劉超怡 ， 王宇泊 ， 趙一霖 ， 張翼翔 ， 徐成竹 ， 徐海瑛 ， 許素華 ， 溫盛楠

(1.黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450063 ； 2.鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校 ， 河南 鄭州 450064)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是一種廣泛分布于自然界的革蘭陽(yáng)性條件致病菌，能夠分泌一系列的外毒素和酶，可造成人和動(dòng)物局部化膿性感染等疾病[1]。SA對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，耐鹽性較強(qiáng)，在自然環(huán)境中、人體皮膚表面、動(dòng)物皮毛及排泄物中廣為分布。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖業(yè)高度集約化的發(fā)展，抗生素、消毒劑的不合理使用，導(dǎo)致SA耐藥菌株大幅度增加，多重耐藥菌的檢出屢見(jiàn)不鮮。趙效南等對(duì)生鮮牛乳樣品中分離的148株SA進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，SA對(duì)青霉素的耐藥率為77.7%,對(duì)紅霉素的耐藥率為58.1%,對(duì)萬(wàn)古霉素和阿莫西林/克拉維酸的耐藥率較低,分別為0.7%和1.4%[2]。劉茜等從安徽病禽肝臟分離出103株多重耐藥金黃色葡萄球菌，耐藥菌株從三重到八重耐藥均有分布,主要集中在五重(43/103)、四重和六重耐藥，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，β-內(nèi)酰胺類(lèi)的耐藥率最高(79.6%),氨基糖苷類(lèi)次之(71.8%)[3]。多重耐藥菌的高耐藥性可以在動(dòng)物之間傳播，給畜牧業(yè)的臨床治療帶來(lái)困擾，更加值得關(guān)注的是動(dòng)物體內(nèi)的葡萄球菌可以作為耐藥基因的貯存庫(kù)威脅人類(lèi)健康[4-5]。

黃藤素(Fibriuretinin)是我國(guó)自行研發(fā)的純天然藥物。天然黃藤素主要從防已科植物黃藤(FibraurearecisaPierre)的干燥藤莖中提取獲得，是黃藤的主要藥效成分之一，主要化學(xué)成分為巴馬汀，屬生物堿類(lèi)[6]。隨著2010年版《中華人民共和國(guó)獸藥典》黃藤素提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的頒布，黃藤素在畜牧業(yè)中廣泛用于治療菌痢、腸炎。但是對(duì)動(dòng)物源致病菌的抑菌作用報(bào)道較少，對(duì)于多重耐藥菌的抗菌作用未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)觀察黃藤素與抗生素聯(lián)用對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌效果，為黃藤素防控禽源多重耐藥菌的感染與流行提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品 黃藤素，購(gòu)自山西易多利動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào):2014(041036146)；藥敏紙片：紅霉素、青霉素、四環(huán)素、萬(wàn)古霉素、慶大霉素、克林霉素、頭孢西丁，均購(gòu)自杭州天和微生物有限公司。

1.2 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(ATCC25923)，購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；金黃色葡萄球菌臨床分離菌株來(lái)源于規(guī)模養(yǎng)禽場(chǎng)，經(jīng)藥敏試驗(yàn)測(cè)定，選擇編號(hào)為RS1、RS2、RS3的3株標(biāo)本進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3 主要試劑與儀器 LB、MH(B)、MH(A)營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司。立式高壓滅菌器(型號(hào)為BXM-30R)及干燥箱(型號(hào)為BGZ-246)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)制造；隔水保溫箱(型號(hào)為GH-500BC)，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司制造；超凈臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-1FD)，上海錦昱科學(xué)儀器有限公司制造；電子分析天平(型號(hào)為FA2004 N)，上海箐海儀器有限公司制造。

1.4 菌株活化 菌種自然解凍，吸取10 μL放入4 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 振蕩培養(yǎng) 18 h，轉(zhuǎn)接 MH (B)平板，無(wú)菌操作挑取孵育 16 h 的單菌落，置于MH(B) 肉湯中，校正至 0.5 麥?zhǔn)蠞舛取?/p>

1.5 臨床分離菌株的耐藥性檢測(cè) 采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI) 推薦的 K-B 法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[7]，游標(biāo)卡尺測(cè)量藥敏紙片抑菌圈直徑，每次試驗(yàn)用ATCC25923質(zhì)控，重復(fù)3次取平均值，結(jié)果參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.6 黃藤素最小抑菌濃度的測(cè)定 采用微量稀釋法測(cè)定黃藤素最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)，評(píng)價(jià)其抗菌活性。

1.6.1 藥液制備 黃藤素注射液原液的初始濃度為10 mg/mL，經(jīng)生理鹽水2倍倍比稀釋后備用。

1.6.2 菌液制備 活化后的標(biāo)準(zhǔn)菌株及耐藥菌株校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬H肉湯將上述菌懸液進(jìn)行1∶100稀釋后備用，含菌量約為1.5×106CFU/mL。

1.6.3 抑菌試驗(yàn) 取無(wú)菌96孔板，按照由低濃度到高濃度的順序，將配制好的藥物稀釋液50 μL，相應(yīng)加入到9號(hào)孔到1號(hào)孔。將標(biāo)準(zhǔn)菌株及3株耐藥菌株的菌液按每孔50 μL分別接種到9號(hào)孔至1號(hào)孔?？瞻讓?duì)照加100 μL培養(yǎng)基，陰性對(duì)照加菌懸液和培養(yǎng)基的混合物100 μL。每種菌種及其對(duì)照均設(shè) 3 次重復(fù)。完成后加蓋置濕盒內(nèi)，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育16～18 h后觀察結(jié)果。參照對(duì)照孔觀察，孔內(nèi)澄清無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的藥物最低濃度，即為藥物對(duì)待測(cè)菌的MIC。

1.7 黃藤素與抗生素的聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 采用改良的紙片擴(kuò)散法，測(cè)定耐藥菌株對(duì)黃藤素與6種抗菌藥物聯(lián)合抑菌后的敏感程度，標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923進(jìn)行質(zhì)控。

1.7.1 黃藤素平板的制備 按配方制備MH培養(yǎng)基，高壓滅菌后冷卻至65 ℃左右，以黃藤素對(duì)待檢菌1/2MIC為濃度比例，針對(duì)4種菌株分別加入相應(yīng)含量的黃藤素，MH培養(yǎng)基與黃藤素藥液攪拌均勻后傾注12 mL于60 mm的培養(yǎng)皿中，靜置凝固后備用。

1.7.2 K-B法檢測(cè)菌株對(duì)聯(lián)合藥物的敏感性 標(biāo)準(zhǔn)菌株及耐藥菌株校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠁挝唬瑹o(wú)菌操作接種于相應(yīng)黃藤素平板上，靜置后貼抗生素紙片，37 ℃培養(yǎng)18 h，游標(biāo)卡尺測(cè)量并記錄結(jié)果，重復(fù)3次取平均值，結(jié)果參照CLSI標(biāo)準(zhǔn)判讀。

1.8 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS 21.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果

2.1 抗生素對(duì)臨床分離菌株的藥敏試驗(yàn) 結(jié)果見(jiàn)表1，標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌圈直徑均在質(zhì)控范圍內(nèi)，臨床分離株RS1對(duì)6種抗生素中的3種耐藥，RS2、RS3對(duì)其中的4種抗生素耐藥，均為多重耐藥。3株菌株對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，對(duì)青霉素、紅霉素、克林霉素耐藥，其中對(duì)克林霉素耐藥嚴(yán)重，沒(méi)有出現(xiàn)抑菌圈。此外，RS2對(duì)四環(huán)素耐藥，RS3對(duì)慶大霉素耐藥。

表1 6種抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The susceptibility test results of 6 antibiotics against SA (mm)

2.2 黃藤素對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC測(cè)定 黃藤素對(duì)金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC為0.156 mg/mL，對(duì)臨床分離株RS1、RS2、RS3的MIC測(cè)定結(jié)果分別是0.078 mg/mL、0.625 mg/mL和0.078 mg/mL。

2.3 黃藤素與抗生素聯(lián)合對(duì)金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn) 將金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株及3株臨床分離株分別接種在含有1/2MIC濃度的黃藤素平板上，抑菌圈平均值較普通MH平板均有不同程度的增大，具體結(jié)果見(jiàn)表2、表3。其中標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌圈相較于處理前增幅2～10 mm不等；臨床分離株RS1對(duì)紅霉素、克林霉素的抑菌圈無(wú)變化，對(duì)青霉素、萬(wàn)古霉素、慶大霉素的抑菌圈有小量增幅，對(duì)四環(huán)素的抑菌圈增幅達(dá)到9.54 mm；臨床分離株RS2除克林霉素外均出現(xiàn)抑菌圈直徑的增幅，其中對(duì)青霉素的增幅達(dá)到27.13 mm，該菌株對(duì)青霉素恢復(fù)了藥物敏感性；臨床分離株RS3也是除克林霉素外，對(duì)另5種抗生素的抑菌圈直徑均有增幅，其中對(duì)四環(huán)素的藥敏程度由耐藥恢復(fù)到了中介。

表2 黃藤素與6種抗生素聯(lián)合對(duì)金黃色葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The susceptibility test results of fibriuretinin combined with 6 antibiotics against SA (mm)

表3 黃藤素與6種抗生素聯(lián)合用藥后抑菌圈直徑增幅Table 3 The diameter increase in bacteriostatic circle after the combined treatment (mm)

3 討論

金黃色葡萄球菌是畜牧臨床常見(jiàn)的致病菌，分離率較高，可引起多種疾病。本試驗(yàn)選擇6種抗生素對(duì)3株禽源金黃色葡萄球菌分離株進(jìn)行檢測(cè)，藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示3株臨床分離株均具有較高的耐藥性。禽源多重耐藥菌產(chǎn)生的原因可能是畜牧業(yè)在養(yǎng)殖管理或感染治療過(guò)程中非標(biāo)準(zhǔn)的使用了抗生素，憑借經(jīng)驗(yàn)用藥，使用種類(lèi)、劑量不合理，使其選擇壓力較大，從而產(chǎn)生廣泛耐藥性。此外耐藥還可以通過(guò)遺傳因子的轉(zhuǎn)移和傳播獲得，遺傳因子主要包括耐藥質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和噬菌體，它們可以通過(guò)融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等方式在不同致病菌的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或集聚重排，引起多重耐藥菌發(fā)生率大幅上升[8]。

中藥毒副成份少，具有清熱解毒、清熱燥濕、利濕通淋的功效，研究表明黃藤素對(duì)多種革蘭陽(yáng)性和陰性菌有不同程度的抑制作用，尤其具有抗真菌作用[9]。王建濤等用微量量熱法研究發(fā)現(xiàn)，黃藤素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于黃連素、荷葉堿和異漢防己堿[10]。陳熙等試驗(yàn)結(jié)果表明，黃藤素體外抗陰道毛滴蟲(chóng)的作用與甲硝唑相當(dāng)，可作為抗陰道毛滴蟲(chóng)的候選藥物[11]。但是黃藤素對(duì)多重耐藥菌的抑菌作用未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)選用黃藤素在相應(yīng)菌株的1/2MIC濃度下，分別與6種抗生素聯(lián)用，在體外檢測(cè)其對(duì)多重耐藥禽源金黃色葡萄球菌的抑菌作用。青霉素是β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，3株臨床分離株菌均對(duì)青霉素耐藥，與黃藤素聯(lián)用后抑菌圈直徑均增大，其中臨床分離株RS2抑菌圈增加27.13 mm，藥物敏感程度由耐藥恢復(fù)到了敏感；紅霉素、克林霉素是大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素，3株臨床分離株菌對(duì)其耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重到不出現(xiàn)抑菌圈的程度，黃藤素與紅霉素聯(lián)用后，RS2、RS3抑菌圈分別增加到10.46 mm、12.34 mm，但是藥物敏感程度依舊在耐藥的范圍內(nèi)；黃藤素與克林霉素霉素聯(lián)用后，抑菌圈沒(méi)有任何變化。

萬(wàn)古霉素是糖肽類(lèi)抗生素，3株臨床分離株菌均對(duì)萬(wàn)古霉素敏感，在與黃藤素聯(lián)用后，抑菌圈均增加；臨床分離株RS1、RS2對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素敏感，RS3對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素耐藥，在與黃藤素聯(lián)用后抑菌圈增幅從3 mm到11.08 mm不等，RS3對(duì)四環(huán)素的藥物敏感程度恢復(fù)到了中介；慶大霉素是氨基糖苷類(lèi)抗生素的典型代表，在與黃藤素聯(lián)用后，抑菌圈增幅從1.04 mm到5.82 mm不等，藥物敏感程度沒(méi)有變化。

從以上結(jié)果可知，黃藤素與抗菌藥物聯(lián)合后，臨床分離菌對(duì)抗生素的藥物敏感程度有不同的增高，其中與青霉素聯(lián)用的效果最好，與四環(huán)素次之，但是與克林霉素聯(lián)用對(duì)藥物敏感程度沒(méi)有任何變化。這可能與細(xì)菌本身的耐藥機(jī)制相關(guān)，動(dòng)物源性金黃色葡萄球菌已經(jīng)被檢測(cè)出50多種耐藥基因，主要有細(xì)胞壁增厚、抗生素受體失活、主動(dòng)外排作用、更換靶點(diǎn)等耐藥機(jī)制[12]，不同菌株的耐藥基因、耐藥機(jī)制各不相同，與黃藤素聯(lián)用的抑菌結(jié)果各有差異，聯(lián)合用藥的具體抑菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

黃藤素有良好的抗菌作用，與抗生素聯(lián)用可減少臨床獸藥的使用劑量，對(duì)防控阻斷耐藥菌的傳播具有一定意義。但是菌體耐藥機(jī)制復(fù)雜，藥物作用后耐藥基因發(fā)生哪些變化有待進(jìn)一步研究，如何提高聯(lián)合用藥的抑菌效果有待進(jìn)一步探索，以此提高抗生素的治療效果，為防控感染性疾病提供科學(xué)依據(jù)。