沈 萍,陳潔楓,金曉婷,殷敏智
WHO(2020)軟組織和骨腫瘤分類介紹了一類新腫瘤,稱為神經營養(yǎng)性-原肌球蛋白受體酪氨酸激酶基因(neurotrophic tropomyosin-tyrosine receptor kinase, NTRK)重排梭形細胞腫瘤(NTRK-rearranged spindle cell neoplasm)[1]。該類腫瘤好發(fā)于兒童及青少年,組織學表現多變,預后不同,但均存在NTRK基因易位,通過靶向藥物治療可獲得較好的療效。文獻報道通過免疫組化檢測Pan-TRK抗體可以對此類病變起到很好的篩查作用[2-3]。本實驗應用兩種全自動免疫組化儀染色及手工染色檢測Pan-TRK,并對結果進行比較,以期尋找最佳的染色方法。
1.1 材料收集2017年1月~2020年12月上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)學中心存檔的7例手術切除標本。其中5例分子檢測證實存在NTRK基因易位,符合NTRK重排梭形細胞腫瘤的診斷。另2例為嬰兒型纖維肉瘤切除標本,證實均存在ETV6-NTRK3融合基因。
1.2 儀器設備與試劑全自動免疫組化儀為美國羅氏公司的Benchmark Ultra和德國徠卡公司的BOND MAX。一抗Pan-TRK(ERP17341,ab181560)購自Abcam公司。全自動免疫組化儀使用的二抗及顯色系統(tǒng)、蘇木精復染液等均為相應儀器自帶套裝。手工染色使用試劑:抗原修復液(GT100411)、二抗(GK600711)、顯色劑(GK347011-A/B)、過氧化物酶阻斷劑(GT100535),均購自上海基因生物公司。
1.3 方法標本均經10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,3 μm厚連續(xù)切片,65 ℃烤箱烤片2 h。(1)美國羅氏公司的Ultra全自動免疫組化染色儀,使用OptiView程序,Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復液99 ℃修復72 min;抑制劑封閉15 min;一抗37 ℃孵育30 min;二抗室溫孵育12 min;DAB顯色12 min;蘇木精Ⅱ復染8 min;返藍液返藍4 min。(2)徠卡BOND MAX全自動免疫組化染色儀,使用ER Ⅱ抗原修復液(pH 9.0)99 ℃修復72 min;抑制劑封閉15 min;一抗室溫30 min;二抗室溫15min;DAB顯色10 min;蘇木復染5 min。(3)手工染色法采用EnVision法,免疫組化修復液(pH 9.0)直接煮沸修復72 min;內源性過氧化物酶阻斷劑封閉10 min;一抗室溫孵育1 h;二抗室溫孵育15 min;DAB顯色5 min,蘇木精復染1 min。
2.1 7例NTRK基因易位情況及三種染色方法結果NTRK重排梭形細胞腫瘤和嬰兒型纖維肉瘤不同的易位基因及不同的染色方法結果略有區(qū)別(表1)。
表1 7例NTRK基因易位情況及三種染色方法結果
2.2 三種染色方法結果對比分析本組結果顯示,在出現NTRK1基因易位的病例中(例1、3、4、5),三種方法均可得到陽性結果。兩種全自動免疫組化儀染色陽性信號強,定位清晰,背景干凈(圖1、2),其中徠卡設備染色陽性更強;手工染色以表達、定位及背景著色均尚可(圖3)。出現NTRK3基因易位的病例中(例2、6、7),包括2例嬰兒型纖維肉瘤,羅氏全自動染色65%~75%腫瘤細胞陽性,定位清晰,背景干凈(圖4);徠卡和手工操作均未得到陽性結果(圖5、6)。
NTRK包括NTRK1(1q21-22)、NTRK2(9q22)和NTRK3(15q25)[4]。在WHO(2020)軟組織和骨腫瘤分類中將出現NTRK基因改變的腫瘤均歸為NTRK重排梭形細胞腫瘤(不包括先天性/嬰兒型纖維肉瘤)。目前已有的靶向藥物均療效明顯,如Larotrectinib、克唑替尼等,尤其針對復發(fā)、轉移患者[5-6],因此明確病理診斷意義重大。
NTRK重排梭形細胞腫瘤是一組臨床及病理異質性高的罕見腫瘤。其共同點均具有NTRK基因改變,好發(fā)于兒童及青少年。該病變發(fā)生部位廣泛,組織學表現多樣,一般表現為梭形細胞腫瘤,但也可上皮樣/橫紋肌樣,浸潤性生長,伴有黏液變、不同程度炎細胞浸潤,核分裂多少不等[7]。由于其病變部位廣泛,組織學表現多變,給病理診斷帶來了巨大挑戰(zhàn),亟需尋找合適的輔助技術來協(xié)助診斷。
用于NTRK融合基因檢測的技術包括免疫組化、FISH、RT-PCR、新一代測序等。診斷的金標準是在分子水平進行基因檢測[8]??紤]到此類腫瘤涉及不同的3條染色體的相應區(qū)域,如對可疑病例采用病理科較常開展的分子檢測手段(如FISH),需要使用3個探針才能明確,無論是醫(yī)療資源、還是社會資源均是極大的浪費。免疫組化技術的優(yōu)點在于省時省力省錢,在國內大部分病理科已經常規(guī)開展。目前針對TrkA/B/C蛋白的抗體主要有抗TrkA單克隆抗體(EP1058Y,Abcam公司)和Pan-TRK單克隆抗體(ERP17341,ab181560,Abcam公司)。文獻報道Pan-TRK具有高度的靈敏度和特異性[9];同時不同的Pan-TRK表達模式提示涉及的基因不同:胞質陽性提示可能涉及NTRK1/2,胞核(可伴有胞質)陽性可能涉及NTRK3,可根據免疫組化結果作為后續(xù)分子檢測的依據。因此,Pan-TRK免疫組化染色可作為有效的輔助診斷和篩查工具[8]。
來自Nordi相關資料提示:同一抗體在不同設備或使用不同的流程染色,其結果差異較大,陽性率高者達95%,低者僅11%[10]。本組通過三種不同的染色方式以尋找Pan-TRK合適的染色方法,分別是羅氏和徠卡全自動免疫組化儀染色及手工EnVision法染色。按照說明書推薦結合本實驗室摸索的條件,試劑的工作濃度為1 ∶150。
本組結果顯示,在出現NTRK1基因易位的病例中,三種方法均可得到陽性結果,全自動染色儀得到的結果略優(yōu)于手工方法。出現NTRK3基因易位的病例(包括2例先天性纖維肉瘤病例),羅氏全自動染色65%~75%腫瘤細胞陽性,定位清晰,背景干凈;而徠卡全自動染色和手工染色均未得到陽性結果。造成的原因可能為:(1)修復條件不同:本試驗羅氏全自動免疫組化儀使用的是儀器自帶的抗原修復液(pH 8.4),設置修復時間達72 min。長時間的修復充分暴露了抗原,便于更多的抗體結合。手工方式嘗試采用不同修復時間包括30 min、72 min修復,使用兩種不同pH值(pH 9.0和8.4)修復液進行試驗,均得不到較為理想的陽性結果,整個修復過程中始終在關注修復液的量及pH變化。可能與手工操作、抗原暴露不夠充分有關。徠卡全自動免疫組化儀使用的是儀器自帶的抗原修復液(pH 9.0),修復時間從最初的20 min延長到72 min,未得到陽性結果,背景變得更深,最終結果無法判讀。日常工作中,徠卡設備抗原修復一般為20~30 min,建議不超過50 min,此次延長到72 min,僅是出現背景加深??赡荛L時間的抗原修復并不是設備理想的工作狀態(tài)。(2)DAB染色液的作用原理不同:羅氏的OptiView DAB染色液對比普通的DAB試劑盒中間多加了一種帶有酶的三抗,其與二抗結合直接作用于攜帶有相應底物色原體系統(tǒng)的一抗,這種結合有助于催化DAB顯色。徠卡全自動染色和手工染色所用的DAB均無此作用。上述這些區(qū)別可能導致結果的差異。
因此,如果考慮NTRK重排梭形細胞腫瘤,盡量選擇羅氏全自動免疫組化染色儀進行免疫組化染色。建議每次檢測均設置陽性對照。另外,對每批號的抗體需要進行性能驗證,以保證結果的準確性,試劑應在其有效期內使用。
隨著分子檢測手段的普及,越來越多的疾病均被發(fā)現存在特異的基因學改變,而靶向藥物的出現讓臨床醫(yī)師對病理診斷的要求也越來越高。雖然現在越來越多的病理科已開展了分子檢測技術,但免疫組化技術開展時間長,開展的科室廣,抗體種類多,檢測時間短等具有其不可替代的優(yōu)勢。對于免疫組化的開展,前期結合實驗室具體情況制定最佳的操作方法,實驗過程中選擇合理的內、外部對照,以及實驗后定期的質控都是缺一不可的重要環(huán)節(jié)。