夏 雨，祝成樓，邱志勝，徐 雷，達(dá)明緒,

胰腺癌是一種惡性程度極高、療效差和早期診斷率較低的常見消化系統(tǒng)惡性腫瘤，90%以上的胰腺癌為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)，其發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)均呈遞增趨勢，嚴(yán)重危害人類健康[1]。大多數(shù)胰腺癌患者在確診時(shí)已處于疾病晚期階段，5年總生存率小于7%[2]。因此，探索新的胰腺癌早期診斷分子標(biāo)志物，將有利于提高胰腺癌的早期診斷及早期治療，對胰腺癌患者預(yù)后改善亦至關(guān)重要。

血小板反應(yīng)蛋白-2(thrombospondin-2, THBS2)屬于細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白家族成員，由多種類型細(xì)胞包括間質(zhì)成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等釋放，可介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)的組裝，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的降解，以及抑制血管生成[3]。有研究顯示，THBS2是一種與PDAC有關(guān)的標(biāo)志物蛋白，在PDAC患者血清中高表達(dá)，與CA-199聯(lián)合檢測，對早期胰腺癌的診斷特異度可提升至98%，靈敏度提升至87%[4]。目前THBS2在胰腺癌組織中的表達(dá)尚未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過探討THBS2在PDAC組織中的表達(dá)，并分析其表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，以期為胰腺癌的治療及預(yù)后評估提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料收集甘肅省人民醫(yī)院2015年3月～2021年3月經(jīng)手術(shù)切除且經(jīng)病理確診的PDAC及相應(yīng)癌旁正常組織蠟塊69例。其中男性48例，女性21例，患者年齡30～82歲，中位年齡61歲。胰腺癌臨床分期參照第8版美國腫瘤聯(lián)合委員會(huì)(American Joint Committee on Cancer， AJCC)pTNM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)病理診斷為PDAC；(2)無合并其他良性或惡性腫瘤；(3)術(shù)前未經(jīng)放、化療；(4)無其他全身系統(tǒng)性疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并有其他良性或惡性腫瘤；(2)臨床病理資料信息不全。

1.2 免疫組化手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片。一抗THBS2(1 ∶50)兔多克隆抗體、二抗及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine, DAB)購自上海艾博抗公司。免疫組化染色采用EliVision法，具體實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照EliVision Plus檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 結(jié)果判定在雙盲條件下，由2名病理科主任醫(yī)師獨(dú)立評估每個(gè)標(biāo)本的染色評分結(jié)果。在高倍鏡(400×)下隨機(jī)選取5個(gè)染色組織視野，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評分：無陽性著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0、1、2、3分；按陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分：≤5%為0分；6%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。將兩項(xiàng)評分相乘作為最終評分：<3分為陰性，≥3分為陽性。

1.4 數(shù)據(jù)庫分析應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析比較胰腺癌組織[num(T)179例]和癌旁正常組織[num(N)171例]中THBS2的表達(dá)水平(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene)，P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用包括風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和95%CI在內(nèi)的Kaplan-Meier在線生存分析軟件(https://kmplot.com/analysis/)分析THBS2表達(dá)和PDAC患者總生存期的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，運(yùn)用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法來分析THBS2表達(dá)與PDAC臨床病理特征的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDAC組織和癌旁正常組織中THBS2的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，THBS2表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)(圖1)。69例PDAC組織中，45例THBS2陽性，陽性率為65.2%，癌旁正常組織中25例THBS2陽性，陽性率為36.2%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.597，P<0.05，圖1)。

ABCD

2.2 THBS2表達(dá)與PDAC臨床病理特征的關(guān)系THBS2表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤直徑、是否血管侵犯均無相關(guān)性(P>0.05)；THBS2表達(dá)與腫瘤分化程度、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05，表1)，即腫瘤分化程度(中+低分化)較低、臨床分期(Ⅲ+Ⅳ)較晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，THBS2陽性率更高。

表1 胰腺導(dǎo)管腺癌中THBS2表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 THBS2表達(dá)與患者總生存期的關(guān)系通過GEPIA發(fā)現(xiàn)，胰腺癌組織中THBS2表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.01，圖2)。利用Kaplan Meier-plotter在線生存分析軟件分析發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間推移，THBS2表達(dá)差異患者的生存率逐漸呈現(xiàn)顯著差異，THBS2高表達(dá)患者的總生存期遠(yuǎn)低于THBS2低表達(dá)患者(HR=1.57，P<0.05，圖3)。

圖2 GEPIA在線分析TCGA數(shù)據(jù)庫胰腺癌組織中THBS2的表達(dá)

圖3 Kaplan Meier-plotter在線生存分析軟件分析THBS2表達(dá)與胰腺癌患者總生存期的關(guān)系

3 討論

THBS家族由5種鈣結(jié)合基質(zhì)細(xì)胞糖蛋白組成，即THBS1～5。依據(jù)寡聚化狀態(tài)和蛋白分子結(jié)構(gòu)域不同進(jìn)行劃分，可將其分成三聚體和五聚體兩大類。其中THBS1和THBS2屬三聚體蛋白，其他是五聚體[3]。THBS1和THBS2具有相似的分子結(jié)構(gòu)和85%的氨基酸保守性，因此具有相似的結(jié)合域。在血小板反應(yīng)蛋白家族中，只有THBS1和THBS2包含3個(gè)Ⅰ型備解素樣特殊重復(fù)序列，該序列可抑制血管生成[3]。體外實(shí)驗(yàn)研究已證明，THBS2是一種抑制血管生成因子，并認(rèn)為Ⅰ型結(jié)構(gòu)域發(fā)揮抑制作用[5-6]。THBS2可與多種細(xì)胞膜表面受體、生長因子、細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白酶相結(jié)合，從而發(fā)揮其調(diào)控作用，其中包括調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)黏附、運(yùn)動(dòng)性、趨化性、傷口愈合、血管生成抑制等[7]。THBS2主要通過抑制血管生成和負(fù)性調(diào)控MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[8]。然而，最近相關(guān)研究表明，THBS2對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有促進(jìn)作用，其有可能成為腫瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)[9-12]。

有研究發(fā)現(xiàn)，THBS2在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在相應(yīng)癌旁正常組織中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其表達(dá)水平與淋巴浸潤及TNM分期呈正相關(guān)，顯著影響患者預(yù)后[13-14]。Xu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，THBS2/TLR4相互作用可上調(diào)結(jié)直腸癌細(xì)胞中糖酵解相關(guān)基因表達(dá)(GLUT1、HK2、ALDOA、PKM2、LDHA)，促進(jìn)糖酵解過程，為腫瘤細(xì)胞生長供應(yīng)能量，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長。THBS2是TWIST2的下游基因之一，在TWIST2轉(zhuǎn)錄調(diào)控下，miR-221-3p通過靶向調(diào)控THBS2基因序列，進(jìn)而促進(jìn)子宮頸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，但具體作用機(jī)制尚不明確[11]。Weng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中THBS2的表達(dá)顯著增加，且其表達(dá)與腫瘤直徑和TNM分期密切相關(guān)。在胃癌方面，THBS2在胃癌中的表達(dá)較癌旁正常組織顯著上調(diào)，提示預(yù)后不良，可作為胃癌患者預(yù)后評估指標(biāo)[16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，THBS2在PDAC組織中高表達(dá)，在癌旁組織中低表達(dá)。THBS2表達(dá)與腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，提示THBS2表達(dá)不僅與胰腺癌的發(fā)生有關(guān)，而且與胰腺癌的惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。本組基于GEPIA和Kaplan Meier-plotter生存分析發(fā)現(xiàn)，THBS2在胰腺癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，THBS2高表達(dá)胰腺癌患者的總生存期短于THBS2低表達(dá)者，THBS2表達(dá)與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)。提示THBS2可作為評估胰腺癌患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素。

本實(shí)驗(yàn)著重于探討胰腺癌組織中THBS2表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系，并未涉及其分子機(jī)制方面的研究。目前，有關(guān)THBS2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制研究十分有限。有研究顯示，THBS2在胰腺癌中高表達(dá)，其可能主要通過PI3K/AKT信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)功能，包括促進(jìn)增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[17]。本實(shí)驗(yàn)在一定程度上證明THBS2參與了胰腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移，且具有促進(jìn)作用。然而，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與THBS2的抗血管生成及腫瘤抑制基因作用相矛盾。由此推測，THBS2可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著雙重作用，其可能參與了未知的調(diào)控機(jī)制，有待全面深入研究并揭示具體作用機(jī)制。

綜上所述，THBS2表達(dá)與胰腺癌的惡性程度呈正相關(guān)，且對腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用，且THBS2高表達(dá)預(yù)示胰腺癌患者預(yù)后差。提示在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展中，THBS2發(fā)揮重要作用，有望成為胰腺癌的治療靶點(diǎn)及評估預(yù)后的重要指標(biāo)。