王生梅

(青海省海北州海晏縣青海湖鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站 ， 青海 海晏 812299)

牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)引起牛的一種臨床主要表現(xiàn)為繁殖障礙、出血綜合征以及免疫抑制造成的呼吸系統(tǒng)和腸道系統(tǒng)疾病，BVD一直是危害我國養(yǎng)牛業(yè)的主要疫病，也是國際貿(mào)易的重點檢疫疫病[1-3]。牛傳染性鼻氣管炎(Infectious bovine rhinotracheitis，IBR)是由牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)引起牛的一種以高熱、呼吸困難、流鼻涕、上呼吸道及氣管黏膜發(fā)炎等為主要特征的急性、接觸性傳染病，病毒可在腰、脊神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)內(nèi)潛伏感染，導(dǎo)致動物機(jī)體免疫抑制和持續(xù)性感染，病牛長期乃至終身帶毒。近年來，我國IBRV的發(fā)病率呈快速上升趨勢，對當(dāng)前養(yǎng)牛業(yè)的危害較大[4-6]。牦牛主要分布于我國的青海、西藏、新疆、四川，具有“高原之舟”和“全能家畜”之美稱，是我國藏族人民不可缺少的生活和生產(chǎn)資料。近年來，隨著我國對特種動物養(yǎng)殖扶持政策的不斷出臺，牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)得到了前所未有的快速發(fā)展，但牦牛群中動物疫病的發(fā)生率也隨之升高，動物疫病的防控問題已成為牦牛養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的瓶頸。為全面掌握青海省海北州牦牛群中BVDV和IBRV的流行現(xiàn)狀，為有效保護(hù)青海牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，本調(diào)查對2015—2019年采集于青海省海北州的336份牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV和IBRV抗體與抗原檢測，以豐富我國牦牛中BVDV和IBRV流行病學(xué)調(diào)查資料，為提高我國牦牛的BVDV和IBRV綜合防控能力提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品來源及采集方法 2015年3月—2019年12月期間，采集青海省海北州地區(qū)牦牛血清樣品336份，所有血清樣品均為隨機(jī)采樣，所用牦牛均未進(jìn)行BVDV和IBRV相關(guān)疫苗的免疫接種。將牦牛保定后，利用一次性5.0 mL注射器于牦牛頸靜脈處采集血液約2.0 mL，將血液全部打入離心管中，將離心管依次置于37 ℃放置2 h、4 ℃放置4 h后，5 000 r/min離心10 min，吸取上清液即為待檢測血清樣品，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與試劑盒 BVDV、IBRV ELISA抗體檢測試劑盒，為美國IDEXX公司產(chǎn)品；病毒基因組DNA、RNA提取試劑盒、一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、PremixTaq酶，均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.3 血清抗體檢測 分別利用IDEXX公司的BVDV和IBRV ELISA抗體檢測試劑盒依次對2015—2019年采集的336份牦牛血清樣品進(jìn)行BVDV和IBRV的抗體檢測，統(tǒng)計分析不同年份BVDV和IBRV抗體陽性率及BVDV/IBRV混合陽性率。

1.4 血清抗原檢測 利用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒依次提取336份牦牛血清樣品的病毒基因組DNA和RNA。分別參照于新友等[7]建立的BVDV一步法RT-PCR檢測方法和林梅等[8]建立的IBRV PCR檢測方法設(shè)計合成BVDV、IBRV特異性檢測引物(表1)。分別對336份牦牛血清樣品進(jìn)行BVDV和IBRV病原學(xué)檢測，PCR擴(kuò)增信息見表1，統(tǒng)計分析不同年份BVDV和IBRV陽性感染率及BVDV/IBRV混合感染率。

表1 引物和PCR擴(kuò)增信息匯總Table 1 Summary of primer and PCR details

1.5 抗體與抗原檢測結(jié)果的比較分析 對血清抗體檢測結(jié)果和抗原檢測結(jié)果進(jìn)行比較分析，掌握青海省海北州牦牛血清中BVDV和IBRV抗體和抗原感染情況的差別，分析血清抗體檢測方法和抗原檢測方法在BVDV和IBRV流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用的優(yōu)缺點。

2 結(jié)果

2.1 抗體檢測

2.1.1 抗體總體檢測 如表2所示，青海省海北州牦牛血清中BVDV抗體平均陽性率為22.62%，其中2015—2019年的抗體陽性率分別為11.11%、17.19%、22.06%、26.67%和29.76%。青海省海北州牦牛血清中IBRV抗體平均陽性率為15.18%，其中2015—2019年的抗體陽性率分別為8.89%、12.50%、13.24%、18.67%和19.05%。該結(jié)果表明，自2015年開始青海省海北州牦牛群中一直存在BVDV、IBRV抗體陽性牛，因所有牦牛均未免疫接種BVDV和IBRV相關(guān)疫苗，所以抗體陽性是由于感染BVDV、IBRV所致，且海北州牦牛群中BVDV、IBRV抗體陽性率自2015—2019年存在逐步升高的趨勢，尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV抗體陽性率升高幅度較大。

表2 血清抗體總體檢測結(jié)果Table 2 Overall detection results of serum antibodies

2.1.2 抗體單獨陽性和混合陽性分析 如表3所示，在336份牦牛血清中，BVDV單獨陽性樣品共計58份，單獨陽性率達(dá)17.26%；IBRV單獨陽性樣品33份，單獨陽性率達(dá)9.82%；BVDV和IBRV混合陽性樣品18份，混合陽性率達(dá)5.36%；其中2015—2019年BVDV/IBRV混合陽性率分別為0、3.13%、5.88%、6.67%和8.33%。該結(jié)果表明，自2015年開始青海省海北州牦牛群中一直存在BVDV和IBRV的單獨陽性以及BVDV/IBRV的混合陽性，且海北州牦牛群中BVDV和IBRV混合陽性率自2015—2019年存在逐步升高的趨勢。

表3 血清中BVDV抗體和IBRV抗體單獨陽性和混合陽性情況Table 3 Single and mixed BVDV and IBRV positive serum antibodies

2.2 抗原檢測

2.2.1 抗原總體檢測 如表4所示，青海省海北州336份牦牛血清中共檢測出BVDV陽性樣品57份(部分樣品的一步法RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1)，BVDV平均陽性感染率為16.96%，其中2015—2019年的BVDV陽性感染率分別為11.11%、14.06%、16.18%、20.00%和20.24%。336份牦牛血清中共檢測出IBRV陽性樣品44份(部分樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖2)，IBRV平均陽性感染率為13.10%，其中2015—2019年的陽性感染率分別為8.89%、9.38%、10.29%、14.67%和19.05%。該結(jié)果表明，自2015年開始青海省海北州牦牛群中一直存在BVDV、IBRV的陽性感染，且海北州牦牛群中BVDV、IBRV陽性感染率自2015—2019年存在逐步升高的趨勢，尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV陽性感染率升高幅度較大。

表4 血清抗原總體檢測結(jié)果Table 4 Overall detection results of serum antigen

圖1 部分樣品的BVDV一步法RT-PCR擴(kuò)增Fig.1 BVDV one step RT-PCR amplification of some samplesM：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1、3、6、7： BVDV陰性樣品； 2、4、5： BVDV陽性樣品M: DL-2 000 DNA marker； 1，3，6，7: BVDV negative samples； 2，4，5: BVDV positive samples

圖2 部分樣品的IBRV PCR擴(kuò)增Fig.2 IBRV PCR amplification of some samplesM：DL-2 000 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1～4、7、9： IBRV陰性樣品； 5、6、8： IBRV陽性樣品M: DL-2 000 DNA marker； 1-4，7，9: IBRV negative samples；5，6，8: IBRV positive samples

2.2.2 抗原單獨感染和混合感染分析 如表5所示，在336份牦牛血清中，BVDV單獨感染樣品共計45份，單獨陽性感染率達(dá)13.39%。IBRV單獨感染樣品32份，單獨陽性感染率達(dá)9.52%。BVDV和IBRV混合感染樣品12份，混合陽性感染率達(dá)3.57%，其中2015—2019年BVDV/IBRV混合陽性感染率分別為0、3.13%、4.41%、5.33%和5.95%。該結(jié)果表明，青海省海北州牦牛群中存在BVDV、IBRV的單獨感染以及BVDV/IBRV的混合感染，且BVDV/IBRV混合感染率自2015—2019年存在逐步升高的趨勢。

表5 血清中BVDV抗原和IBRV抗原單獨感染和混合感染情況Table 5 Single and mixed positive of BVDV and IBRV antigen in serum

2.3 抗體與抗原檢測結(jié)果的比較分析 336份牦牛血清中，ELISA方法共檢測出BVDV抗體陽性樣品76份，一步法RT-PCR方法共檢測出BVDV陽性樣品57份，有19份樣品呈BVDV抗體陽性、抗原陰性，占樣品總數(shù)的5.65%(19/336)，表明19份樣品為BVDV感染后逐漸康復(fù)的牦牛，即為BVDV持續(xù)感染牦牛。336份牦牛血清中，ELISA方法共檢測出IBRV抗體陽性樣品51份，PCR方法共檢測出IBRV陽性樣品44份，有7份樣品呈IBRV抗體陽性、抗原陰性，占樣品總數(shù)的2.08%(7/336)，表明7份樣品為IBRV感染后逐漸康復(fù)的牦牛，即為IBRV持續(xù)感染牦牛。該結(jié)果說明，青海省海北州牦牛群中存在BVDV和IBRV持續(xù)感染牦牛，為BVDV和IBRV在青海省海北州的防控增加了難度，同時也表明ELISA抗體檢測方法在BVDV和IBRV持續(xù)感染牛的檢測中更具有優(yōu)勢，對于牦牛血清的流行病學(xué)調(diào)查，抗體檢測優(yōu)于抗原檢測。

3 討論

隨著我國牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，不同地區(qū)之間牦牛及其牦牛產(chǎn)品貿(mào)易交流日益頻繁，動物疫病傳播風(fēng)險日益增加，BVDV和IBRV均可造成牦牛的持續(xù)性感染，使牦牛長期處于免疫抑制狀態(tài)，加強(qiáng)BVDV和IBRV的流行病學(xué)監(jiān)測對保障牦牛健康養(yǎng)殖愈發(fā)重要。宋維彪等[9]采用RT-PCR方法對2016—2017年采集于海北州的382份牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV的抗原檢測，BVDV陽性率為26.44%。陳新諾等[10]采用RT-PCR方法對2016年采集于四川和西藏地區(qū)的149份牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV的抗原檢測，BVDV陽性率為19.46%。閆占云等[11]采用RT-PCR方法對2017年采集于青海省湟中縣的138份牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV的抗原檢測，BVDV陽性率為44.93%。楊秀玲等[12]采用RT-PCR方法對2017年采集于青海省西寧市的74份牦牛糞便樣品進(jìn)行了BVDV的抗原檢測，BVDV陽性率為37.84%。袁立崗等[13]采用ELISA方法對2009—2015年采集于天上地區(qū)的144份牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV和IBRV的抗體檢測，BVDV抗體陽性率為52.0%，IBRV抗體陽性率為81.9%。何美琳等[14]采用ELISA方法對2012年采集于川西北地區(qū)的460份牦牛血清樣品進(jìn)行了IBRV的抗體檢測，IBRV抗體陽性率為77.40%。蘇中華等[15]采用ELISA方法對采集于西藏地區(qū)的300份牦牛血清樣品進(jìn)行了IBRV的抗體和抗原檢測，IBRV抗體陽性率為11.0%，IBRV陽性率為10.0%。韓照清等[16]采用ELISA方法對2011—2012年采集于青海省的475份牦牛血清樣品進(jìn)行了IBRV的抗體檢測，IBRV抗體陽性率為44.6%。本調(diào)查分別采用ELISA方法和PCR方法對2015—2019年采集于青海省海北州的336份牦牛血清樣品進(jìn)行了BVDV和IBRV的抗體和抗原檢測，BVDV抗體陽性率為22.62%，IBRV抗體陽性率為15.18%，BVDV/IBRV抗體混合陽性率為5.36%，BVDV陽性率為16.96%，IBRV陽性率為13.10%，BVDV/IBRV混合感染率為3.57%。以上各文獻(xiàn)中的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果各有不同，其原因可能由于采樣時間和采樣地點不同所致，但以上文獻(xiàn)共同說明BVDV和IBRV在不同地區(qū)牦牛群中均具有較高的陽性率，且本調(diào)查發(fā)現(xiàn)BVDV和IBRV存在一定的混合陽性率，應(yīng)引起對混合感染情況的高度重視。

本調(diào)查結(jié)果表明，青海省海北州牦牛群中BVDV和IBRV的抗體和抗原陽性率自2015—2019年均存在逐步升高的趨勢，尤其是2018年和2019年的BVDV和IBRV陽性感染率升高幅度均較大，可見當(dāng)前加強(qiáng)牦牛BVDV和IBRV的綜合防控措施已迫在眉睫。筆者呼吁建立行之有效的BVDV和IBRV綜合防控措施，加強(qiáng)BVDV和IBRV的流行病學(xué)監(jiān)測，對BVDV和IBRV陽性牦牛及時淘汰和剔除，逐步降低牦牛群中BVDV和IBRV的陽性率，為我國牦牛養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的蓬勃健康發(fā)展保駕護(hù)航。