叢佳

作者單位：大連市婦女兒童醫(yī)療中心（集團(tuán)）乳腺科，遼寧 大連 116033

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤之一，大量研究表明，遺傳、內(nèi)分泌和外部環(huán)境因素等有助于乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，是多因素、多步驟、多環(huán)節(jié)共同作用的結(jié)果[1]。然而多種因素之間的具體機(jī)制仍未完全明了，因此尋找乳腺癌的發(fā)病機(jī)制對乳腺癌診斷、治療和預(yù)防有重要意義。近年來，生物學(xué)研究證實乳腺癌具有較強(qiáng)的遺傳傾向，并與易感基因ERCC2和MTHFR的多態(tài)性密切相關(guān)[2～4]。ERCC2是一種重要的DNA修復(fù)蛋白，參與幾種不同的DNA損傷修復(fù)途徑，包括核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、鏈間交聯(lián)修復(fù)和重組DNA修復(fù)[5]。ERCC2基因多態(tài)性與各種類型的癌變過程中的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平降低相關(guān)[6]。MTHFR基因是位于人類1號染色體短臂的末端（1P36.3），是體內(nèi)葉酸平衡和代謝的關(guān)鍵酶，參與甲基化和DNA合成[7]。迄今為止，通過多個先前的全基因組關(guān)聯(lián)研究以及薈萃分析研究已鑒定出90多種患乳腺癌的SNP[8]。對乳腺癌患者ERCC2和MTHFR基因差異性鮮有報道，相關(guān)研究之間存在差異甚至出現(xiàn)相反的結(jié)論[9]，因此本研究分析ERCC2基因rs1799793、rs13181和MTHFR基因rs1801133、rs1801131的SNP位點在中國北方女性乳腺癌患者表達(dá)上的差異，并分析乳腺癌易感性與兩種基因的相關(guān)性，為乳腺癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2018年9月～2020年3月我院乳腺科收治的165例乳腺癌女性患者作為觀察組。選取同時間我院乳腺體檢的健康女性165例作為對照組。通過回顧患者的醫(yī)療資料，收集每例患者的相關(guān)臨床病理特征。兩組受試者一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較

入組標(biāo)準(zhǔn)：18～70歲適齡女性；臨床癥狀及病理檢查符合乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；患者或其監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：非當(dāng)?shù)鼐幼艨谡?；近三代直系親屬非本地戶籍者；乳腺癌多發(fā)轉(zhuǎn)移者；資料不全者；有嚴(yán)重的心腦血管疾病、傳染病者；不同意簽署知情同意書者。觀察組165例乳腺癌患者臨床分期：Ⅰ期58例（35.15%），Ⅱ期46例（27.88%），Ⅲ期31例（18.79%），Ⅳ期30例（18.18%）；腫瘤大小＞5cm 64例（38.79%），≤5cm 101例（61.21%）；腫瘤位置：左側(cè)85例（51.52%），右側(cè)80例（48.48%）；48例（29.09%）有轉(zhuǎn)移，117例（70.91%）無轉(zhuǎn)移。

1.2 方法

1.2.1 方案設(shè)計 采集兩組的周圍靜脈血2ml，置于無菌EDTA涂層試管中。血液中DNA提取選用血液/細(xì)胞/組織基因組DN提取試劑盒，離心柱型，根據(jù)制造商說明書進(jìn)行操作。使用NanoVue Plus?分光光度計（biochrom，美國馬薩諸塞州哈佛生物科學(xué)公司）對分離的DNA樣品進(jìn)行定量，測其濃度和A260/A280值，2%的瓊脂糖檢測，確保OD260/280=1.8～2.0，濃度在40ng/μl以上，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA無降解，確保條帶清晰無拖尾，分裝后，保存在-20℃待用。

1.2.2 SNP的選擇 根據(jù)基因上具有代表性的功能位點和已經(jīng)報道過的位點來選擇ERCC2和MTHFR基因的SNP位點，本研究選擇ERCC2基因的rs1799793、rs13181和MTHFR基因的rs1801133、rs1801131。

1.2.3 引物的設(shè)計與制備 根據(jù)引物設(shè)計原則利用Primer Prime 5.0軟件設(shè)計引物，NCBI-Blast軟件進(jìn)行比對檢測它的特異性。設(shè)計好的引物序列由上海生物技術(shù)工程有限公司合成。5OD，用ddH2O稀釋成25μg/μl的工作液。

1.2.4 基因的分型 基因型位點主要分型方法為TaqMan SNP基因分型，分型檢測由上海生物技術(shù)工程有限公司合成協(xié)助完成。

1.3 觀察指標(biāo)采用哈迪溫伯格平衡定律（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）分析兩組ERCC2和MTHFR基因的多態(tài)性和等位基因分布；分析ERCC2位點單倍型和MTHFR位點單倍型與乳腺癌風(fēng)險；分析ERCC2和MTHFR單倍型與乳腺癌患者臨床年齡的關(guān)系；分析ERCC2和MTHFR單倍型與乳腺癌患者家族形成的風(fēng)險。

1.4 統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩組間的計數(shù)資料用百分比表示，采用χ2檢驗，計量資料用（±s）表示，采用t檢驗。非條件logistic回歸分析計算比值比（odds rations，OR）以及95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）表示乳腺癌的相對風(fēng)險度。所有的統(tǒng)計檢驗均為雙側(cè)概率檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，OR＞1時，說明暴露使疾病的危險度增加，是疾病的危險因素，與疾病是正相關(guān)；當(dāng)OR＜1時，說明暴露使疾病的危險度降低，與疾病是負(fù)相關(guān)，暴露因素對疾病有保護(hù)作用；當(dāng)OR=1時，表明暴露因素與疾病無關(guān)聯(lián)。

2 結(jié)果

2.1 ERCC2和MTHFR基因多態(tài)性和等位基因分布對兩組ERCC2 rs1799793、rs13181和MTHFR rs1801133、rs1801131的基因型分布頻率分別進(jìn)行HWE檢驗，均符合HWE平衡（P＞0.05），見表2，具有群體代表性。

表2 ERCC2和MTHFR基因的多態(tài)性和等位基因分布

2.2 ERCC2位點單倍型和MTHFR位點單倍型與乳腺癌風(fēng)險分析對于ERCC2 rs1799793-rs1318，觀察組單倍型A-C顯著高于對照組，它與乳腺癌風(fēng)險增加相關(guān)（OR=1.75，95%CI：1.39～2.54，P=0.016），而兩組之間在其他基因型的分布上均未觀察到差異（P＞0.05）；MTHFR rs1801133-rs1801131組成的各單倍型在兩組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 ERCC2位點單倍型和MTHFR位點單倍型與乳腺癌風(fēng)險分析

2.3 ERCC2和MTHFR單倍型與乳腺癌患者臨床年齡的風(fēng)險分析按年齡將乳腺癌患者分為年齡≤40歲及年齡＞40歲，MTHFR rs1801133-rs1801131組成的單倍型T-C與≤40歲乳腺癌患者的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)（OR=3.52，95%CI：1.25～10.39，P=0.047），其余各單倍型并未發(fā)現(xiàn)乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險與年齡相關(guān)。見表4。

表4 ERCC2和MTHFR單倍型與乳腺癌患者臨床年齡的風(fēng)險分析

2.4 ERCC2和MTHFR單倍型與乳腺癌患者家族形成的風(fēng)險分析按乳腺癌患者家族形成分為散發(fā)型和家族型，MTHFR rs1801133-rs1801131組成的單倍型T-A和T-C與家族型乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險正相關(guān)聯(lián)（OR=1.56和4.96，95%CI：0.9～3.72和0.47～7.62，P=0.009和0.033），說明單倍型T-A和T-C的發(fā)生率家族型比散發(fā)型更高；相反，MTHFR rs1801133-rs1801131組成的單倍型C-C與家族型乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險負(fù)相關(guān)聯(lián)（OR=0.36，95%CI：0.14～0.95，P=0.001），說明單倍型C-C在散發(fā)型乳腺癌中更為常見，而其余各單倍型與乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險與家族形成無關(guān)。見表5。

表5 ERCC2和MTHFR單倍型與乳腺癌患者家族形成的風(fēng)險分析

3 討論

受各種環(huán)境和遺傳因素的影響，乳腺癌病因是復(fù)雜的和多因素的。除了易感基因的突變外，鑒定基因多態(tài)性（包括基因中的SNP）與乳腺癌發(fā)生風(fēng)險的相關(guān)性可能有助于了解疾病的發(fā)生機(jī)制[10]，而單倍型與乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險相關(guān)[11]。MTHFR是編碼亞甲基四氫葉酸還原酶的基因，參與葉酸代謝。該酶有助于5，10-亞甲基四氫葉酸（5,10-MTHF）不可逆轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸（5-MTHF）。葉酸的主要循環(huán)形式5-MTHF在DNA合成、DNA甲基化以及DNA修復(fù)和維持中起著不可或缺的作用[12，13]。葉酸缺乏已被證明會導(dǎo)致DNA損傷、DNA甲基化不足和DNA修復(fù)減少，從而增加染色體斷裂的風(fēng)險。因此，MTHFR活性對葉酸利用率的潛在影響使MTHFR基因成為癌癥易感性的候選基因。ERCC2基因是參與DNA損傷修復(fù)途徑必不可少的基因，其產(chǎn)物DNA解旋酶在轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)核苷酸切除修復(fù)過程中非常重要，該過程有助于保持基因組的完整性和穩(wěn)定性[14]。DNA修復(fù)能力是各種惡性腫瘤易感性的重要決定因素[15]。DNA修復(fù)基因中的遺傳多態(tài)性可能導(dǎo)致DNA修復(fù)機(jī)制紊亂，導(dǎo)致突變積累，進(jìn)而可能增加乳腺癌的易感性[16]。因此我們研究了ERCC2和MTHFR基因4個SNP組成的單倍型與乳腺癌患者的乳腺癌風(fēng)險關(guān)系，包括診斷時的年齡、家族史，結(jié)果顯示ERCC2 rs1799793-rs1318觀察組單倍型A-C乳腺癌風(fēng)險顯著高于對照組，它與乳腺癌風(fēng)險增加相關(guān)，而兩組之間在其他基因型的分布上無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；MTHFR rs1801133-rs1801131組成的單倍型兩組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。ERCC2多態(tài)性可引起ERCC2基因中密碼子312 Asp向Asn的氨基酸交換[17]。rs13181編碼遺傳多態(tài)性A到C的取代引起751 Lys到Gln氨基酸的改變，可引起ERCC2基因功能的改變。研究中納入ERCC2基因的功能性遺傳多態(tài)性位點rs1799793和rs13181先前已與特定的DNA缺陷相關(guān)，即紫外線誘導(dǎo)的DNA損傷的修復(fù)能力不足。一項研究的數(shù)據(jù)指出，這兩種多態(tài)性均降低了健康受試者淋巴細(xì)胞中組成型ERCC2 mRNA的水平，從而降低了ERCC2蛋白的含量[18]。

本研究分析了臨床診斷年齡和家族形成與乳腺癌的發(fā)生風(fēng)險，結(jié)果顯示MTHFR rs1801133-rs1801131組成的單倍型T-C與≤40歲乳腺癌患者的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，rs1801133-rs1801131組成的單倍型T-A和T-C與家族型乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，而單倍型C-C與個體型乳腺癌的發(fā)病風(fēng)險相關(guān)，即單倍型T-A和T-C的發(fā)生率家族比散發(fā)者更高，單倍型C-C在散發(fā)型乳腺癌中更為常見，同時T-C在≤40歲的乳腺癌患者中更為常見，說明MTHFR基因的多態(tài)性與乳腺癌的發(fā)生年齡和家族形式相關(guān)，可能為功能性MTHFR變體rs1801133 編碼遺傳多態(tài)性由 C突變?yōu)門，引起丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，rs1801131編碼遺傳多態(tài)性A到C的取代引起谷氨酸變?yōu)楸彼?，引起蛋白的改變，產(chǎn)生熱不穩(wěn)定且活性較低的酶，導(dǎo)致MTHFR基因的功能變化。在許多流行病學(xué)研究中，rs1801133和rs1801131組成的單倍型對增加乳腺癌風(fēng)險的影響已得到廣泛評估。另一項研究表明，≤50歲的乳腺癌女性中，風(fēng)險評估得以維持[19]。此外，家族史是與乳腺癌風(fēng)險增加相關(guān)的主要因素，我們研究顯示單倍型與家族形式和疾病發(fā)病年齡呈正相關(guān)。本研究分析了ERCC2和MTHFR基因與中國北方女性乳腺癌易感性的關(guān)系，此結(jié)果可以為后期ERCC2和MTHFR基因與乳腺癌的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。但本研究也存在不足，樣本量來源單一，結(jié)果有一定的偏倚，沒有分析ERCC2和MTHFR基因多態(tài)性與乳腺癌嚴(yán)重程度的關(guān)系，在后續(xù)需要加入分析；遺傳標(biāo)記存在局限性，選擇的SNP位點少，后期必須尋找一定數(shù)目、覆蓋度廣泛、更多有功能性的位點來探究與乳腺癌的關(guān)系。

總之，ERCC2和MTHFR基因多態(tài)性與中國北方女性乳腺癌的風(fēng)險增加有關(guān)，同時MTHFR rs1801133-rs1801131組成的單倍型T-A和T-C與家族型乳腺癌相關(guān)，單倍型C-C與散發(fā)型乳腺癌有關(guān)，T-C在≤40歲的乳腺癌患者中更為常見。