趙靜杰 ， 梁 琳 ， 劉子寧 ， 肖發(fā)沂 ， 賈亞雄 ， 梁瑞英 ， 崔尚金

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù) 北京科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站 ， 北京 海淀 100193 ； 3. 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院 ， 山東 濰坊 261061)

貓杯狀病毒(Feline calicivirus,FCV) 屬于杯狀病毒科水皰疹病毒屬，為無(wú)囊膜單股正鏈RNA病毒，是引起貓科動(dòng)物呼吸道疾病的一種常見(jiàn)病原。目前，該病毒可跨物種傳播，呈世界分布[1-2]。FCV不僅對(duì)寵物貓?jiān)斐蓢?yán)重的健康威脅，同時(shí)也威脅著虎、獅、豹等野生貓科動(dòng)物的健康[3-4]。貓皰疹病毒Ⅰ型(Feline herpesvirus type 1,FHV-1) 屬于皰疹病毒科，為有囊膜的線性雙鏈DNA病毒，主要引起貓傳染性鼻氣管炎[5]。兩者臨床癥狀相似，主要表現(xiàn)為呼吸啰音、鼻眼漿液性或膿性分泌物增多等呼吸道癥狀[6]?？诒茄凼米邮沁M(jìn)行FCV病原學(xué)診斷或病毒分離常見(jiàn)的病料，但病料中常含有其他病原體微生物，這給病毒的分離純化帶來(lái)了困難[7]。目前，常見(jiàn)的病毒分離純化技術(shù)有血清中和試驗(yàn)、不同宿主細(xì)胞增殖試驗(yàn)和蝕斑純化。血清中和試驗(yàn)是通過(guò)加入特定抗原的抗體來(lái)中和混合樣品中的特定抗原，該方法適用于不同抗原間無(wú)抗體交叉反應(yīng)的情況，相對(duì)來(lái)說(shuō)成本較高，且市面上抗體質(zhì)量參差不齊，試驗(yàn)效果較難把控[8]。不同宿主細(xì)胞增殖試驗(yàn)是利用不同病毒對(duì)宿主細(xì)胞噬性不同完成病毒篩選及純化的。其中一種病毒能在某種細(xì)胞上增殖，而其他病毒則不能，如此多次重復(fù)操作，可得到純化的單一病毒。FCV和FHV-1均可以在F81及CRFK等貓腎傳代細(xì)胞中良好增殖，所以不能利用該方法完成FCV和FHV-1的分離純化[9-11]。本試驗(yàn)對(duì)F81細(xì)胞純化FCV的條件進(jìn)行優(yōu)化摸索，旨在建立簡(jiǎn)單、快速高效的病毒分離純化方法，通過(guò)建立FCV蝕斑純化方法，為FCV后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為其他病毒的分離純化提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及處理 病料取自大連某寵物醫(yī)院疑似病例口鼻眼拭子，將拭子放于1 mL滅菌 PBS中(含青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL)渦旋振蕩，37 ℃ 培養(yǎng)箱中靜置 1 h，棄去棉拭子，將拭子懸液放于-20 ℃ 冰箱備用。

1.2 細(xì)胞及主要試劑E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自全式金公司；PrimeSTAR Max DNA Polymerase為T(mén)aKaRa產(chǎn)品；柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒、通用型DNA膠回收試劑盒，均購(gòu)自O(shè)MEGA公司；病毒RNA提取試劑盒為艾德萊產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為T(mén)IANGEN產(chǎn)品，購(gòu)自北京匯百惠生物科技中心；2×DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液為SIGAMA產(chǎn)品;胎牛血清(FBS)為Gibco產(chǎn)品；中性紅染色液(0.33% 過(guò)濾除菌，活細(xì)胞染色)，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。低熔點(diǎn)瓊脂糖為SIGAMA產(chǎn)品；PBS緩沖液為Gibco產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中公布的FCV基因序列，利用MAGA 7.0對(duì)比各個(gè)序列之間差異，使用DNAMAN 和DNASTAR進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，同時(shí)參考文獻(xiàn)[12]報(bào)道的FHV-1鑒定引物，引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 FCV和FHV-1基因擴(kuò)增鑒定引物Table 1 FCV and FHV-1 gene amplification and identification primers

1.4 病毒的分離 F81細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，棄生長(zhǎng)液，用PBS洗滌2次，加入處理好的病毒液200 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附90 min，每30 min搖晃1次。90 min后棄病毒液，加入含2% FBS的DMEM，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1～3 d，每12 h觀察1次，細(xì)胞出現(xiàn)圓縮、脫落等明顯細(xì)胞病變后收取細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次后，收取細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行下一步鑒定。

1.5 病毒RT-PCR鑒定 取200 μL細(xì)胞培養(yǎng)物，按照艾德萊病毒RNA提取試劑盒及病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA及DNA，RNA按照TIANGEN反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，RNA 2 μL，Rnase-Free ddH2O 14 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。FCV PCR反應(yīng)體系(20 μL)： PrimeSTAR Max DNA Polymerase 10 μL，F(xiàn)CV-JD-F 1 μL，F(xiàn)CV-JD-R 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。FHV-1 PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2×Taq Plus PCR Master Mix (Ⅱ) 12.5 μL，PCR Enhancer 1 μL，F(xiàn)HV-1-JD-F 0.5 μL，F(xiàn)HV-1-JD-R 0.5 μL，DNA 1 μL，dd H2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s；53.1 ℃ 20 s；72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min[12]。

1.6 FCV F81細(xì)胞蝕斑純化方法的建立

1.6.1 F81細(xì)胞鋪板劑量?jī)?yōu)化 將F81細(xì)胞制成1× 105、3×105、5×105、7×105、9×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔2 mL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每12 h觀察細(xì)胞狀態(tài)及鋪板情況。

1.6.2 低熔點(diǎn)瓊脂糖濃度的優(yōu)化 用PBS分別配制2%、4%和6%的低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液，高壓滅菌后，置于40～50 ℃水浴中備用；制備含5% FBS的2× DMEM，將兩者按1∶1的比例混勻后，40～50 ℃水浴備用。低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液終濃度分別為1%、2%和3%，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，取10-1～10-8稀釋度的混合病毒液200 μL分別接種到6孔板中，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱吸附90 min，每30 min晃動(dòng)1次。 90 min后棄去病毒液，每孔加入2 mL第1層瓊脂，觀察第1層瓊脂凝固情況。

1.6.3 第1層覆蓋液鋪板時(shí)間的優(yōu)化 待F81細(xì)胞培養(yǎng)至致密單層。將混合病毒進(jìn)行10倍倍比稀釋?zhuān)?0-1～10-8稀釋度的混合病毒液200 μL接種到6孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附時(shí)間分別為30、60、90、120 min和180 min，到時(shí)間后棄去病毒液并用PBS洗2遍，每孔加入2 mL第1層覆蓋液，待第1層覆蓋液完全凝固后，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每12 h觀察細(xì)胞是否出現(xiàn)圓縮、脫落等細(xì)胞病變。48 h后每孔加入2 mL第2層覆蓋液(第2層覆蓋液：5% FBS的2×DMEM和2%低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液等體積混合，添加0.01%中性紅染色液)，待第2層覆蓋液完全凝固后，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)，每3 h觀察蝕斑形成情況。

1.6.4 第2層覆蓋液鋪板時(shí)間的優(yōu)化 確定第1層覆蓋液鋪板時(shí)間后，分別在完成第1層覆蓋后24、36、48、56 h和72 h覆蓋第2層覆蓋液，待第2層覆蓋液完全凝固后，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)，每3 h觀察蝕斑形成情況。

1.6.5 蝕斑挑取、擴(kuò)增及鑒定 待蝕斑形成后用修剪好的黃色槍頭挑取噬斑，并放入500 μL 的無(wú)血清DMEM中,反復(fù)凍融3次后，取200 μL提取RNA，采用RT-PCR進(jìn)行鑒定[13-14]。鑒定結(jié)果為FCV陽(yáng)性的再次進(jìn)行蝕斑試驗(yàn)，取上清繼續(xù)克隆純化，經(jīng)3輪純化并經(jīng)RT-PCR鑒定，結(jié)果為FCV陽(yáng)性且FHV-1陰性的病毒液擴(kuò)大培養(yǎng)，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 病毒的RT-PCR鑒定 混合病毒接種F81單層細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)F81細(xì)胞出現(xiàn)變圓、脫落，細(xì)胞聚集在一起呈葡萄串樣典型細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。將收取的病毒培養(yǎng)液按照病毒RNA提取試劑盒及病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA及DNA，以獲得的RNA及DNA為模板，進(jìn)行FCV、FHV-1 PCR檢測(cè)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后顯示，在456 bp及474 bp處分別出現(xiàn)特異性片段(圖1)。表明病毒為FCV和FHV-1混合病毒。

圖1 FCV和FHV-1 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of FCV and FHV-1 PCR productsM:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:FHV-1; 2:FHV-1陰性對(duì)照; 3:FCV; 4:FCV陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA Marker; 1:FHV-1; 2:FHV-1 negative control; 3:FCV; 4:FCV negative control

2.2 FCV F81細(xì)胞蝕斑純化方法的建立

2.2.1 F81細(xì)胞鋪板劑量?jī)?yōu)化 以每孔不同劑量的F81細(xì)胞鋪6孔板，24 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)及密度，結(jié)果顯示鋪板細(xì)胞數(shù)為1×105、3×105、5×105個(gè)/mL時(shí)，細(xì)胞未長(zhǎng)滿，中間間隙較多，無(wú)法滿足蝕斑純化的要求；鋪板劑量為9×105個(gè)/mL，細(xì)胞過(guò)于密集，且培養(yǎng)基中有漂浮死細(xì)胞；最終確定鋪板劑量為7×105個(gè)/mL，此劑量細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞呈緊密規(guī)則排列，適合進(jìn)行蝕斑純化試驗(yàn)。

2.2.2 低熔點(diǎn)瓊脂糖濃度的優(yōu)化 低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液終濃度為1% 時(shí)，第1層覆蓋液凝固不佳，倒置培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)脫落情況；低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液終濃度為3%時(shí)，第1層覆蓋液相對(duì)較硬；最終選取低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液終濃度為2%。

2.2.3 第1層覆蓋液鋪板時(shí)間的優(yōu)化 結(jié)果顯示，吸附時(shí)間30 min及60 min后鋪第1層覆蓋液，蝕斑數(shù)量較少；吸附時(shí)間120 min及180 min后鋪第1層覆蓋液，可能因更多的病毒完成吸附，使得細(xì)胞病變區(qū)域較多，不利于蝕斑的挑取；吸附時(shí)間為90 min時(shí)，蝕斑數(shù)適中，最終確定鋪第1層覆蓋液時(shí)間為病毒吸附90 min后。

2.2.4 第2層覆蓋液鋪板時(shí)間的優(yōu)化 分別在完成第1層覆蓋后24、36、48、56 h和72 h鋪第2層覆蓋液，其中24 h和36 h后鋪第2層覆蓋液，蝕斑較小，不易挑取，待蝕斑長(zhǎng)大時(shí)，中性紅顏色卻變得不明顯；56 h和72 h后鋪第2層覆蓋液，由于病變區(qū)域時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，蝕斑較多且大小不均；48 h后鋪第2層覆蓋液，3 h后便可在10-5稀釋度觀察到蝕斑(圖2)。蝕斑呈圓形或類(lèi)圓形，大小較均勻，直徑為1.0～2.0 mm，邊緣清晰。最終確定第2層覆蓋液鋪板時(shí)間為第1層覆蓋液鋪板48 h后，此時(shí)挑取蝕斑最佳。顯微鏡下觀察，可見(jiàn)病毒在細(xì)胞單層上形成明顯的局限性病灶(圖3)。

圖2 FCV感染F81細(xì)胞形成的蝕斑Fig.2 Plaque formed by FCV on F81 cellsA:接毒組; B:對(duì)照組A:Inoculation group; B:Control group

圖3 FCV感染F81細(xì)胞形成的蝕斑 (40×)Fig.3 Plaque formed by FCV on F81 cells (40×)A:接毒組； B:對(duì)照組A:Inoculation group; B:Control group

2.2.5 蝕斑純化后蝕斑的挑取及病毒鑒定 經(jīng)過(guò)3輪蝕斑純化，同樣條件下均出現(xiàn)同樣規(guī)律的蝕斑。取第3輪挑取的蝕斑病毒培養(yǎng)液，擴(kuò)大培養(yǎng)后收取細(xì)胞培養(yǎng)液，按照病毒RNA提取試劑盒及病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒總RNA和DNA，以獲得的RNA及DNA為模板，按照2.1方法進(jìn)行FCV和FHV-1 PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)后顯示，僅在456 bp處出現(xiàn)FCV特異性片段(圖4)，挑取蝕斑FCV RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率為100%，且通過(guò)序列比對(duì)，純化病毒無(wú)變異，表明FCV分離純化成功。

圖4 蝕斑試驗(yàn)后PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR identification result after plaque testM:DL-2 000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn); 1:FHV-1; 2:FHV-1陰性對(duì)照; 3:FCV; 4:FCV陰性對(duì)照M:DL-2 000 DNA Marker; 1:FHV-1; 2:FHV-1 negative control; 3:FCV; 4:FCV negative control

3 討論

FCV在貓群中感染率較高,主要引起貓口腔潰瘍和上呼吸道疾病[15]。流行病學(xué)調(diào)查試驗(yàn)表明，F(xiàn)CV常和FHV-I、貓細(xì)小病毒等病原混合感染[16]，從臨床發(fā)病或者死亡的貓中獲得的病料常常存在多種病毒，除FCV外，其他病毒大多也在細(xì)胞上增殖，這大大影響了病毒的分離、病毒滴度測(cè)定及生物學(xué)特性等試驗(yàn)。

1952年，Dulbecco將噬菌體空斑技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物病毒學(xué)，病毒蝕斑技術(shù)(Virus plaque formation)成為病毒純化克隆和病毒生物學(xué)特性試驗(yàn)的常見(jiàn)方法[17]。病毒蝕斑的形成是由于病毒感染細(xì)胞后，在固體介質(zhì)的限制下，釋放的病毒只能由最初感染的細(xì)胞向周邊擴(kuò)展。經(jīng)過(guò)幾個(gè)增殖周期，便形成一個(gè)局限性病變細(xì)胞區(qū)[18]。目前，病毒蝕斑技術(shù)在病毒分離和病毒定量方面應(yīng)用廣泛，但寵物常見(jiàn)病毒的蝕斑純化方法尚未報(bào)道。本試驗(yàn)利用梯度稀釋法對(duì)混合毒進(jìn)行稀釋?zhuān)缓笠来武亙蓪迎傊采w液對(duì)混合毒進(jìn)行純化，并對(duì)FCV蝕斑形成條件進(jìn)行優(yōu)化摸索：(1) F81細(xì)胞鋪板密度。細(xì)胞鋪板密度過(guò)大會(huì)造成細(xì)胞過(guò)于密集甚至培養(yǎng)基中有漂浮死細(xì)胞，過(guò)小細(xì)胞未長(zhǎng)滿，中間間隙較多，無(wú)法滿足蝕斑純化的要求，細(xì)胞數(shù)為7×105個(gè)/mL，每孔2 mL為最適宜。(2)瓊脂糖濃度。瓊脂糖濃度大小直接影響覆蓋液鋪板成功與否，是蝕斑純化關(guān)鍵因素之一，濃度過(guò)低時(shí)，第1層覆蓋液凝固不佳，倒置培養(yǎng)過(guò)程出現(xiàn)脫落情況；濃度過(guò)高時(shí)，第1層覆蓋液相對(duì)較硬，影響細(xì)胞透氣，最終確定低熔點(diǎn)瓊脂糖溶液適宜終濃度為2%，另外需要注意的是，瓊脂糖現(xiàn)配現(xiàn)用，并避免反復(fù)高壓。(3)覆蓋液鋪板時(shí)間。通過(guò)比較最終確定鋪第1層覆蓋液時(shí)間為病毒吸附90 min 后，第2層覆蓋液鋪板時(shí)間為第1層覆蓋液鋪板48 h后，此條件最終形成蝕斑數(shù)量及大小均適合挑取。添加第1、2層覆蓋液時(shí)，速度要快，避免速度慢造成瓊脂糖凝固，同時(shí)也要注意避免產(chǎn)生氣泡，否則后期影響蝕斑觀察。(4) 挑取蝕斑。由于FCV形成蝕斑相對(duì)較小，挑取蝕斑時(shí)應(yīng)小心，避免碰觸周?chē)g斑。

本試驗(yàn)完成FCV蝕斑形成條件的優(yōu)化并建立貓杯狀病毒蝕斑純化方法，該方法具有成本低、操作簡(jiǎn)單、試驗(yàn)周期短、純化效率高等優(yōu)點(diǎn)，4～5 d即可以完成病毒的純化，有效解決了后續(xù)試驗(yàn)對(duì)純凈病毒的要求。本試驗(yàn)也為其他病毒的分離純化提供了借鑒和方法。