而干擾SNHG14 表達(dá)后miR?148a?3p 的表達(dá)水平升高，提示干擾SNHG14 表達(dá)可能通過靶向調(diào)控miR?148a?3p而參與瘢痕疙瘩形成過程。研究表明miR?148a?3p 主要通過靶向c?Met 抑制上皮性卵巢癌的進展［19］。miR?148a?3p通過調(diào)控ERBB3/AKT2/c?myc和DNMT1 而抑制膀胱癌細(xì)胞增殖［20］。LncRNA SNHG4 通過靶向miR?148a?3p 調(diào)節(jié)c?Met 促進宮頸癌的進展［21］。進一步研究發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩組織中miR?148a?3p與PODXL呈負(fù)相關(guān)，SNHG14與PODXL呈正相關(guān)，瘢痕疙瘩組織中PODXL 的表達(dá)量升高，干擾SNHG14 表達(dá)后PODXL 的表達(dá)量降低。研究表明NNT?AS1 通過靶向miR?1301?3p/PODXL軸并激活Wnt 途徑而促進膀胱癌細(xì)胞的生長［22］。LncRNA BBOX1?AS1 通過靶向miR?361?3p 而增強PODXL 表達(dá)從而促進卵巢癌的發(fā)展［23］。本研究結(jié)果提示SNHG14 可能通過調(diào)控miR?148a?3p/PODXL軸而促進瘢痕疙瘩形成。

綜上所述，瘢痕疙瘩組織SNHG14 與PODXL的表達(dá)量升高，而miR?148a?3p 的表達(dá)量降低，干擾SNHG14 表達(dá)可通過促進miR?148a?3p 表達(dá)而抑制PODXL 表達(dá)從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、克隆形成、遷移、侵襲及膠原蛋白合成。下一步將進行體內(nèi)動物實驗證實SNHG14/miR?148a?3p/PODXL 軸在瘢痕疙瘩生長進程中的作用機制。