栗亮亮 ， 溫東旭,2 ， 徐業(yè)芬,2 ， 王運(yùn)路,2 ， 常新明 ， 趙啟涵 ， 秦忠璞 ， 索朗斯珠,2 ， 牛家強(qiáng),2

(1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 西藏 林芝 860000 ； 2. 西藏農(nóng)牧學(xué)院西藏高原動(dòng)物疫病研究自治區(qū)高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 西藏 林芝 860000)

牦牛起源于中國(guó)青藏高原，早期家養(yǎng)牦牛由野牦牛馴化而來(lái)，在當(dāng)?shù)剞r(nóng)牧民生產(chǎn)生活和畜牧業(yè)發(fā)展中占有重要地位，是最具高原特色的經(jīng)濟(jì)性動(dòng)物。雖然經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的進(jìn)化，牦牛已經(jīng)能夠適應(yīng)高海拔、寒冷、低氧等環(huán)境，但受到遺傳因素和環(huán)境的影響，牦牛生長(zhǎng)緩慢且疾病多發(fā)。近年來(lái)，細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)的研究報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，免疫接種也未能達(dá)到預(yù)期效果。因此，如何提高牦牛群體免疫力，降低農(nóng)牧民損失是亟需解決的問(wèn)題?？共∮N是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，可通過(guò)選育抗病力強(qiáng)的個(gè)體進(jìn)行育種從而提高群體免疫能力，避免過(guò)度依賴藥物和疫苗。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)基因是重要的抗病候選基因之一，表達(dá)產(chǎn)物為 Ⅰ 型跨膜蛋白受體，可識(shí)別多種細(xì)菌、病毒等微生物的固有成分，激活相應(yīng)信號(hào)通路，從而引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，其中TLR-4受體在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、B細(xì)胞系等免疫細(xì)胞上均有表達(dá)，主要識(shí)別革蘭陰性菌細(xì)胞壁組成成分脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)[1]，并與煙酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶結(jié)合后可誘導(dǎo)增強(qiáng)核因子(Nuclear factor-κB，NF-κB)的轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)肺組織炎癥損傷及天然免疫過(guò)程[2]。

微小RNA(microRNA，miRNA)，是一種長(zhǎng)度大小為18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，主要通過(guò)靶向mRNA的3′非編碼區(qū)(3′-Untranslated region，3′-UTR)抑制基因的翻譯，進(jìn)而在生長(zhǎng)發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程中發(fā)揮調(diào)控作用[3]。研究顯示，牛血清中miRNAs在口蹄疫感染的不同時(shí)期表達(dá)量存在差異，揭示miRNAs可能與?？谔阋呙庖哒{(diào)節(jié)相關(guān)[4]，此外發(fā)現(xiàn)miR-146a和miR-181c可能通過(guò)靶向TLR-4基因參與調(diào)控奶牛乳腺炎的發(fā)生發(fā)展[5]，但鮮見(jiàn)牦牛miRNAs的研究報(bào)道。本試驗(yàn)旨在擴(kuò)增克隆牦牛TLR-4基因3′-UTR區(qū)，并對(duì)可能靶定TLR-4基因miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索牦牛體內(nèi)miRNAs與TLR-4基因的3′-UTR區(qū)可能靶向關(guān)系，為牦牛疫病防治及抗病性育種提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑儀器

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 牦牛血樣共341份，分別來(lái)源于青海稱多縣30份、湟源縣58份、大通縣208份、西藏林芝市周邊15份、波密縣康玉鄉(xiāng)30份，牦牛免疫程序及飼養(yǎng)條件基本一致。用ACD抗凝管進(jìn)行頸靜脈采集血樣，采集完畢后立刻置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存。

1.1.2 主要試劑 T5全血直擴(kuò)試劑盒、瓊脂糖、核酸染料，均購(gòu)自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；電泳儀和電泳槽，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像儀，美國(guó)GEN公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中牦牛XM_005891938.1序列號(hào)，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成引物。上游引物：5′-GGAGAATCCCCTGATGTGCT-3′，下游引物：5′-ATGGGTTGATAGAGAAGACGTGG-3′，目的片段大小為623 bp。

1.2.2 DNA混池構(gòu)建 將341份血樣分別吸取20 μL構(gòu)建5個(gè)DNA混池，分別命名為T1、T2、T3、T4和T5。T1含波密縣康玉鄉(xiāng)30份牦牛血樣，林芝周邊15份牦牛血樣；T2含青海湟源縣58份牦牛血樣；T3含青海大通縣40份牦牛血樣；T4含青海大通縣102份牦牛血樣；T5含青海稱多縣30份牦牛血樣，青海大通縣66份牦牛血樣。

1.2.3 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)總體系(50 μL)：T5 Mix 25 μL，上游引物2 μL,下游引物2 μL，牦牛血樣5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，擴(kuò)增52個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 miRNAs預(yù)測(cè) 通過(guò)TargetScan 7(http://www.targetscan.org/vert_72/)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)可能靶定TLR-4基因的miRNAs進(jìn)行預(yù)測(cè)。物種選擇牛，靶定基因輸入TLR-4，其余參數(shù)默認(rèn)。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行序列對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1TLR-4基因的PCR檢測(cè) PCR反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)圖1。通過(guò)測(cè)序?qū)Ρ劝l(fā)現(xiàn)，TLR-4基因3′-UTR區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物為623 bp，與預(yù)期片段大小基本一致，可以進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 TLR-4基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of TLR-4 geneM：DNA分子量標(biāo)記(DL2 000 DNA marker)；1：牦牛TLR-4基因3′-UTR區(qū)擴(kuò)增片斷M：DNA molecular weight marker(DL2 000 DNA marker)；1:Amplified fragment of 3′-UTR region of TLR-4 gene in yak

2.2 DNA混池測(cè)序 DNA混池測(cè)序結(jié)果與GenBank中牛TLR-4基因序列相比較，檢測(cè)出擴(kuò)增片段可能含有2個(gè)單核苷酸位點(diǎn)(Single nucleotide polymorphism,SNP)發(fā)生突變(圖2)，其中T1組TLR-4基因3′-UTR區(qū)在存在A382G突變，T3組TLR-4基因3′-UTR 區(qū)未檢測(cè)到突變，T2組、T4組、T5組TLR-4基因3′-UTR區(qū)均檢測(cè)到A380G、A382G兩處突變。

圖2 DNA混合池測(cè)序結(jié)果Fig.2 Results of DNA mixing pool sequencing

2.3 miRNAs預(yù)測(cè) 通過(guò)TargetScan 7數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，物種選擇牛，靶定基因?yàn)門LR-4，其余參數(shù)默認(rèn)，共預(yù)測(cè)到18個(gè)可能靶向牛TLR-4基因3′-UTR區(qū)的miRNAs，具體見(jiàn)表1。

表1 TargetScan 7數(shù)據(jù)庫(kù)靶定TLR-4基因3′-UTR區(qū)的miRNAs預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of miRNAs in 3′-UTR region of TLR-4 gene based on TargetScan 7 database

3 討論

TLRs是天然免疫中重要的模式識(shí)別受體之一，最初在果蠅中發(fā)現(xiàn)，至今在哺乳動(dòng)物中共發(fā)現(xiàn)了13種不同的TLRs，可在多種細(xì)胞上表達(dá)，并通過(guò)識(shí)別病原微生物細(xì)胞內(nèi)、外的固有成分誘導(dǎo)炎性因子產(chǎn)生，參與天然免疫反應(yīng)[6]。其中TLR-4是目前研究較為廣泛的受體之一，可識(shí)別革蘭陰性菌LPS[1]、呼吸道合胞病毒的融合蛋白[7]、枯氏錐蟲(chóng)的糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白[8]等成分。研究顯示，TLR-4受體被激活后可通過(guò)NF-κB/MAPK信號(hào)通路上調(diào)乳腺炎相關(guān)的促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)[9]，其與乳腺炎、肺損傷及纖維化[2]、免疫排斥反應(yīng)[10]等密切相關(guān)，而且轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控對(duì)TLR-4受體蛋白的表達(dá)具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，基因的3′-UTR區(qū)是轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的重要區(qū)域，其參與miRNAs的定位、穩(wěn)定性和翻譯過(guò)程，并可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間相互作用，可將3′-UTR區(qū)遺傳信息傳遞給蛋白質(zhì)，在遺傳中發(fā)揮重要功能[11]，如在地中海水牛干擾素γ(Interferon gamma,IFNG)基因[12]和奶牛中性粒細(xì)胞胞漿因子4(Neutrophil cytosolic factor 4,NCF-4)基因[13]3′-UTR區(qū)均存在1個(gè)SNP位點(diǎn)，分別與結(jié)核病和乳腺炎相關(guān)，但目前鮮見(jiàn)牛TLR-4基因3′-UTR區(qū)相關(guān)研究報(bào)道。醫(yī)學(xué)研究表明，人類TLR-4基因3′-UTR區(qū)存在3個(gè)SNP位點(diǎn)，與呼吸道合胞病毒(Respiratory syncytial virus,RSV)疾病調(diào)控有關(guān)[14]。本試驗(yàn)成功擴(kuò)增了牦牛TLR-4基因3′-UTR 區(qū)片段，產(chǎn)物大小為623 bp，DNA混池測(cè)序結(jié)果顯示，TLR-4基因3′-UTR區(qū)可能存在A380G和A382G 兩個(gè)突變位點(diǎn)，但在牦牛上是否也與乳腺炎、結(jié)核病及RSV等疾病相關(guān)，仍需進(jìn)一步研究確認(rèn)。

MicroRNA是一種內(nèi)源性非編碼微小RNA分子，參與細(xì)胞分化、機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤發(fā)生等過(guò)程，可在多種動(dòng)物體內(nèi)均有表達(dá)[15]，并表現(xiàn)為高度保守性。MicroRNA主要通過(guò)與3′-UTR區(qū)靶向結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因的表達(dá)具有重要調(diào)控作用，參與機(jī)體多種疾病過(guò)程[3]。本試驗(yàn)通過(guò)TargetScan 7數(shù)據(jù)庫(kù)共預(yù)測(cè)到18個(gè)可能靶向牦牛TLR-4基因3′-UTR區(qū)的miRNAs，但這些miRNAs在動(dòng)物上鮮有報(bào)道，大多與人類多種癌癥及炎癥相關(guān)。與TLR-4基因相關(guān)的有miR-448和bta-miR-216a-5p，miR-448[16]可通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化作用抑制TLR-4基因表達(dá)，與人類糖尿病發(fā)展有關(guān)，而bta-miR-216a-5p[17]可與TLR-4受體3′-UTR區(qū)靶向結(jié)合，抑制TLR4-MyD 88信號(hào)通路和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，與梅毒病相關(guān)。bta-miR-338、bta-miR-146a和bta-miR-146b在人類和動(dòng)物上研究均較為深入，bta-miR-338在牛骨骼肌中差異表達(dá)，可影響牛肌肉蛋白質(zhì)水解和嫩度[18]，miR-338-3p可靶向大鼠肉瘤相關(guān)蛋白23(Ras-related protein-23，RAB-23)基因的3′-UTR區(qū)，調(diào)控前列腺癌[19]的發(fā)展。miR-146a[20]可抑制人自分泌的IL-6和IL-21產(chǎn)生，阻斷輔助性T細(xì)胞17分化進(jìn)程，與自身免疫性疾病相關(guān)。此外，bta-miR-146a以牛腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(Tumor-necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF-6)基因的3′-UTR區(qū)為靶點(diǎn)，下調(diào)TLR-4/TRAF-6/NF-κB通路，對(duì)牛乳腺炎及先天性免疫有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用[21]，bta-miR-146a還與肺泡巨噬細(xì)胞具有特異性，上調(diào)牛結(jié)核病相關(guān)miRNAs，激發(fā)癌基因表達(dá)[22]，在牦牛上可通過(guò)調(diào)節(jié)Smad4基因表達(dá)影響牦牛卵泡發(fā)育[23]，bta-miR-146b過(guò)度表達(dá)對(duì)牛雄性生殖細(xì)胞增殖有抑制作用[24]，另有研究表明，其與乳腺發(fā)育、免疫應(yīng)答相關(guān)[25]。因此，本試驗(yàn)預(yù)測(cè)篩選到的18個(gè)miRNAs與牦牛TLR-4基因3′-UTR 區(qū)2個(gè)SNP位點(diǎn)是否存在真實(shí)靶向關(guān)系及在疾病防控和免疫方面能否起到作用，有待深入研究。