翟志恒，田楊，周玉妮，宋玉成

濟寧醫(yī)學院濟寧市精神病防治院，山東濟寧 272051

阿爾茨海默病(Alzheimer‘s disease，AD)，又稱老年性癡呆，是一種不可逆的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病[1]，臨床主要表現(xiàn)為漸進性記憶障礙等神經(jīng)精神癥狀，嚴重影響患者的社交、工作與生活功能[2]。目前，AD的具體發(fā)病機制尚未明確，尚無有效的治療方法[3]。因此，開發(fā)潛在的精準AD生物標志物具有重要意義[4]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)在神經(jīng)退行性疾病中的作用近年逐漸受到重視[5]。核富集轉(zhuǎn)錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是一種廣泛表達的lncRNA，在神經(jīng)退行性疾病中的表達發(fā)生了明顯變化[6]。Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)，在小鼠巨噬細胞中，NEAT1可以激活pro-caspase-1，促進炎性小體NLRP3聚集，穩(wěn)定cleaved-caspase-1，并提高caspase-1的活性。本研究探討了lncRNA NEAT1激活PI3K/Akt信號通路對Aβ25-35誘導的AD模型細胞凋亡的影響及可能機制，以期為開發(fā)新的AD生物標志物提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 PC12細胞購自中國科學院；胎牛血清(FBS)、DMEM高糖培養(yǎng)基、青/鏈霉素購自美國Invigentech公司；Lipofectamine 2000、質(zhì)粒孵育培養(yǎng)基Opti-MEM及Aβ25-35購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自美國Amresco公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Annexin V-FITC/PI試劑盒、TB Green Premix EXTaqⅡ試劑盒、CCK-8檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、GAPDH一抗以及羊抗兔二抗購自武漢菲恩生物科技有限公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒購自日本TaKaRa公司；pcDNA3.1 lncRNA NEAT1質(zhì)粒及相應(yīng)空載體購自廣州吉賽生物科技股份有限公司；小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)及相應(yīng)陰性對照(siRNA NC，si-NC)購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-18和腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；PI3K通路抑制劑LY294002(HY-10108)購自美國MedChemExpress公司。酶標儀(Imark)購自美國伯樂公司；實時熒光定量PCR儀(ABI7700)購自美國ABI公司；流式細胞儀(FACSCalibur)購自美國BD公司；Western blotting檢測系統(tǒng)購自美國Molecular Devices公司。

1.2 AD細胞模型構(gòu)建 PC12細胞于含0.1 ml/ml胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞接種于96孔板中，加入不同濃度的Aβ25-35(0、5、10、20 μmol/L)作用24 h，建立AD細胞模型?？紤]到Aβ25-35對P12細胞毒性的影響，選擇5 μmol/L Aβ25-35處理PC12細胞，并于24、48、72 h檢測lncRNA NEAT1相對表達水平。

1.3 qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1相對表達水平按照Trizol說明書步驟提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，測定cDNA濃度，利用TB Green Premix EXTaqⅡ試劑盒進行qRT-PCR擴增。反應(yīng)體系(20 μl)：1 μl cDNA、上下游引物各0.5 μl、10 μl SYBR Premix ExTaq、8 μl ddH2O。反應(yīng)條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成。lncRNA NEAT1：上游引物5‘-GGCAGGTCTAGTTTGGGCAT-3‘，下游引物5‘-CCTCATCCCTCCCAGTACCA-3‘；GAPDH：上游引物5‘-CCCTTCATTGACCTCAACTACA-3‘，下游引物5‘-ATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3‘。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算lncRNA NEAT1的相對表達水平。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.4 lncRNA NEAT1細胞轉(zhuǎn)染 將5 μl Lipofectamine 2000加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置5 min；分別取5 μg siRNA-lncRNA (si-lncRNA)NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC、pcDNA3.1-lncRNA NEAT1加入250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置5 min；將含Lipofectamine 2000的Opti-MEM培養(yǎng)基分別與含si-lncRNA NEAT1、si-NC、pcDNA3.1-NC或pcDNA3.1-lncRNA NEAT1的Opti-MEM培養(yǎng)基混勻，室溫靜置25 min。取PC12細胞接種于96孔板中，設(shè)置對照組、敲降lncRNA NEAT1組、si-NC組、空載體組及過表達lncRNA NEAT1組。敲降lncRNA NEAT1組、si-NC組、空載體組及過表達lncRNA NEAT1組每孔加入質(zhì)粒混合液混勻并于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染8 h后更換為新鮮常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后分別加入20 μmol/L Aβ25-35繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換為新鮮常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；對照組不做處理，培養(yǎng)方法同其余各組。

1.4.1 qRT-PCR檢測lncRNA NEAT1相對表達水平按照1.3中的步驟檢測各組lncRNA NEAT1相對表達水平。

1.4.2 CCK-8法檢測細胞活力 收集各組細胞，接種于96孔板中(5×103個/孔)，設(shè)置3個復孔，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育2 h，采用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度(A450)值。

1.4.3 流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布 收集各組細胞，使用胰蛋白酶消化，1000 r/min離心6 min，棄上清；用培養(yǎng)液重懸細胞，并用無水乙醇在-20 ℃條件下過夜固定細胞；去除固定液，用PBS重懸細胞，1000×g離心5 min，重復2次；PBS清洗細胞，用含RNase A的溶液消化1 h；加入PI溶液終止消化并避光染色8 min，采用流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。

1.4.4 ELISA檢測細胞上清中炎性因子水平 使用IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α ELISA試劑盒檢測細胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α的水平。將各組細胞接種于96孔板中培養(yǎng)48 h，洗滌4次，加入生物素標記的抗體工作液、酶偶聯(lián)物，室溫孵育30 min；洗滌，加入顯色底物顯色，采用酶標儀測定各孔450 nm處的吸光度(A450)值。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.5 Western blotting檢測p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達水平 收集對照組、空載體組及過表達lncRNA NEAT1組細胞，接種于96孔板中(5×103個/孔)，加入RIPA裂解液，將96孔板于0 ℃振蕩30 min，4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取上清，采用BCA法測定總蛋白濃度。取25 μg蛋白上樣，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(90 V 30 min，120 V至溴酚藍到達凝膠底部)，然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上。加入5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗兔抗p-PI3K(1:1000)、PI3K(1:1000)、Akt(1:1000)、p-Akt(1:1000)及內(nèi)參GAPDH(1:1000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:10 000)，室溫孵育1 h；TBST洗滌3次，用ECL顯色液顯色，ImageJ軟件對條帶進行灰度分析。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況 取PC12細胞，以5×103個/孔的密度接種于無菌96孔板中，設(shè)置對照組、si-NC組、敲降lncRNA NEAT1組、空載體組、過表達lncRNA NEAT1組及過表達lncRNA NEAT1+LY294002組，對照組、si-NC組、敲降lncRNA NEAT1組、空載體組、過表達lncRNA NEAT1組處理同1.4，過表達lncRNA NEAT1+LY294002組細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-lncRNA NEAT1后，加入10 μmol/L PI3K通路抑制劑LY294002處理。培養(yǎng)48 h后用不含EDTA的胰蛋白酶對貼壁細胞進行消化并于室溫下孵育，制備細胞懸浮液。取5×104個細胞，加入緩沖液懸浮細胞并轉(zhuǎn)移至流式管中，然后加入5 μl Annexin V-FITC混勻，于室溫避光條件下孵育15 min，上機前5 min加入5 μl PI進行染色，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。實驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 22.0和GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計分析和制圖。計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布者以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合正態(tài)分布者以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ25-35對PC12細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1表達的影響 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，0、5、10、20 μmol/L Aβ25-35作用24 h后，PC12細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1相對表達水平降低(依次為0.90±0.05、0.67±0.07、0.53±0.03、0.34±0.09)，且呈濃度依賴性(F=110.51，P=0.001，圖1A)。與對照組(0.99±0.10)相比，5 μmol/L Aβ25-35作用PC12細胞24、48、72 h后，lncRNA NEAT1相對表達水平隨著時間延長而降低(依次為0.49±0.05、0.27±0.05、0.18±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(F=109.42，P=0.002，圖1B)。根據(jù)圖1A的結(jié)果，20 μmol/L Aβ25-35處理24 h后，lncRNA NEAT1的表達最低，建模效果最好。因此，選擇20 μmol/L Aβ25-35進行后續(xù)實驗。

圖1 Aβ25-35誘導的PC12細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1相對表達水平Fig.1 Relative expression level of lncRNA NEAT1 in PC12 cells induced by Aβ25-35

2.2 lncRNA NEAT1載體構(gòu)建效果 qRT-PCR檢測結(jié)果如圖2所示，與對照組(0.93±0.09)相比，空載體組(0.54±0.12)與si-NC組(0.52±0.09)lncRNA NEAT1相對表達水平明顯降低(P=0.008，P=0.001)；與空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組lncRNA NEAT1相對表達水平增高(2.21±0.16，P=0.001)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組lncRNA NEAT1相對表達水平降低(0.23±0.02，P=0.000)，表明lncRNA NEAT1的過表達和敲降載體構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實驗。

圖2 lncRNA NEAT1載體構(gòu)建效果(qRT-PCR)Fig.2 Construction effect of lncRNA NEAT1 vector detected by qRT-PCR

2.3 lncRNA NEAT1對AD模型細胞活力的影響CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組(116.33%±5.51%)相比，Aβ25-35刺激后，空載體組(53.85%±5.57%)與si-NC組(55.18%±8.50%)細胞增殖率明顯降低(P=0.000，P=0.000)；與空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組細胞增殖率明顯增高(142.85%±5.00%，P=0.013)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組細胞增殖率明顯降低(21.18%±4.93%，P=0.003，圖3)。

圖3 lncRNA NEAT1對AD模型細胞活力的影響Fig.3 Effect of lncRNA NEAT1 on cell viability of AD model cells

2.4 lncRNA NEAT1對AD模型細胞凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組(4.50%±0.10%)相比，Aβ25-35刺激后，空載體組(8.10%±0.10%)與si-NC組(7.40%±0.26%)細胞凋亡率明顯升高(P=0.001，P=0.001)；與空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組細胞凋亡率降低(5.07%±0.15%，P=0.012)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組細胞凋亡率明顯升高(14.70%±0.20%，P=0.000，圖4)。

圖4 lncRNA NEAT1對AD模型細胞凋亡的影響Fig.4 Effect of lncRNA NEAT1 on apoptosis of AD model cells

2.5 lncRNA NEAT1對AD模型細胞周期的影響流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組(G1期：60.15%±1.00%；G2期：6.56%±0.95%)相比，Aβ25-35刺激后，空載體組(G1期：61.81%±1.53%；G2期：9.81%±1.53%)與si-NC組(G1期：60.15%±4.58%；G2期：10.70%±0.73%)G1和G2期細胞比例差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；與對照組和空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組G1期(52.15%±1.00%)細胞比例明顯降低(P=0.001，P=0.003)，G2期(21.15%±1.00%)細胞比例明顯升高(P=0.000，P=0.001)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組G1期(68.81%±1.53%)細胞比例明顯升高(P=0.012)，G2期(5.48%±1.53%)細胞比例明顯降低(P=0.021，圖5)。

圖5 lncRNA NEAT1對AD模型細胞周期的影響Fig.5 Effect of lncRNA NEAT1 on cell cycle of AD model cells

2.6 lncRNA NEAT1對AD模型細胞上清中炎性因子水平的影響 ELISA檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ25-35刺激后，空載體組和si-NC組細胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05)；與空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組細胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯降低(P＜0.05)；與si-NC組相比，敲降lncRNA NEAT1組細胞上清中IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α水平明顯升高(P＜0.05，表1)。

表1 lncRNA NEAT1對AD模型細胞上清中炎性因子水平的影響(pg/ml，，n=3)Tab.1 Effect of lncRNA NEAT1 on the inflammatory factor levels of AD model cells (pg/ml, , n=3)

表1 lncRNA NEAT1對AD模型細胞上清中炎性因子水平的影響(pg/ml，，n=3)Tab.1 Effect of lncRNA NEAT1 on the inflammatory factor levels of AD model cells (pg/ml, , n=3)

AD. 阿爾茨海默?。籌L. 白細胞介素；TNF-α. 腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，(1)P＜0.05；與空載體組比較，(2)P＜0.05；與si-NC組比較，(3)P＜0.05。

組別 IL-1β IL-6 IL-18 TNF-α對照組 42.45±1.98 14.54±0.68 54.76±2.11 213.59±11.58空載體組 117.19±4.97(1) 83.91±4.87(1) 187.61±5.64(1) 529.67±22.30(1)過表達lncRNA NEAT1組 76.23±5.78(2) 60.31±4.45(2) 127.45±5.71(2) 342.33±9.29(2)si-NC組 117.00±5.57(1) 85.00±3.00(1) 182.67±6.81(1) 550.00±39.36(1)敲降lncRNA NEAT1組 159.67±15.50(3) 118.33±7.64(3) 215.00±5.00(3) 734.67±20.53(3)

2.7 lncRNA NEAT1對AD模型細胞中PI3K/Akt信號通路活性的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ25-35刺激后，空載體組信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-Akt相對表達水平明顯下降(p-PI3K：0.15±0.02vs. 1.02±0.05，P=0.005；p-Akt：0.11±0.04vs. 0.95±0.07，P=0.000)；與空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組(p-PI3K：0.86±0.05；p-Akt：0.86±0.06)信號通路相關(guān)蛋白p-PI3K、p-Akt相對表達水平明顯增高(P=0.003，P=0.000，圖6)。

圖6 lncRNA NEAT1對AD模型細胞中PI3K/Akt信號通路活性的影響Fig.6 Effect of lncRNA NEAT1 on the PI3K/Akt signaling pathway activity of AD model cells

2.8 通路抑制劑LY294002對AD模型細胞凋亡的影響 為了證實PI3K/Akt通路與AD模型細胞凋亡的關(guān)系，向Aβ25-35處理的PC12細胞中分別加入pcDNA3.1-lncRNA NEAT1與pcDNA3.1-lncRNA NEAT1+LY294002，使用流式細胞術(shù)檢測AD模型細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，Aβ25-35刺激后，空載體組細胞凋亡率明顯升高(8.20%±0.26%vs. 4.4%±0.21%，P=0.002)；與空載體組相比，過表達lncRNA NEAT1組細胞凋亡率明顯降低(5.13%±0.21%，P=0.011)；與過表達lncRNA NEAT1組相比，過表達lncRNA NEAT1+LY294002組細胞凋亡率明顯升高(9.00%±0.10%，P=0.004，圖7)。

圖7 PI3K/Akt通路抑制劑LY294002對AD模型細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of PI3K/Akt pathway inhibitor LY294002 on apoptosis of AD model cells

3 討 論

AD是一種不可逆的進行性、持續(xù)性神經(jīng)退行性疾病，影響大腦皮質(zhì)和海馬的廣泛區(qū)域，也是最常見的癡呆類型(60%～80%)[8]。Aβ過量產(chǎn)生被認為是AD患者突觸和神經(jīng)元丟失的主要原因。AD的病因非常復雜，目前其分子病理機制尚不清楚[9]。為此，本研究建立了體外神經(jīng)細胞損傷模型，為lncRNA NEAT1抑制Aβ25-35誘導的PC12細胞神經(jīng)毒性提供了理論依據(jù)。

lncRNA NEAT1的表達變化與疾病進展密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，其可通過上調(diào)成纖維細胞生長因子(FGF9)而促進卵巢癌細胞(OC)增殖和人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)的血管生成[10]。lncRNA NEAT1與細胞凋亡也密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，敲除lncRNA NEAT1可顯著抑制肝癌細胞的活力，促進細胞凋亡，并抑制細胞的遷移和侵襲[11]；在膿毒癥誘導的急性肺損傷(ALI)中，過表達lncRNA NEAT1可促進WI-38細胞凋亡[12]。此外，敲低lncRNA NEAT1可減輕腦缺血再灌注損傷引起的細胞凋亡[13]；下調(diào)lncRNA NEAT1可抑制表皮生長因子受體(EGFR)的表達，促進肝癌細胞凋亡[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1在Aβ25-35刺激后的PC12細胞中呈低表達，且過表達lncRNA NEAT1后，AD模型細胞凋亡率明顯降低，而敲降lncRNA NEAT1的表達時，AD模型細胞凋亡率升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，沉默lncRNA NEAT1可導致視網(wǎng)膜母細胞瘤(RB)細胞周期發(fā)生停滯，阻止視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達lncRNA NEAT1可促進AD模型細胞由G1期快速進入G2期，激發(fā)了細胞周期的進展；而敲降lncRNA NEAT1時，G1期細胞比例明顯高于對照組，G2期細胞比例明顯降低，表明敲降lncRNA NEAT1可使更多的AD模型細胞停留在G1期，阻止細胞進入G2期，造成了細胞周期的停滯。

已知lncRNA NEAT1可調(diào)控AD細胞的增殖和凋亡，但其具體作用機制尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，在HeLa細胞中，敲降lncRNA NEAT1會抑制p-Akt、p-PI3K的表達[16]。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA NEAT1可通過影響miR-211/PI3K/Akt軸調(diào)節(jié)膿毒癥的炎癥反應(yīng)[17]。由此可見，在疾病發(fā)展過程中，lncRNA NEAT1與PI3K/Akt信號通路密切相關(guān)。為了進一步驗證lncRNA NEAT1對AD模型細胞凋亡的調(diào)控機制，本研究將lncRNA NEAT1進行高表達處理，利用Western blotting檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1過表達可增加AD模型細胞中p-PI3K、p-Akt的表達，抑制Aβ25-35誘導的細胞凋亡，而加入PI3K通路抑制劑后則可逆轉(zhuǎn)上述效果，證實lncRNA NEAT1可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路的活性而影響AD模型細胞的凋亡。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，Aβ25-35刺激后，PC12細胞中l(wèi)ncRNA NEAT1的表達明顯降低；而過表達lncRNA NEAT1可明顯抑制Aβ25-35誘導的細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，lncRNA NEAT1可能通過激活PI3K/Akt信號通路而激活AD模型細胞的炎癥反應(yīng)，促進AD的進展。但該結(jié)論未在動物體內(nèi)進行驗證，后續(xù)將建立AD小鼠模型，以進一步探索lncRNA NEAT1對AD發(fā)生發(fā)展的影響。