朱來萍 ， 張 昇 ， 楊仕標 ， 詹建舉 ， 李鷙隆 ， 劉丁予 ， 王生奎 ， 姚 俊

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 云南 昆明 650201 ； 2. 云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院 云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室 ， 云南 昆明 650224 ； 3.云南鷙坤生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司 ， 云南 昆明 650502 ； 4.昆明市陽宗海風景名勝區(qū)管理委員會農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 ， 云南 昆明 650502)

2018年9-10月，云南省昆明市郊某規(guī)?；i場飼養(yǎng)的保育豬群散發(fā)腹瀉，雖然發(fā)病率及病死率不高，但腹瀉持續(xù)發(fā)生。通過投喂治療腹瀉的混試劑藥物及飲水用藥進行治療，但療效欠佳。從藥物治療效果不佳的結(jié)果初步判斷為病毒性腹瀉，本試驗遂采集了6份臨床腹瀉糞便樣品，開展了引起豬腹瀉的常見病毒——豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)、豬Delta冠狀病毒(Porcine delta coronavirus,PDCoV)、輪狀病毒A群(Rotavirus A,RVA)的核酸RT-PCR檢測，但檢測結(jié)果均為陰性，排除了上述腹瀉病毒感染的可能。為了盡早查明腹瀉病因，采取對應(yīng)的有效治療及防控措施，本試驗開展了腹瀉仔豬病料的病原菌分離、培養(yǎng)和鑒定工作。

1 材料與方法

1.1 材料 云南省昆明市郊某規(guī)模化豬場采集的腹瀉仔豬肛門棉拭子樣品6份。

1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭染液，均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；Gibco新生犢牛血清、厭氧環(huán)境發(fā)生劑、病毒基因組RNA提取試劑盒(MagMAX-96 Viral RNA Isolation Kit)，均購自美國ThermoFisher Scientific公司；細菌基因組DNA提取試劑盒及DNA Marker 2 000，均購自天根生物技術(shù)(北京)有限公司；一步法RT-PCR試劑盒(One Step RT-PCR Kit)，購自寶生物工程(大連)技術(shù)有限公司。生化鑒定及藥敏測定讀板儀(ATB Reader)、細菌濁度測定儀(DENSIMAT)、腸桿菌科鑒定試條(ID 32E)、獸用細菌藥敏鑒定試條(ATBTMVET)、API NaCl 0.85%培養(yǎng)基及ATB培養(yǎng)基，均購自法國梅里埃公司。

1.3 實驗動物 14只昆明小鼠，購自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.4 引物 細菌16S rRNA通用擴增引物序列參考文獻[1]中的引物序列，委托昆明碩擎生物科技有限公司合成。引物、探針信息見表1。

表1 引物和探針信息Table 1 Primers and probes informations

1.5 豬主要腹瀉病毒核酸的RT-PCR檢測 將采集的6份腹瀉仔豬肛門棉拭子樣品分別勻漿、震蕩靜置后，取上清抽提病毒RNA進行PEDV、TGEV、PDCoV、RVA的病毒核酸RT-PCR檢測。

1.6 細菌分離培養(yǎng)、純化，形態(tài)學(xué)觀察及氧化酶試驗 用無菌接種環(huán)取適量腹瀉仔豬肛門棉拭子樣品，劃線接種于血清瓊脂平板，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)和5%、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h后，取出觀察菌落生長情況，并挑取單菌落進一步劃線純化培養(yǎng)，然后對純化后的菌株進行革蘭染色并置于1 000倍光學(xué)顯微鏡(油鏡)下觀察菌體形態(tài)，同時對菌株進行氧化酶試驗。

1.7 分離菌株的16S rRNA序列擴增、測序及序列分析 取適量純培養(yǎng)的分離菌株抽提細菌基因組DNA，操作方法按照細菌基因組DNA抽提說明書進行。以抽提純化的DNA樣品為模板進行PCR擴增，PCR的反應(yīng)體系為25 μL:2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/mL)各 1 μL，模板 DNA 4 μL，無核酸酶的離子水補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s， 57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 延伸5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng) 1.25%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物送至昆明碩擎生物科技有限公司測序，所得序列經(jīng)DNASTAR軟件進行拼接、校對后，在NCBI GenBank中進行BLAST比對分析。

1.8 細菌生化及藥敏鑒定 選用法國梅里埃ID 32E生化鑒定試條對分離菌株進行細菌生化鑒定，具體操作按照說明書進行，接種后鑒定試條置于37 ℃、 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h±30 min，讀板前滴加1滴JAMES生化試劑于IND孔(吲哚試驗)后讀取結(jié)果。選用法國梅里埃細菌藥敏鑒定試紙條(ATB VET)對分離菌株進行細菌藥敏鑒定，具體操作按照說明書進行，接種后于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h±30 min后讀取結(jié)果。

1.9 實驗動物致病性試驗 用接種環(huán)取適量純化的摩氏摩根菌菌落，懸浮于無菌生理鹽水后測定細菌濃度，并稀釋為2.1×109CFU/mL的細菌濃度，腹腔接種成年昆明小鼠0.3 mL/只，總計接種10只作為試驗組，同時給4只成年昆明小鼠接種同等劑量的無菌生理鹽水作為對照組。接種后每日觀察并記錄小鼠的發(fā)病及死亡情況，及時剖檢發(fā)病死亡小鼠并觀察內(nèi)臟器官的病理變化，無菌采集其內(nèi)臟組織進行致病菌株的回收試驗。

2 結(jié)果

2.1 豬主要腹瀉病毒核酸的RT-PCR檢測 送檢的6份腹瀉仔豬肛門棉拭子樣品的豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬Delta冠狀病毒、輪狀病毒A群RT-PCR檢測結(jié)果均為陰性。

2.2 細菌的分離培養(yǎng) 在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)的血清瓊脂平板上生長出無色至淡黃色、圓形、凸起、光滑、邊緣整齊的菌落(圖1)，37 ℃厭氧培養(yǎng)條件下血清瓊脂平板上均無任何菌落生長。

圖1 分離菌株在血清瓊脂平板上菌落形態(tài)Fig.1 Bacterial colonies on serum agar plate

2.3 分離菌株的鏡檢 分離菌株經(jīng)革蘭染色鏡檢，菌體大小為(0.6～0.7)μm×(1.0～1.7)μm，散在排列，呈球狀、桿狀，有鞭毛，無莢膜，無芽孢的革蘭陰性短桿菌(圖2)。

圖2 革蘭染色鏡檢結(jié)果(1 000×)Fig.2 Gram staining results (1 000×)

2.4 分離菌株的氧化酶試驗 腹瀉仔豬糞便分離出致病菌株的氧化酶試驗結(jié)果為陰性。

2.5 細菌16S rRNA基因的PCR擴增及序列分析 用細菌 16S rRNA 通用引物 PCR擴增獲得該分離菌株的目的基因片段 (圖3)。由圖3可知，目的基因片段大小約為1 415 bp，此片段PCR產(chǎn)物測序，得到1 387 bp的序列，將測定序列進行BLAST比對，結(jié)果顯示該菌與摩氏摩根菌的符合率為99%，判定該分離菌株為摩氏摩根菌。將分離菌株16S rRNA序列的測序結(jié)果與NCBI GenBank中不同來源的摩氏摩根菌的序列進行比較分析，結(jié)果顯示，分離菌株與SDTA-2 株(MH299416.1)和FDAARGOS-172株(CP014026.2)同源性達99.78%。

圖3 分離菌株的16S rRNA PCR擴增結(jié)果Fig.3 PCR amplification results of 16S rRNA gene from the isolateM：DL2 000 DNA Marker； S：分離菌株M：DL2 000 DNA Marker； S:The isolated bacterial strain

2.6 細菌的生化鑒定 生化鑒定結(jié)果表明該分離菌株為摩氏摩根菌的可能性是99.9%(ID%)，鑒定結(jié)果見表2。

表2 分離菌生化鑒定結(jié)果Table 2 Biochemical identification results of the isolate

表3 分離菌藥敏試驗結(jié)果Table 3 Drug sensitivity test results of the isolate

2.8 實驗動物致病性試驗 腹腔接種致病菌的10只 試驗組小鼠于6 h后可觀察到精神沉郁，飲食欲減退，分別于48 h內(nèi)死亡6只，腹腔接種同等劑量的4只對照組小鼠飲食、精神狀況均正常。剖檢可見發(fā)病死亡小鼠的肺臟充血、出血，肝臟、腎臟及脾臟腫大，胃腸道漿膜面充血，并成功從肝臟及心血樣品分離培養(yǎng)回收到同一菌株。

3 討論

近年來，由于豬流行性腹瀉等病毒性腹瀉在云南乃至全國均有發(fā)生和流行，鑒于2018年9-10月云南省昆明市郊某規(guī)模化豬場發(fā)生的仔豬腹瀉案例，雖然臨床上主要是保育豬群中存在持續(xù)性、散發(fā)性腹瀉，糞便形態(tài)也并非水樣，但為了排除豬流行性腹瀉等病毒性腹瀉的可能，本試驗首先對采集的腹瀉仔豬肛門棉拭子樣品進行了PEDV、TGEV、PDCoV、RVA核酸的RT-PCR檢測。在排除了病毒性腹瀉的前提下，為了進一步查明病因，遂開展了病原菌的分離、培養(yǎng)及鑒定。

摩氏摩根菌(M.morganni)隸屬于摩根菌屬(Morganella)，腸桿菌科。該屬有2個種和2個亞種，即摩氏摩根菌(M.morganni)、耐冷摩根菌(M.psychrotolerans)、摩氏摩根菌摩根亞種(M.morgannisubsp.morganni)和摩氏摩根菌西伯尼亞種(M.morgannisubsp.sibonni)[1]。摩氏摩根菌(M.morganni)是一種革蘭陰性兼性厭氧腸道桿菌，大小約為(0.6～0.7)μm×(1.0～1.7)μm，散在排列，無明顯莢膜，無芽孢[2]。該菌于1906年首次被摩根等從小兒糞便中分離出[3]，基因組大小約為4 000k， 其蛋白編碼序列(CDSs)約為4 000個[4]。摩氏摩根菌在自然界中分布廣泛，通常存在于人類、哺乳動物和爬行動物的腸道中，是正常菌群的一部分[5]。摩氏摩根菌對人類而言，這種機會性病原體不容疏忽，能導(dǎo)致人體敗血癥、膿腫、蜂窩組織炎等[6]，該菌通常是從人糞便中分離出，常與尿路感染有關(guān)[7]。

近年來，摩氏摩根菌耐藥性呈上升趨勢，這種耐藥性主要是遺傳和流動性因素導(dǎo)致[8-9]，該菌本質(zhì)上對大多數(shù)對其有活性的抗生素是敏感的，如氨基糖苷類、氯霉素、環(huán)丙沙星等，但對磷霉素、大腸菌素和某些抗生素耐藥[10-11]。這種多藥耐藥(MDR)，甚至廣泛耐藥(XDR)容易導(dǎo)致摩氏摩根菌引起的感染在臨床上治療失敗[12-14]。本試驗對摩氏摩根菌分離菌株的藥敏試驗結(jié)果也顯示其耐藥菌譜較廣，對法國梅里埃細菌藥敏鑒定試條(ATB VET試條)上的所有28種藥物均耐藥，這在開展本試驗的獸醫(yī)實驗室藥敏檢測中還是第1次遇到，提示該條件致病菌在獸醫(yī)臨床上的潛在危害同樣值得引起重視，同樣提示當前養(yǎng)殖環(huán)境中的細菌耐藥現(xiàn)象依然嚴重，養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的獸藥濫用現(xiàn)象依然突出。在國內(nèi)，由摩氏摩根菌引起大鯢、中華鱉、禽蛋、胡子鯰、黑山羊被感染的案例有見報導(dǎo)[15-20]，但關(guān)于哺乳動物源的摩氏摩根菌致病案例報導(dǎo)較少，特別是豬源摩氏摩根菌的分離鑒定到目前為止尚未見報導(dǎo)。