郭文瑞 ， 鄭秉武 ， 曹 霞 ， 丁玉林 ， 黃金田 ， 楊龍峰 ， 王金玲

(1. 內蒙古農業(yè)大學獸醫(yī)學院 農業(yè)農村部動物疾病臨床診療技術重點實驗室 ， 內蒙古 呼和浩特 010010 ； 2. 內蒙古呼和浩特市園林管理局動物園管理處 ， 內蒙古 呼和浩特 010050 ； 3. 北京市延慶區(qū)動物疫病預防控制中心 ， 北京 延慶 102100)

壞死桿菌病是由厭氧的革蘭陰性壞死桿菌引起的一種綜合征性疾病，主要感染家養(yǎng)反芻動物[1]、野生反芻動物[2-6]和袋鼠[7-10]，偶爾感染人類。牛和羊是最易感染壞死桿菌的家畜。野生反芻動物的壞死桿菌病已報道于野生叉角羚(Antilocapraamericana)[2]、苔原馴鹿(Rangifertarandustarandus)[3]、黑尾鹿(Odocoileushemionuscolumbianus)[11]、歐洲野牛(Bisonbonasus)[5]和羊駝(Vicugnapacos)[6]。壞死桿菌病的主要疾病表現(xiàn)包括壞死性口炎、蹄皮炎、陰莖包皮炎、瘤胃炎、肝膿腫、靜脈炎、支氣管性肺炎，甚至引起膿毒敗血癥。

長頸鹿是一種野生反芻偶蹄動物，是世界上現(xiàn)存最高的陸生動物。本試驗通過多種方法綜合確診了1例罕見的幼齡長頸鹿壞死桿菌病，并進行了系統(tǒng)的病理學觀察,報告如下。

1 臨床情況

1只幼齡長頸鹿從2.5月齡時開始表現(xiàn)漸進性食欲減退，機體逐漸消瘦，后期食欲廢絕而突然死亡，病程15 d。發(fā)病期間未進行任何藥物治療。

2 大體病變觀察

對病死長頸鹿進行系統(tǒng)尸檢，觀察和記錄大體病變。大體病變表現(xiàn)為尸體消瘦，鼻孔流出白色黏性液體。壞死性口炎，在兩側舌根(圖1)和頰部黏膜均可見1個明顯的潰瘍灶，與健康組織之間有明顯的界限。纖維素性胸膜炎，肺胸膜多處與胸壁胸膜輕度粘連；肺臟明顯腫大，肺后葉、中葉和副葉的大面積區(qū)域呈黃白色至暗紅色實變(圖2)；在肺實變區(qū)表面和切面有大量散在或密集分布的粟粒大小的黃白色結節(jié)，呈小氣道炎癥引起的典型的小葉型性融合性肺炎病變；肺后葉實變區(qū)局部胸膜表面有灰白色薄層片狀或絨毛狀的纖維素附著，局部肺胸膜下有數個花生米粒大小的灰白色化膿灶。心臟冠狀靜脈淤血明顯，冠狀脂肪萎縮呈淡黃色膠凍狀，左心室心壁增厚，心室腔狹小，發(fā)生向心性肥大，右心室和后腔靜脈內充滿血凝塊。腎盂黏膜下層明顯水腫。縱隔淋巴結明顯腫大，呈暗紅色。肝臟腫大呈深紅色，質脆易碎。腸系膜靜脈擴張、淤血明顯。真胃黏膜褶皺呈條索狀深紅色，瘤胃內有少量粗質牧草。其他組織器官無明顯眼觀病變。

圖1 壞死性口炎左側舌根黏膜1個橢圓形潰瘍灶(箭頭)

圖2 融合性支氣管性肺炎右肺后葉和副葉下緣為伴纖維性胸膜炎和粟粒狀化膿灶的大面積黃白色和深紅色實變(箭頭所指暗紅色區(qū)域和星號周圍大面積區(qū)域)

3 病理組織學檢查

剖檢過程中分別取全身各組織器官的病變部位和病變與正常交界部位，大小為1.5 cm×1 cm×0.5 cm左右，立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定。組織固定24 h后進行修塊、脫水和透明，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，蘇木素-伊紅(H.E.)染色，常規(guī)制備病理組織切片并進行病理組織學觀察。病理組織學變化表現(xiàn)為舌根和頰部黏膜的壞死組織侵入深層肌肉組織形成大小不一的壞死灶，壞死灶被厚層中性粒細胞和薄層肉芽組織所包圍，在壞死灶內和邊緣可見大量與壞死桿菌形態(tài)一致的藍染細絲狀桿菌(圖3)。肺臟呈漿液纖維素性化膿性融合性支氣管性肺炎，肺小葉間隔因大量漿液、纖維素和中性粒細胞的滲出和浸潤而明顯增寬；肺組織內以細支氣管為中心形成大量的大小不一的小葉性肺炎灶，多個炎灶互相融合。炎癥中心壞死的細支氣管壁內和管腔內有大量侵入的藍染細絲狀桿菌和壞死崩解的中性粒細胞(圖4)；近細支氣管肺組織呈嚴重的纖維素性壞死性化膿性肺炎，肺泡間隔完全壞死，肺泡腔內充滿大量變質的中性粒細胞和或多或少的藍染細絲狀桿菌，偶見大量成簇的細絲狀桿菌正侵入鄰近肺泡(圖5)；小葉性肺炎灶邊緣呈典型的漿液性肺炎，肺泡壁毛細血管充血擴張，肺泡腔內充滿大量粉紅色富含蛋白的漿液、中性粒細胞和多少不一的藍染細絲狀桿菌；肺炎區(qū)可見脈管炎、血栓形成、化膿性壞死性細支氣管炎和局部膿腫。肝淤血，肝小葉邊緣肝細胞顆粒變性。淋巴結皮質淋巴小結內淋巴細胞明顯減少，皮質和髓質交界處淋巴竇內聚集大量中性粒細胞。腎臟多數腎小管上皮細胞腫脹，少數腎小管上皮細胞壞死。左心室心肌細胞體積腫大，發(fā)生細胞腫脹。

圖3 舌根潰瘍灶邊緣壞死桿菌(H.E.染色)舌根潰瘍灶邊緣壞死組織與肉芽組織間明顯的藍色細絲狀壞死桿菌

圖4 壞死性化膿性細支氣管炎(H.E.染色)伴有大量藍色細絲狀壞死桿菌侵入的壞死性化膿性細支氣管炎(箭頭)

圖5 漿液纖維素性化膿性肺炎(H.E.染色)肺泡壁壞死，肺泡腔內有大量藍色細絲狀壞死桿菌

4 組織觸片檢查

無菌取肺炎區(qū)和舌潰瘍灶邊緣組織切面并進行觸片，自然干燥，常規(guī)革蘭染色法染色，油鏡觀察。在肺炎區(qū)和舌潰瘍灶邊緣組織的觸片上均可見較單一的大量纖細的革蘭陰性長桿狀或長絲狀桿菌(圖6)，中性粒細胞多見。

圖6 肺組織觸片(革蘭染色)肺組織內有大量單一的革蘭陰性長短不一的絲狀壞死桿菌

5 16S rDNA擴增、測序和比對

因剖檢時未取新鮮組織，所以用E.Z.N.A. FFPE-DNA Kit(OMEGA)提取石蠟包埋的帶有潰瘍灶邊緣區(qū)的舌組織和肺臟炎癥組織的基因組DNA。用2×Taq Master Mix Kit(Vazyme Biotech，南京)擴增細菌16S rDNA，壞死桿菌特異性引物為10Fx：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1509R：5′-GTTACCTTGTTACGACTTCAC-3′[9]。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃ 7 min。目的PCR產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。從舌潰瘍灶邊緣組織和肺炎區(qū)蠟塊組織均擴增出核苷酸序列同源率為100%的2條長1 414 bp基因序列(圖7)，均與GenBank數據庫中壞死桿菌F.necrophorumsubsp. funduliforme strain B35(序列號：EF447425.1)菌株核苷酸序列同源率最高，達99%。

圖7 舌潰瘍灶和肺炎區(qū)蠟塊組織中細菌16S rDNA的PCR結果M： DL2 000 DNA Marker； 1： 舌潰瘍灶邊緣組織； 2： 肺臟炎癥組織； 3： 陰性對照

6 診斷

本試驗根據典型的以舌根、頰部黏膜壞死和潰瘍?yōu)樘卣鞯膲乃佬钥谘撞∽儯谏喔つ冊钸吘壓蜐{液纖維素性化膿性支氣管性肺炎的炎灶內觀察到大量單一的細絲狀藍染菌體，再結合炎癥部位擴增出的壞死絲狀桿菌的16S rDNA序列與GenBank數據庫中的壞死絲狀桿菌同源性最高，綜合診斷為長頸鹿壞死桿菌病。

7 討論

壞死性口炎是犢牛和羔羊口腔壞死桿菌病的最常見形式，是一種發(fā)生在頰部、咽部和喉部黏膜的急性壞死性潰瘍性炎癥[12]，也可表現(xiàn)為面部和下頜膿腫[2,13]，損傷偶見累及腭和牙齦[2]；偶見喉軟骨炎[14]。本試驗中幼齡長頸鹿口腔壞死桿菌病的主要表現(xiàn)為以雙側舌根和頰部黏膜均出現(xiàn)壞死潰瘍灶為主要特征的壞死性口炎，損傷未累及到口腔的其他部位黏膜。

口腔壞死桿菌病的主要傳播途徑是尖銳物刺傷、臼齒脫落、牙石、牛糞便污染的飼料、惡劣的環(huán)境條件和寒冷的天氣等對口腔黏膜造成的創(chuàng)傷[8-10]。蹄皮炎也是反芻動物壞死桿菌病的一種常見病變，發(fā)病動物一個或多個蹄部出現(xiàn)壞死和潰瘍，可累及足部皮下，并沿腱鞘向近端延伸，甚至到達球關節(jié)[2-3]。潮濕的牧場、高溫以及將牲畜隔離在被牛糞便污染的牧場中，當足部上皮損傷可引起壞死桿菌性蹄皮炎[2-3]。壞死桿菌感染引起的陰莖包皮炎曾報道于野生雄性歐洲野牛(Bisonbonasus)，引起包皮和陰莖的壞死和潰瘍[4]。壞死桿菌也被認為是正常反芻動物瘤胃菌群的一種[15]，瘤胃酸中毒時，胃黏膜損傷易使壞死桿菌入侵并引起瘤胃炎和肝膿腫[16]。人類的壞死桿菌病被稱為雷米爾綜合征(Lemierre’s syndrome)或咽峽后敗血癥。雷米爾綜合征是一種由伴有繼發(fā)性膿毒性頸內靜脈血栓性靜脈炎的急性口咽感染所引起的一種膿毒性和全身性壞死桿菌感染[8,17]。本試驗中病死長頸鹿圈舍未飼養(yǎng)過其他動物，生活環(huán)境干燥，因此，沒有引起蹄皮炎和陰莖包皮炎；壞死性口炎也只表現(xiàn)為兩側舌根和頰部出現(xiàn)壞死潰瘍灶，未侵入深部組織，未發(fā)展為雷米爾綜合征病變。

壞死桿菌也可引起叉角羚吸入性支氣管性肺炎和胸膜炎[2]。本例幼齡長頸鹿表現(xiàn)局灶性纖維素性胸膜炎和漿液纖維素性壞死性化膿性融合性支氣管性肺炎，肺炎灶內伴有脈管炎、血栓形成、化膿性壞死性細支氣管炎和大量藍染絲狀壞死桿菌。因大面積嚴重的融合性支氣管性肺炎引起右心功能不全并進一步逐漸累及左心，使左心室負荷過載，引起左心室向心性肥大。

壞死桿菌是革蘭陰性嚴格厭氧的多形態(tài)絲狀桿菌[18]。在本病例中，在肺炎區(qū)組織切面和舌潰瘍灶邊緣組織切面的觸片上可見較單一的大量纖細的革蘭陰性長短不一的絲狀桿菌，組織病理切片內可見大量的藍染頭發(fā)絲狀的絲狀桿菌。通過肺和舌組織壞死桿菌的16S rDNA擴增、測序和GenBank 數據庫中序列比對，所得長1 414 bp的16S rDNA基因序列與F.necrophorumsubsp. funduliforme strain B35(序列號:EF447425.1)菌株同源率最高，達99%，從基因水平上證明引起本病的病原為壞死桿菌。

本試驗中的幼齡長頸鹿僅為3月齡，口腔黏膜薄而易損傷，根據尸檢在瘤胃內觀察到粗質干硬的牧草，推測壞死性口炎的發(fā)生可能是舌根黏膜和頰部黏膜被牧草刺傷導致壞死桿菌感染并大量繁殖。隨后，壞死桿菌被長頸鹿不斷地吸入肺臟引起嚴重的漿液纖維素性壞死性化膿性融合性小葉性肺炎，因此，在肺表面和切面均可見小氣道炎癥引起的明顯的小葉性肺炎病變。最終因長頸鹿呼吸功能衰竭和肺性腦病而死亡。為預防幼齡長頸鹿壞死桿菌病的發(fā)生，建議在哺乳期的幼齡長頸鹿不接觸粗質干草，飼喂牧草時也要選擇優(yōu)質細軟牧草，同時加強日常環(huán)境消毒。壞死桿菌病的治療取決于其臨床表現(xiàn)的嚴重程度和損傷的擴散程度，必須用抗生素治療，如青霉素或頭孢菌素或其衍生物[19]。已證明甲硝唑和克林霉素對一些具有β-內酯酶的壞死桿菌有效[9,20]。一種緩釋型洗必泰擦劑可顯著縮短袋鼠壞死桿菌病的治療時間，并可預防口腔壞死桿菌病的復發(fā)[7]。因此，建議在幼齡長頸鹿出現(xiàn)類似本例的疾病癥狀時，應考慮壞死桿菌病的可能性，進行口腔的臨床檢查，懷疑為壞死桿菌病時采取對癥治療，及時使用文中提到的抗生素，以增加患病動物的存活機會。