朱 蘋，黃月盈，康桂鈺，郟雁飛，張 倩，賈 穎，焦 瑒，馬曉麗，

肺癌是全球病死率較高的惡性腫瘤之一，其中肺腺癌是最常見的組織類型[1]。吸煙是誘導肺腺癌發(fā)生、發(fā)展的主要危險因素之一[2]，煙草中使人成癮的尼古丁與肺癌細胞表面的尼古丁乙酰膽堿受體蛋白(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)結合，促進肺癌細胞的增殖、侵襲、轉移和腫瘤血管新生[3-4]。全基因組關聯(lián)研究(genome-wide association studies, GWAS)分析顯示，15號染色體長臂上編碼α3、α5和β4尼古丁乙酰膽堿受體的基因簇為人類肺癌易感性基因座，與肺癌發(fā)展有密切的聯(lián)系[5-6]。nAChR的激活可以刺激血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、表皮生長因子和花生四烯酸釋放，促進多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展[7-8]。在健康人中，VEGF參與傷口愈合和血管內穩(wěn)態(tài)。研究表明，VEGF促進腫瘤血管和淋巴管生成，VEGF高表達提示患者預后不良[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，下調CHRNA5基因(編碼α5-nAChR蛋白)表達抑制尼古丁促肺癌細胞增殖，降低VEGF表達[10]，α5-nAChR/HIF-1α/VEGF軸參與尼古丁誘導的腫瘤細胞增殖[11]，但尚未研究α5-nAChR對血管形成的影響，且未通過數據挖掘分析兩者的相關性及臨床意義。本文應用多個數據庫、免疫組化及血管形成實驗分析α5-nAChR、VEGF在肺腺癌的表達相關性及α5-nAChR對血管形成的影響，旨在預測肺腺癌侵襲轉移及預后的分子標志物，改善患者的生存率。

1 材料與方法

1.1 材料A549細胞和HUVEC購自中國科學院細胞庫；廣州銳博公司合成si-CHRNA5；肺癌組織芯片(HLug-Ade150Sur-02)購自上海芯超公司，其中包含57例肺腺癌患者的癌組織和癌旁組織；胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司；轉染試劑Lipofectamine 2000和opti-MEM購自Invitrogen公司；Matrigel膠購自BD公司；細胞骨架分析試劑盒購自Thermo公司；α5-nAChR抗體購自Abcam公司；VEGF抗體購自福州邁新公司；免疫組化染色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1數據庫分析 根據本實驗目的設置檢索參數，Oncomine(https://www.oncomine.org/resource/main.html)分析肺腺癌中CHRNA5和VEGF基因表達；GEPIA(http://xena.ucsc.edu)分析兩者在肺腺癌中表達的相關性；Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)分析兩者表達與患者總生存期(overall survival, OS)的關系。

1.2.2細胞培養(yǎng)及實驗分組 A549細胞置于10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經5%CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞轉染按照siRNA產品使用說明書操作，轉染48 h后備用。實驗設立對照組和轉染組。

1.2.3血管形成實驗 在預冷的96孔板鋪上Matrigel，每孔70 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中凝固30 min，備用。消化HUVEC細胞，按照分組以腫瘤細胞上清液重懸，每孔加入100 μL，其中包含2×104個細胞，每組設3個復孔，37 ℃培養(yǎng)過夜，拍照觀察小管形成情況。

1.2.4免疫組化 免疫組化染色使用非生物素PV兩步法檢測系統(tǒng)，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，其中檢測α5-nAChR的組織芯片使用檸檬酸鹽溶液修復，檢測VEGF的組織芯片使用EDTA溶液修復，抗體稀釋比：α5-nAChR為1 ∶500、VEGF為1 ∶2 500。結果判定：(1)根據陽性細胞染色強度計分：無陽性著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據陽性細胞百分率計分：無陽性細胞為0分，<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分。將兩項評分相乘作為最終評分：≥4分為陽性，<4分為陰性。

1.3 統(tǒng)計學分析血管形成實驗結果采用t檢驗，Oncomine對符合篩選條件的數據集進行Meta分析，GEPIA使用Pearson檢驗分析CHRNA5、VEGF mRNA表達的相關性。其余數據采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，檢驗水準α=0.05，其中α5-nAChR、VEGF表達與臨床病理參數的相關性采用χ2檢驗，預后分析采用Kaplan-Meier生存曲線。

2 結果

2.1 Oncomine中CHRNA5、VEGF在肺腺癌組織與正常肺組織的表達差異應用Oncomine對符合篩選條件的數據集進行Meta分析，3個芯片數據集顯示：CHRNA5在肺腺癌組織中高表達，中位數排序1 252.0，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1A)；VEGF在肺腺癌組織中高表達，中位數排序429.0，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖1B)。

圖1 Oncomine中CHRNA5、VEGF在肺腺癌組織與正常肺組織中的表達差異：A.CHRNA5表達差異的Meta分析；B.VEGF表達差異的Meta分析

2.2 CHRNA5和VEGF的相關性GEPIA相關性分析顯示，CHRNA5與VEGF基因表達呈正相關(P<0.05，圖2A)。

2.3 CHRNA5、VEGF表達與肺腺癌患者生存期的關系Cox回歸模型繪制Kaplan-Meier生存曲線，Log-rank檢驗顯示CHRNA5高表達組患者生存率(HR=2.49，P<0.05，圖2B)和VEGF高表達組患者生存率(HR=2.8，P<0.05，圖2C)分別顯著低于低表達組，差異有統(tǒng)計學意義。

圖2 CHRNA5與VEGF表達相關性及兩者表達與患者生存期的關系：A.CHRNA5與VEGF表達相關性；B.CHRNA5與肺腺癌患者總生存期的關系；C.VEGF與肺腺癌患者總生存期的關系

2.4 干擾CHRNA5基因對血管形成能力的影響血管形成實驗顯示：干擾A549細胞CHRNA5后，干擾組HUVEC血管形成能力降低，平均管主干長度計數和平均管結點計數顯著低于對照組(P<0.05，圖3)。

圖3 干擾CHRNA5基因對血管形成能力的影響：A.對照組；B.干擾組；C.平均管主干長度計數；D.平均管結點計數；*P<0.05

2.5 肺腺癌組織中α5-nAChR、VEGF表達的相關性免疫組化標記α5-nAChR與VEGF陽性均定位于胞質，為棕褐色顆粒(圖4)。57例肺腺癌石蠟樣本中α5-nAChR陽性33例(57.89%)，VEGF陽性45例(78.95%)，α5-nAChR、VEGF共同陽性26例(45.61%)，α5-nAChR、VEGF共同陰性5例(8.77%)。χ2檢驗結果表明α5-nAChR和VEGF表達存在相關性(P<0.05，表1)。

表1 肺腺癌組織中α5-nAChR、VEGF表達的相關性

圖4 肺腺癌及癌旁組織中α5-nAChR、VEGF的表達，PV兩步法

2.6 肺腺癌中α5-nAChR、VEGF表達與臨床病理特征的關系肺腺癌中，α5-nAChR表達與患者性別(P=0.039)和AJCC臨床分期(P=0.008)有關，與患者年齡(P=0.294)和病理分級(P=0.948)無關；VEGF表達與患者性別(P=1.000)、年齡(P=0.099)、病理分級(P=0.736)、AJCC臨床分期(P=0.171)無關，差異均無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 肺腺癌中α5-nAChR、VEGF表達與臨床病理特征的關系

2.7 α5-nAChR、VEGF表達與肺腺癌患者預后的關系根據免疫組化結果將57例肺腺癌患者分為4組：α5-nAChR陽性組(α5-nAChR+)、α5-nAChR陰性組(α5-nAChR-)、VEGF陽性組(VEGF+)、VEGF陰性組(VEGF-)。Kaplan-Meier生存曲線顯示α5-nAChR、VEGF同時陽性與兩者同時陰性患者相比，其預后水平差、5年生存率低(圖5)。

圖5 α5-nAChR、VEGF表達與肺腺癌患者預后的關系：A. α5-nAChR表達與肺腺癌患者總生存期的關系；B. VEGF表達與肺腺癌患者總生存期的關系；C. α5-nAChR和(或)VEGF表達與肺腺癌患者總生存期的關系

3 討論

吸煙是肺癌和慢性阻塞性肺疾病的主要危險因素之一，GWAS顯示染色體區(qū)域15q25上的基因簇與尼古丁、肺癌等肺疾病的易感性增加密切相關[12-13]。研究表明，尼古丁促進非小細胞肺癌細胞株α5-nAChR蛋白及CHRNA5的表達并激活JAK/STAT3信號轉導通路[14]，干擾α5-nAChR表達能顯著降低尼古丁促肺癌細胞遷移及侵襲的能力[15]，α5-nAChR通過STAT3/Jab1信號軸介導非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)上皮細胞-間充質轉化[16]。目前，α5-nAChR在肺癌發(fā)生及發(fā)展中的分子機制尚不清楚。

血管生成在腫瘤的生長和轉移中至關重要，臨床通過阻斷這一途徑治療腫瘤[17]。近年以VEGF為靶點的抗血管生成藥物在我國獲批用于治療晚期NSCLC。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，α5-nAChR與VEGF的表達密切相關，因此探討α5-nAChR和VEGF在肺腺癌中的表達、生存預后及α5-nAChR對血管形成的影響，對NSCLC評估及治療具有臨床意義。

本組通過Oncomine數據庫，設置CHRNA5和VEGF差異表達的篩選條件，數據集分析顯示，CHRNA5和VEGF mRNA在肺腺癌組織中高表達。TCGA數據庫顯示兩者在肺腺癌中mRNA表達呈正相關。GEO等數據庫生存曲線表明，高表達CHRNA5或VEGF基因的患者預后差，生存率顯著降低。血管形成實驗證明α5-nAChR促進腫瘤血管生成。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織芯片癌組織中α5-nAChR、VEGF表達高于癌旁組織，且兩者表達存在相關性(P<0.05)。分析α5-nAChR、VEGF表達與臨床病理特征的關系表明：α5-nAChR表達與患者性別和臨床分期有關，可能與不同人群的吸煙史及腫瘤的惡性程度密切相關。有研究表明，VEGF表達與淋巴結轉移、TNM分期顯著相關，本組VEGF表達與患者性別、年齡、病理分級、腫瘤臨床分期無關，其表達在肺腺癌中的機制有待進一步分析[18-20]。本組數據庫生存曲線表明：VEGF或CHRNA5基因高表達患者的預后不良，可能是尼古丁結合α5-nAChR促進腫瘤的侵襲轉移，而VEGF高表達患者的腫瘤微血管密度增加及遠處轉移的風險增高，影響患者的生存期。臨床病理組織芯片中患者生存曲線顯示，僅α5-nAChR高表達顯示患者生存率顯著降低(P<0.05)；VEGF高表達或α5-nAChR、VEGF同時高表達患者與VEGF低表達或α5-nAChR、VEGF同時低表達患者的生存曲線相比，有明顯的下降及分離趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，可能與樣本量過少有關，后期可通過增加樣本量進一步驗證。本課題組前期研究結果顯示尼古丁可以結合α5-nAChR激活JAK/STAT3信號通路參與肺癌細胞增殖；同時有其它研究表明[21]，催乳素通過上調生長激素受體和激活JAK2/STAT3/VEGF通路的下游，促進肺癌細胞A549的增殖。由此表明肺腺癌中α5-nAChR/STAT3/VEGF信號通路參與肺癌的發(fā)生。本組檢索JASPAR數據庫發(fā)現(xiàn)，STAT3在CHRNA5和VEGF基因啟動子區(qū)域均存在結合位點，需對α5-nAChR與VEGF在肺腺癌中的相關性進一步分析。

綜上，本實驗結果顯示，α5-nAChR、VEGF在肺腺癌中表達上調，且兩者表達呈正相關，并影響患者預后及體外血管生成，但其分子作用機制尚不清楚，有待進一步探索及驗證，兩者有望成為肺腺癌預后的分子標志物。