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        Pan-TRK免疫組化染色方法比較分析

        2022-01-19 08:31:56陳潔楓金曉婷殷敏智
        臨床與實驗病理學(xué)雜志 2021年12期
        關(guān)鍵詞:易位梭形全自動

        沈 萍,陳潔楓,金曉婷,殷敏智

        WHO(2020)軟組織和骨腫瘤分類介紹了一類新腫瘤,稱為神經(jīng)營養(yǎng)性-原肌球蛋白受體酪氨酸激酶基因(neurotrophic tropomyosin-tyrosine receptor kinase, NTRK)重排梭形細(xì)胞腫瘤(NTRK-rearranged spindle cell neoplasm)[1]。該類腫瘤好發(fā)于兒童及青少年,組織學(xué)表現(xiàn)多變,預(yù)后不同,但均存在NTRK基因易位,通過靶向藥物治療可獲得較好的療效。文獻(xiàn)報道通過免疫組化檢測Pan-TRK抗體可以對此類病變起到很好的篩查作用[2-3]。本實驗應(yīng)用兩種全自動免疫組化儀染色及手工染色檢測Pan-TRK,并對結(jié)果進(jìn)行比較,以期尋找最佳的染色方法。

        1 材料與方法

        1.1 材料收集2017年1月~2020年12月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬上海兒童醫(yī)學(xué)中心存檔的7例手術(shù)切除標(biāo)本。其中5例分子檢測證實存在NTRK基因易位,符合NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤的診斷。另2例為嬰兒型纖維肉瘤切除標(biāo)本,證實均存在ETV6-NTRK3融合基因。

        1.2 儀器設(shè)備與試劑全自動免疫組化儀為美國羅氏公司的Benchmark Ultra和德國徠卡公司的BOND MAX。一抗Pan-TRK(ERP17341,ab181560)購自Abcam公司。全自動免疫組化儀使用的二抗及顯色系統(tǒng)、蘇木精復(fù)染液等均為相應(yīng)儀器自帶套裝。手工染色使用試劑:抗原修復(fù)液(GT100411)、二抗(GK600711)、顯色劑(GK347011-A/B)、過氧化物酶阻斷劑(GT100535),均購自上?;蛏锕?。

        1.3 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,3 μm厚連續(xù)切片,65 ℃烤箱烤片2 h。(1)美國羅氏公司的Ultra全自動免疫組化染色儀,使用OptiView程序,Cell Conditioning Solution(CC1)抗原修復(fù)液99 ℃修復(fù)72 min;抑制劑封閉15 min;一抗37 ℃孵育30 min;二抗室溫孵育12 min;DAB顯色12 min;蘇木精Ⅱ復(fù)染8 min;返藍(lán)液返藍(lán)4 min。(2)徠卡BOND MAX全自動免疫組化染色儀,使用ER Ⅱ抗原修復(fù)液(pH 9.0)99 ℃修復(fù)72 min;抑制劑封閉15 min;一抗室溫30 min;二抗室溫15min;DAB顯色10 min;蘇木復(fù)染5 min。(3)手工染色法采用EnVision法,免疫組化修復(fù)液(pH 9.0)直接煮沸修復(fù)72 min;內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑封閉10 min;一抗室溫孵育1 h;二抗室溫孵育15 min;DAB顯色5 min,蘇木精復(fù)染1 min。

        2 結(jié)果

        2.1 7例NTRK基因易位情況及三種染色方法結(jié)果NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤和嬰兒型纖維肉瘤不同的易位基因及不同的染色方法結(jié)果略有區(qū)別(表1)。

        表1 7例NTRK基因易位情況及三種染色方法結(jié)果

        2.2 三種染色方法結(jié)果對比分析本組結(jié)果顯示,在出現(xiàn)NTRK1基因易位的病例中(例1、3、4、5),三種方法均可得到陽性結(jié)果。兩種全自動免疫組化儀染色陽性信號強,定位清晰,背景干凈(圖1、2),其中徠卡設(shè)備染色陽性更強;手工染色以表達(dá)、定位及背景著色均尚可(圖3)。出現(xiàn)NTRK3基因易位的病例中(例2、6、7),包括2例嬰兒型纖維肉瘤,羅氏全自動染色65%~75%腫瘤細(xì)胞陽性,定位清晰,背景干凈(圖4);徠卡和手工操作均未得到陽性結(jié)果(圖5、6)。

        3 討論

        NTRK包括NTRK1(1q21-22)、NTRK2(9q22)和NTRK3(15q25)[4]。在WHO(2020)軟組織和骨腫瘤分類中將出現(xiàn)NTRK基因改變的腫瘤均歸為NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤(不包括先天性/嬰兒型纖維肉瘤)。目前已有的靶向藥物均療效明顯,如Larotrectinib、克唑替尼等,尤其針對復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移患者[5-6],因此明確病理診斷意義重大。

        NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤是一組臨床及病理異質(zhì)性高的罕見腫瘤。其共同點均具有NTRK基因改變,好發(fā)于兒童及青少年。該病變發(fā)生部位廣泛,組織學(xué)表現(xiàn)多樣,一般表現(xiàn)為梭形細(xì)胞腫瘤,但也可上皮樣/橫紋肌樣,浸潤性生長,伴有黏液變、不同程度炎細(xì)胞浸潤,核分裂多少不等[7]。由于其病變部位廣泛,組織學(xué)表現(xiàn)多變,給病理診斷帶來了巨大挑戰(zhàn),亟需尋找合適的輔助技術(shù)來協(xié)助診斷。

        用于NTRK融合基因檢測的技術(shù)包括免疫組化、FISH、RT-PCR、新一代測序等。診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是在分子水平進(jìn)行基因檢測[8]。考慮到此類腫瘤涉及不同的3條染色體的相應(yīng)區(qū)域,如對可疑病例采用病理科較常開展的分子檢測手段(如FISH),需要使用3個探針才能明確,無論是醫(yī)療資源、還是社會資源均是極大的浪費。免疫組化技術(shù)的優(yōu)點在于省時省力省錢,在國內(nèi)大部分病理科已經(jīng)常規(guī)開展。目前針對TrkA/B/C蛋白的抗體主要有抗TrkA單克隆抗體(EP1058Y,Abcam公司)和Pan-TRK單克隆抗體(ERP17341,ab181560,Abcam公司)。文獻(xiàn)報道Pan-TRK具有高度的靈敏度和特異性[9];同時不同的Pan-TRK表達(dá)模式提示涉及的基因不同:胞質(zhì)陽性提示可能涉及NTRK1/2,胞核(可伴有胞質(zhì))陽性可能涉及NTRK3,可根據(jù)免疫組化結(jié)果作為后續(xù)分子檢測的依據(jù)。因此,Pan-TRK免疫組化染色可作為有效的輔助診斷和篩查工具[8]。

        來自Nordi相關(guān)資料提示:同一抗體在不同設(shè)備或使用不同的流程染色,其結(jié)果差異較大,陽性率高者達(dá)95%,低者僅11%[10]。本組通過三種不同的染色方式以尋找Pan-TRK合適的染色方法,分別是羅氏和徠卡全自動免疫組化儀染色及手工EnVision法染色。按照說明書推薦結(jié)合本實驗室摸索的條件,試劑的工作濃度為1 ∶150。

        本組結(jié)果顯示,在出現(xiàn)NTRK1基因易位的病例中,三種方法均可得到陽性結(jié)果,全自動染色儀得到的結(jié)果略優(yōu)于手工方法。出現(xiàn)NTRK3基因易位的病例(包括2例先天性纖維肉瘤病例),羅氏全自動染色65%~75%腫瘤細(xì)胞陽性,定位清晰,背景干凈;而徠卡全自動染色和手工染色均未得到陽性結(jié)果。造成的原因可能為:(1)修復(fù)條件不同:本試驗羅氏全自動免疫組化儀使用的是儀器自帶的抗原修復(fù)液(pH 8.4),設(shè)置修復(fù)時間達(dá)72 min。長時間的修復(fù)充分暴露了抗原,便于更多的抗體結(jié)合。手工方式嘗試采用不同修復(fù)時間包括30 min、72 min修復(fù),使用兩種不同pH值(pH 9.0和8.4)修復(fù)液進(jìn)行試驗,均得不到較為理想的陽性結(jié)果,整個修復(fù)過程中始終在關(guān)注修復(fù)液的量及pH變化??赡芘c手工操作、抗原暴露不夠充分有關(guān)。徠卡全自動免疫組化儀使用的是儀器自帶的抗原修復(fù)液(pH 9.0),修復(fù)時間從最初的20 min延長到72 min,未得到陽性結(jié)果,背景變得更深,最終結(jié)果無法判讀。日常工作中,徠卡設(shè)備抗原修復(fù)一般為20~30 min,建議不超過50 min,此次延長到72 min,僅是出現(xiàn)背景加深??赡荛L時間的抗原修復(fù)并不是設(shè)備理想的工作狀態(tài)。(2)DAB染色液的作用原理不同:羅氏的OptiView DAB染色液對比普通的DAB試劑盒中間多加了一種帶有酶的三抗,其與二抗結(jié)合直接作用于攜帶有相應(yīng)底物色原體系統(tǒng)的一抗,這種結(jié)合有助于催化DAB顯色。徠卡全自動染色和手工染色所用的DAB均無此作用。上述這些區(qū)別可能導(dǎo)致結(jié)果的差異。

        因此,如果考慮NTRK重排梭形細(xì)胞腫瘤,盡量選擇羅氏全自動免疫組化染色儀進(jìn)行免疫組化染色。建議每次檢測均設(shè)置陽性對照。另外,對每批號的抗體需要進(jìn)行性能驗證,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,試劑應(yīng)在其有效期內(nèi)使用。

        隨著分子檢測手段的普及,越來越多的疾病均被發(fā)現(xiàn)存在特異的基因?qū)W改變,而靶向藥物的出現(xiàn)讓臨床醫(yī)師對病理診斷的要求也越來越高。雖然現(xiàn)在越來越多的病理科已開展了分子檢測技術(shù),但免疫組化技術(shù)開展時間長,開展的科室廣,抗體種類多,檢測時間短等具有其不可替代的優(yōu)勢。對于免疫組化的開展,前期結(jié)合實驗室具體情況制定最佳的操作方法,實驗過程中選擇合理的內(nèi)、外部對照,以及實驗后定期的質(zhì)控都是缺一不可的重要環(huán)節(jié)。

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