中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會(huì)眼科專業(yè)委員會(huì)眼科檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)組，中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)眼科疾病實(shí)驗(yàn)診斷專家委員會(huì)

病毒是常見的引起眼內(nèi)感染的病原體之一。目前，已知能夠引起眼內(nèi)感染的病毒包括皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、西尼羅病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒及登革熱病毒等[1]。病毒感染可引起眼前段炎癥，如角膜內(nèi)皮炎、前葡萄膜炎、青光眼睫狀體炎綜合征及Fuchs葡萄膜炎綜合征等[2]。有研究顯示，約67%對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不敏感的前葡萄膜炎由病毒感染所致[3]。病毒感染同樣能引起后葡萄膜炎，包括壞死性視網(wǎng)膜炎及非壞死性視網(wǎng)膜炎，前者又包括急性視網(wǎng)膜壞死、巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎及進(jìn)行性外層視網(wǎng)膜壞死[1]等。文獻(xiàn)報(bào)道，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)眼內(nèi)液皰疹病毒的靈敏度為80.9%～98.8%，特異度為97.4%～100.0%[4-8]。采集疑診為病毒性葡萄膜炎患者的眼內(nèi)液進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)已成為明確病因及確定后續(xù)治療方案的重要手段[4,9-14]。

目前，多種檢測(cè)方法已成功應(yīng)用于眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)，包括熒光定量PCR、Southern印跡雜交、多重PCR和下一代測(cè)序(next-generation sequencing，NGS)等。Kashiwagi等[15]利用Southern印跡雜交技術(shù)在HIV陽(yáng)性患者的房水及視網(wǎng)膜下液中均檢出HIV病毒。多重PCR可用于多種病原體的同時(shí)檢測(cè)以及某些病原微生物、遺傳病及癌基因的分型鑒定，該檢測(cè)方法對(duì)眼內(nèi)病原體感染的檢測(cè)敏感性達(dá)98.8%，特異性達(dá)98.5%[8]。NGS技術(shù)通過(guò)對(duì)臨床標(biāo)本中上萬(wàn)甚至上億條序列的讀取來(lái)檢測(cè)標(biāo)本中含有的病毒，不僅能檢測(cè)到未知的新病毒，還能檢測(cè)病毒基因組的變異及對(duì)抗病毒藥物的抗藥性[16]。該技術(shù)與傳統(tǒng)PCR對(duì)眼內(nèi)病原體感染的檢測(cè)符合率為87%[17]。Ai等[18]通過(guò)NGS在1例因直接接觸豬的污染物而導(dǎo)致眼內(nèi)炎的女性患者中檢出假狂犬病病毒。但迄今為止，熒光定量PCR仍然是國(guó)內(nèi)針對(duì)眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)應(yīng)用最廣泛的技術(shù)手段。

為了建立一套標(biāo)準(zhǔn)化的眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)流程及臨床應(yīng)用規(guī)范，以提供穩(wěn)定、可靠、有效的檢測(cè)數(shù)據(jù)，促進(jìn)眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)的規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化，助力眼內(nèi)病毒性感染相關(guān)疾病的精準(zhǔn)診斷，中國(guó)醫(yī)學(xué)裝備協(xié)會(huì)眼科專業(yè)委員會(huì)眼科檢驗(yàn)檢測(cè)學(xué)組與中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會(huì)眼科疾病實(shí)驗(yàn)診斷專家委員會(huì)組織相關(guān)專家進(jìn)行討論，以熒光定量PCR方法為基礎(chǔ)，對(duì)眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)流程及其臨床應(yīng)用規(guī)范達(dá)成共識(shí)如下。

1 眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)標(biāo)準(zhǔn)

當(dāng)前醫(yī)療行業(yè)已經(jīng)邁入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代，精準(zhǔn)檢測(cè)作為精準(zhǔn)醫(yī)療的一部分受到業(yè)界越來(lái)越多的關(guān)注。隨著分子生物技術(shù)的進(jìn)步，作為眼科精準(zhǔn)檢測(cè)內(nèi)容之一的眼內(nèi)液檢測(cè)也取得了長(zhǎng)足發(fā)展。目前，國(guó)內(nèi)不少實(shí)驗(yàn)室均可開展科研層面上的眼內(nèi)液檢測(cè)，但涉及臨床診療層面的眼內(nèi)液檢測(cè)，必須在有資質(zhì)開展核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，并對(duì)檢測(cè)項(xiàng)目進(jìn)行備案。

眼內(nèi)液的檢測(cè)須建立嚴(yán)格的管理制度、標(biāo)準(zhǔn)化的操作程序及質(zhì)量管理體系，這是確保眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室生物安全及檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確的前提。眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置與運(yùn)行應(yīng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2006]73號(hào))及修正內(nèi)容(國(guó)衛(wèi)辦醫(yī)函[2020]560號(hào))的要求；工作制度及標(biāo)準(zhǔn)操作程序應(yīng)符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489-2008)；工作原則及注意事項(xiàng)應(yīng)符合《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理辦法》(衛(wèi)辦醫(yī)政發(fā)[2010]194號(hào))。實(shí)驗(yàn)室防護(hù)級(jí)別應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室要求，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)分區(qū)穿戴工作服、一次性醫(yī)用口罩、醫(yī)用帽子及單層手套(必要時(shí)需穿戴雙層手套)。病毒核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)置以下幾個(gè)區(qū)域：試劑貯存及準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)，必要時(shí)增加標(biāo)本接收與預(yù)處理區(qū)，以及報(bào)告發(fā)放區(qū)。如使用自動(dòng)分析儀(擴(kuò)增產(chǎn)物閉管檢測(cè))，可將擴(kuò)增區(qū)與擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)合并。具體實(shí)驗(yàn)室分區(qū)應(yīng)依據(jù)所使用的技術(shù)平臺(tái)、檢驗(yàn)項(xiàng)目及工作量而定。上述各個(gè)區(qū)域必須設(shè)置成獨(dú)立空間且單一流向，做到氣流、人流、物流不交叉，以防止在核酸提取及擴(kuò)增等過(guò)程中發(fā)生污染[19]。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)人員應(yīng)具備相關(guān)專業(yè)大專以上學(xué)歷，并有2年以上的實(shí)驗(yàn)室工作經(jīng)驗(yàn)及基因檢驗(yàn)相關(guān)培訓(xùn)合格證書；實(shí)驗(yàn)室配備的工作人員應(yīng)當(dāng)與所開展檢測(cè)項(xiàng)目及標(biāo)本量相適宜，以保證及時(shí)、精準(zhǔn)地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及報(bào)告解讀，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)流程

眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括眼內(nèi)液標(biāo)本采集、標(biāo)本處理、核酸提取、上機(jī)檢測(cè)等4個(gè)步驟。其中，眼內(nèi)液標(biāo)本采集過(guò)程由送檢醫(yī)師完成，標(biāo)本處理由送檢醫(yī)師與實(shí)驗(yàn)室共同完成，核酸提取及上機(jī)檢測(cè)在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

2.1 眼內(nèi)液標(biāo)本采集 眼內(nèi)液是眼球內(nèi)液體的統(tǒng)稱，主要包括房水及玻璃體液；有些病理狀態(tài)下還可出現(xiàn)視網(wǎng)膜下液及脈絡(luò)膜上腔積液。目前用于病毒核酸檢測(cè)的眼內(nèi)液標(biāo)本主要包括房水及玻璃體液。規(guī)范地采集眼內(nèi)液標(biāo)本是確保眼內(nèi)液檢測(cè)結(jié)果可靠性的基礎(chǔ)，同時(shí)也能夠有效地避免發(fā)生醫(yī)源性損傷及醫(yī)患糾紛。在標(biāo)本采集前，應(yīng)向患者或其監(jiān)護(hù)人介紹檢測(cè)知情同意書的內(nèi)容條款，在患者或監(jiān)護(hù)人理解并且接受的前提下指導(dǎo)其簽署知情同意書；同時(shí)評(píng)估是否存在操作禁忌證，如眼表活動(dòng)性感染、前房極淺等。在標(biāo)本采集完成后，應(yīng)由標(biāo)本采集人員填寫檢測(cè)申請(qǐng)單，并核對(duì)申請(qǐng)單上的患者基本信息、檢測(cè)項(xiàng)目是否與實(shí)際一致，確認(rèn)無(wú)誤后將申請(qǐng)單及所采集的眼內(nèi)液標(biāo)本置于標(biāo)本袋，并共同轉(zhuǎn)運(yùn)至檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室；若檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室具備完善的信息登記系統(tǒng)，也可通過(guò)該系統(tǒng)直接發(fā)送標(biāo)本信息。

2.1.1 眼內(nèi)液采集的適應(yīng)證及時(shí)機(jī) 臨床醫(yī)師應(yīng)把握眼內(nèi)液采集的適應(yīng)證。眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)應(yīng)針對(duì)臨床疑診為活動(dòng)性眼內(nèi)病毒感染的患者。病毒性前葡萄膜炎的臨床特征包括單眼發(fā)病(多數(shù)情況下)、易復(fù)發(fā)、發(fā)病時(shí)常眼內(nèi)壓升高及眼后節(jié)正常。眼科檢查可發(fā)現(xiàn)角膜從上皮至內(nèi)皮的各種損害、角膜后羊脂狀或色素性沉著物(keratic precipitates，Kp)及虹膜節(jié)段性或彌漫性萎縮[20]。急性視網(wǎng)膜壞死的臨床特征包括眼內(nèi)壓升高、前房浮游細(xì)胞或羊脂狀Kp、玻璃體炎性混濁、周邊視網(wǎng)膜隨病程進(jìn)展逐漸融合的白色病灶、視網(wǎng)膜動(dòng)脈炎及視盤充血[13]。巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎及進(jìn)行性外層視網(wǎng)膜壞死的共同特點(diǎn)是好發(fā)于免疫功能低下的患者；前者發(fā)病時(shí)可見前房、玻璃體的輕微炎癥，視網(wǎng)膜病灶可表現(xiàn)為黃白色壞死夾雜紅色出血、顆粒樣病變或霜樣視網(wǎng)膜血管炎[21]；后者的臨床特征表現(xiàn)為進(jìn)展迅速的視網(wǎng)膜外層壞死。表1羅列了眼科常見的病毒性葡萄膜炎及其臨床表現(xiàn)，可幫助臨床醫(yī)師有效把控眼內(nèi)液采集的適應(yīng)證。臨床醫(yī)師應(yīng)根據(jù)患者的病史、其他器官病毒感染情況以及眼部體征綜合判斷患者是否存在眼內(nèi)活動(dòng)性病毒感染的可能。對(duì)疑似病例進(jìn)行眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)有助于明確診斷，避免因漏診、誤診造成角膜內(nèi)皮失代償、視網(wǎng)膜脫離、視神經(jīng)萎縮等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。一般情況下，對(duì)疑似活動(dòng)性眼內(nèi)病毒感染的患者，采集前房水即能滿足病毒核酸檢測(cè)的需要；患者存在玻璃體手術(shù)指征，如合并玻璃體積血或視網(wǎng)膜脫離時(shí)，也可直接在手術(shù)時(shí)采集玻璃體原液送檢。同時(shí)，合適的眼內(nèi)液采集時(shí)機(jī)對(duì)檢測(cè)結(jié)果也非常重要，建議在眼內(nèi)炎癥急性發(fā)作期進(jìn)行采集，避免因采集時(shí)間延后造成眼內(nèi)液病毒核酸轉(zhuǎn)陰，從而導(dǎo)致臨床誤診。

表1 眼科常見的病毒性葡萄膜炎及其臨床表現(xiàn)Tab.1 Clinical manifestations of the common viral uveitis of ophthalmology

2.1.2 眼內(nèi)液采集前的感染預(yù)防措施 在采集眼內(nèi)液前，應(yīng)預(yù)防性地給予局部抗菌藥物；如擇期進(jìn)行眼內(nèi)液采集，應(yīng)對(duì)患眼使用含有抗菌藥物的滴眼液(如妥布霉素滴眼液、氧氟沙星滴眼液等)進(jìn)行點(diǎn)眼，每天4～6次，持續(xù)3 d；如當(dāng)天進(jìn)行眼內(nèi)液采集，可頻繁點(diǎn)眼6～8次[22]。前房水采集可在眼科專用治療室或手術(shù)室內(nèi)進(jìn)行，玻璃體液采集需在手術(shù)室內(nèi)進(jìn)行。若在治療室內(nèi)進(jìn)行采集操作，房間須經(jīng)紫外線消毒至少30 min，應(yīng)注意房間消毒期間關(guān)閉門窗；若在手術(shù)室內(nèi)進(jìn)行采集操作，應(yīng)按照手術(shù)室要求進(jìn)行日常消毒。負(fù)責(zé)眼內(nèi)液采集的操作人員應(yīng)使用消毒液消毒手部，戴無(wú)菌手套及手術(shù)帽。在采集眼內(nèi)液前，應(yīng)對(duì)患者眼周皮膚進(jìn)行消毒；在治療室內(nèi)操作，建議使用含有抗菌藥物的滴眼液沖洗患者結(jié)膜囊；在手術(shù)室內(nèi)操作，建議使用5%聚維酮碘沖洗患者結(jié)膜囊，并按照眼科手術(shù)要求進(jìn)行鋪巾、貼膜、開瞼器撐開眼瞼。

2.1.3 前房水采集 根據(jù)醫(yī)院要求及患者配合情況，可采用平躺位或于裂隙燈顯微鏡下坐位采集患者的前房水標(biāo)本。建議在自然瞳孔大小狀態(tài)下，選用25 G注射針頭(相當(dāng)于1 ml注射器)或針尖更細(xì)的注射針頭進(jìn)行前房穿刺以采集前房水。表面麻醉后，從透明角膜緣穿刺，針尖朝向偏離瞳孔區(qū)，針尖斜面朝向角膜內(nèi)皮面(如5:00時(shí)鐘位進(jìn)針，針尖朝向7:00時(shí)鐘位穿刺)。針頭在角膜層間最好穿行約1 mm后進(jìn)入前房，以盡量避免誤傷晶狀體，同時(shí)提高穿刺口自閉性；針尖進(jìn)入前房后，囑患者勿移動(dòng)眼球，向外緩緩拉動(dòng)注射器活塞，抽出0.05～0.1 ml前房水后拔出針尖[23]；也可在穿刺前事先將注射器活塞拔出，在針尖進(jìn)入前房的同時(shí)使用棉簽輕壓眼球，靠眼內(nèi)壓的作用將房水壓出至針管內(nèi)，以避免拉動(dòng)活塞抽液操作的不穩(wěn)定，從而降低誤傷虹膜甚至晶體的可能。

2.1.4 玻璃體液采集 玻璃體液標(biāo)本的采集需采用微創(chuàng)玻璃體切割手術(shù)進(jìn)行，在不具備微創(chuàng)玻璃體切割手術(shù)條件時(shí)，可采用傳統(tǒng)20 G玻璃體切割系統(tǒng)進(jìn)行采集。若判斷玻璃體液化明顯，可行玻璃體抽液術(shù)獲取玻璃體液標(biāo)本，該技術(shù)適用于60歲以上的患者。常規(guī)穿刺距角膜緣距離為3.5 mm，無(wú)晶體眼為3 mm，高度近視眼為4 mm，嬰兒依據(jù)月齡而定。穿刺前，應(yīng)仔細(xì)檢查周邊眼底(尤其是存在周邊增殖的患者，如眼弓蛔蟲病)；必要時(shí)，可結(jié)合超聲生物顯微鏡檢查結(jié)果，避開增殖明顯的部位。

2.1.4.1 玻璃體抽液術(shù) 建議在散大瞳孔狀態(tài)下進(jìn)行?；颊咂教?，注視前方，眼球局部麻醉后選用23 G(相當(dāng)于2 ml注射器)的針頭經(jīng)鞏膜斜行穿刺后垂直進(jìn)針，約1/2針頭長(zhǎng)度(12.5 mm)進(jìn)入玻璃體腔后，在顯微鏡下見針頭位置后向外抽動(dòng)注射器活塞，抽出0.3 ml玻璃體液即可拔出針頭。如玻璃體液不能順利抽出，可嘗試旋轉(zhuǎn)針頭方向，或輕度改變針頭角度及前后位置。

2.1.4.2 玻璃體切割術(shù) 盡量選用27 G、25 G、23 G等微創(chuàng)玻璃體切割手術(shù)系統(tǒng)。眼球局部麻醉后經(jīng)鞏膜斜行穿刺后垂直進(jìn)針，分別置入灌注及玻璃體切割套管。完成玻璃體原液取材前保持灌注關(guān)閉，確保沒(méi)有灌注液進(jìn)入玻璃體腔；在確保玻璃體切割器的管道內(nèi)沒(méi)有液體的情況下，旋開玻璃體切割器的管道螺旋帽，接上1 ml或2 ml注射器針管，將切割頻率設(shè)置在2500次/min以上，玻璃體切割頭置于玻璃體混濁明顯處或視網(wǎng)膜病灶附近，踩動(dòng)腳踏板，緩緩向外抽動(dòng)注射器活塞，吸出0.3～0.5 ml玻璃體液即可。退出玻璃體切割器，打開灌注恢復(fù)眼壓，用注射器抽出切割器管道內(nèi)剩余標(biāo)本，采集完成后拔出套管，仔細(xì)檢查有無(wú)滲漏[23]；也可只做1個(gè)穿刺口，在吸出標(biāo)本后再插入灌注管恢復(fù)眼壓。在抽動(dòng)注射器活塞的過(guò)程中應(yīng)緩慢均勻，避免吸力過(guò)大牽拉視網(wǎng)膜導(dǎo)致裂孔形成。

2.1.5 眼內(nèi)液采集后的感染預(yù)防措施 眼內(nèi)液采集完畢后，應(yīng)在結(jié)膜囊內(nèi)使用含有抗菌藥物的眼膏(如妥布霉素地塞米松眼膏、氧氟沙星眼膏等)，并使用眼墊包扎。于次日打開眼墊后檢查有無(wú)眼紅、眼痛加劇等醫(yī)源性感染征象，并使用含有抗菌藥物的滴眼液點(diǎn)眼，每天4～6次，持續(xù)3 d。避免污水、污物等入眼。

2.2 眼內(nèi)液標(biāo)本處理

2.2.1 醫(yī)師端處理 眼內(nèi)液從前房或玻璃體腔中取出后，為避免背景污染及核酸降解等，應(yīng)立即從針管注入無(wú)菌無(wú)酶可密封容器內(nèi)。對(duì)于脫氧核糖核酸(DNA)病毒(如皰疹病毒)的檢測(cè)，若運(yùn)輸時(shí)間不超過(guò)72 h，可常溫運(yùn)輸標(biāo)本；若運(yùn)輸時(shí)間超過(guò)72 h，則需通過(guò)4 ℃以下冷鏈運(yùn)輸標(biāo)本；若不能立即送檢，計(jì)劃在30 d以內(nèi)送檢的標(biāo)本可置于-20 ℃環(huán)境下無(wú)菌保存，30 d以上送檢的標(biāo)本置于-80 ℃環(huán)境下無(wú)菌保存。長(zhǎng)時(shí)間低溫保存對(duì)DNA病毒核酸檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率無(wú)明顯影響，標(biāo)本應(yīng)避免反復(fù)凍融。而對(duì)于核糖核酸(RNA)病毒(如HIV、西尼羅病毒、登格病毒、風(fēng)疹病毒、麻疹病毒等)的檢測(cè)，標(biāo)本需通過(guò)4 ℃以下冷鏈運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，并在48 h內(nèi)完成RNA的提取[24]；如預(yù)計(jì)運(yùn)輸時(shí)間較長(zhǎng)，可按比例添加核糖核酸酶(RNase)抑制劑，以減少標(biāo)本RNA降解，并盡快送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)室端的接收與保存 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本接收人員負(fù)責(zé)審核送檢標(biāo)本量及標(biāo)本類型是否符合檢測(cè)要求，以及申請(qǐng)單上患者信息與檢測(cè)項(xiàng)目是否清晰可溯源。若出現(xiàn)眼內(nèi)液標(biāo)本量不足、保存條件不符合要求、標(biāo)本類型與申請(qǐng)單填寫信息不符、申請(qǐng)單填寫不清晰或無(wú)申請(qǐng)單等情況，則判定該標(biāo)本為不合格。對(duì)于不合格標(biāo)本，若眼內(nèi)液標(biāo)本量不足或標(biāo)本保存條件不符合要求，則通知送檢醫(yī)師重新取樣；如無(wú)法完成重新采樣，但又有檢測(cè)需求，需在報(bào)告單上注明，如標(biāo)本量少、對(duì)結(jié)果產(chǎn)生的影響等信息；若申請(qǐng)單填寫不清晰或無(wú)申請(qǐng)單，則由檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)系送檢醫(yī)師確認(rèn)申請(qǐng)單內(nèi)容。拒收不合格標(biāo)本時(shí)，應(yīng)填寫標(biāo)本拒收登記表。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后的標(biāo)本，若有剩余可保存以備日后復(fù)檢或科研用途。若預(yù)計(jì)保存時(shí)間在1周之內(nèi)，考慮到反復(fù)凍融對(duì)蛋白樣品的破壞，建議于4 ℃冰箱內(nèi)保存；若預(yù)計(jì)保存時(shí)間在1個(gè)月以內(nèi)，可于-20 ℃冰箱內(nèi)保存；若預(yù)計(jì)保存時(shí)間在1個(gè)月以上，可于-80 ℃冰箱內(nèi)或液氮罐內(nèi)保存。

2.3 病毒核酸提取與熒光定量PCR擴(kuò)增 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇國(guó)家藥品監(jiān)督管理局(National Medical Products Administration，NMPA)批準(zhǔn)的試劑，試劑中標(biāo)稱的標(biāo)本類型應(yīng)包含眼內(nèi)液標(biāo)本。依據(jù)試劑說(shuō)明書形成標(biāo)準(zhǔn)操作程序(standard operating procedure，SOP)，相關(guān)處理步驟均應(yīng)嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行操作。在用于臨床檢測(cè)前，應(yīng)對(duì)試劑及設(shè)備的分析性能進(jìn)行驗(yàn)證，形成性能驗(yàn)證報(bào)告。定量項(xiàng)目的性能驗(yàn)證應(yīng)包括但不限于精密度、正確度、線性、測(cè)量和(或)可報(bào)告范圍、抗干擾能力等[25]。

如果NMPA批準(zhǔn)的試劑檢測(cè)標(biāo)本類型中不包含眼內(nèi)液，則改變商品試劑的預(yù)期用途，在用于臨床檢測(cè)前，應(yīng)針對(duì)改變的標(biāo)本類型等進(jìn)行性能確認(rèn)，形成性能確認(rèn)報(bào)告[26-27]。經(jīng)過(guò)性能確認(rèn)的方法形成SOP，在臨床檢驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格按照SOP進(jìn)行。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果解讀 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用熒光定量PCR系統(tǒng)軟件分析結(jié)果，包括標(biāo)準(zhǔn)曲線、基線、陰性及陽(yáng)性質(zhì)控品等，以確定當(dāng)日結(jié)果是否有效。所有分析參數(shù)及質(zhì)控品均“在控”時(shí)，本批次結(jié)果才有效，保存好各種操作及原始記錄，并將最終結(jié)果錄入檢驗(yàn)報(bào)告發(fā)放系統(tǒng)，經(jīng)雙人審核后方可發(fā)放檢驗(yàn)報(bào)告。

熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的報(bào)告方式：高于檢測(cè)下限的，結(jié)果報(bào)告為定量值；未檢出的，結(jié)果報(bào)告為小于檢測(cè)下限；有檢測(cè)值但該值低于檢測(cè)下限的，結(jié)果報(bào)告為小于檢測(cè)下限，但臨床備注提示有病毒檢出。

報(bào)告內(nèi)容如下：(1)患者基本信息，如患者姓名、性別、年齡、臨床信息等；(2)標(biāo)本信息，如標(biāo)本類型、采集時(shí)間、送檢時(shí)間、報(bào)告時(shí)間、唯一編號(hào)等；(3)結(jié)果信息，如檢測(cè)方法、結(jié)果單位、參考區(qū)間、檢測(cè)下限等；(4)實(shí)驗(yàn)室信息，如實(shí)驗(yàn)室名稱、聯(lián)系方式、檢測(cè)者、報(bào)告審核者等；(5)檢測(cè)方法的局限性說(shuō)明。

3 實(shí)驗(yàn)室病毒核酸檢測(cè)流程質(zhì)量控制[28]

3.1 分析前質(zhì)量控制 病毒核酸檢測(cè)試劑及檢測(cè)設(shè)備的質(zhì)量對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性有直接影響，因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立試劑及關(guān)鍵耗材(如離心管、帶濾芯的吸頭)的驗(yàn)收程序，相應(yīng)程序中應(yīng)有明確的判斷符合性的方法及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。應(yīng)該選用待檢標(biāo)本類型包括眼內(nèi)液的試劑，如果試劑適用的標(biāo)本類型不包括眼內(nèi)液，則應(yīng)進(jìn)行性能確認(rèn)。在開展臨床核酸檢測(cè)前，應(yīng)對(duì)檢測(cè)試劑及設(shè)備進(jìn)行性能驗(yàn)證。對(duì)于不同批號(hào)、不同批次運(yùn)輸或更換不同廠家試劑時(shí)，應(yīng)對(duì)其外包裝、運(yùn)輸條件及存放條件進(jìn)行監(jiān)控，同時(shí)采用實(shí)驗(yàn)比對(duì)的方法對(duì)更換的試劑性能進(jìn)行評(píng)價(jià)(如留樣再測(cè)等)，只有當(dāng)比對(duì)結(jié)果可接受時(shí)方能用于臨床檢測(cè)。在進(jìn)行樣本前處理時(shí)，應(yīng)在生物安全柜中規(guī)范操作，避免樣本污染。

熒光定量PCR檢測(cè)的性能驗(yàn)證內(nèi)容至少應(yīng)包括精密度、正確度、線性、測(cè)量和(或)可報(bào)告范圍、抗干擾能力等。檢測(cè)使用的關(guān)鍵設(shè)備應(yīng)定期進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，進(jìn)行年度檢定/校準(zhǔn)，包括擴(kuò)增儀的溫控系統(tǒng)及光學(xué)系統(tǒng)、生物安全柜、超凈工作臺(tái)、加樣器、離心機(jī)、恒溫金屬浴等。

3.2 分析中質(zhì)量控制 工作人員在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)要嚴(yán)格按照PCR檢測(cè)SOP進(jìn)行。每批次實(shí)驗(yàn)均應(yīng)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，包括核酸提取及擴(kuò)增在內(nèi)的整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均應(yīng)包含室內(nèi)質(zhì)控品。定量項(xiàng)目每批次應(yīng)包括3個(gè)水平的室內(nèi)質(zhì)控：陰性、弱陽(yáng)性及陽(yáng)性[25]。質(zhì)控物可以商業(yè)購(gòu)買，亦可實(shí)驗(yàn)室自制。自制室內(nèi)質(zhì)控物應(yīng)對(duì)其均一性及穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證、評(píng)價(jià)和記錄。

試劑規(guī)定的一些分析參數(shù)必須在有效范圍內(nèi)，本次實(shí)驗(yàn)方為有效，如某些試劑規(guī)定，病毒核酸陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線不成S型或Ct值為UNDET(低于檢測(cè)下限)；陽(yáng)性對(duì)照品有S型擴(kuò)增曲線，Ct值在試劑規(guī)定范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)≤0.98，以上要求需在同一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)滿足，否則實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。

當(dāng)檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性失控時(shí)，應(yīng)停止本批次報(bào)告發(fā)放，立即查找原因。出現(xiàn)假陰性結(jié)果的主要原因包括：(1)眼內(nèi)液標(biāo)本中含有病毒核酸，但其含量低于最低檢測(cè)限時(shí)可能無(wú)法檢測(cè)到，表現(xiàn)為陰性的結(jié)果；(2)標(biāo)本采集、保存不規(guī)范，核酸降解等；(3)反應(yīng)體系或標(biāo)本容器中有擴(kuò)增抑制物；(4)實(shí)驗(yàn)室操作不規(guī)范；(5)引物設(shè)計(jì)位點(diǎn)發(fā)生基因突變等。出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果的主要原因包括：(1)試劑本身存在非特異反應(yīng)；(2)實(shí)驗(yàn)室污染，包括標(biāo)本交叉污染、陽(yáng)性質(zhì)控污染、產(chǎn)物污染等，或因操作不當(dāng)所致。找到失控原因并采取糾正措施后應(yīng)對(duì)本批次標(biāo)本進(jìn)行復(fù)測(cè)，質(zhì)控均在控時(shí)方可發(fā)放檢驗(yàn)報(bào)告；同時(shí)對(duì)失控過(guò)程、原因及糾正措施進(jìn)行記錄存檔。

3.3 分析后質(zhì)量控制 原始記錄是實(shí)驗(yàn)室出具檢測(cè)報(bào)告的基本依據(jù)，也是溯源資料。因此，每次檢測(cè)均應(yīng)對(duì)眼內(nèi)液標(biāo)本的名稱與編號(hào)、使用儀器設(shè)備的名稱與編號(hào)、檢測(cè)日期、檢測(cè)方法、檢測(cè)用試劑、檢測(cè)結(jié)果、檢測(cè)時(shí)的環(huán)境條件及檢測(cè)人員信息進(jìn)行詳細(xì)記錄。在質(zhì)量體系文件中對(duì)于檢測(cè)報(bào)告的編制、簽發(fā)及修改進(jìn)行規(guī)范，對(duì)檢驗(yàn)報(bào)告發(fā)放時(shí)限、標(biāo)本保存期限等均應(yīng)進(jìn)行規(guī)定。

3.4 室間質(zhì)量評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期參加國(guó)家臨床檢驗(yàn)中心或省級(jí)臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)評(píng)或能力驗(yàn)證，沒(méi)有室間質(zhì)評(píng)或能力驗(yàn)證的項(xiàng)目可以與其他實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室間比對(duì)。對(duì)每次室間質(zhì)評(píng)或室間比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行回顧分析，對(duì)于不可接受的結(jié)果進(jìn)行原因分析，落實(shí)整改措施，并記錄存檔。

4 眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)對(duì)眼內(nèi)病毒性感染的診斷價(jià)值及局限性

眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)作為一種重要的輔助診斷工具，具有較高的靈敏度及特異度，在眼內(nèi)病毒性感染相關(guān)疾病的診斷中具有一定的價(jià)值，但其固有的缺陷及臨床應(yīng)用的局限性也不容忽視。例如，利用熒光定量PCR方法檢測(cè)眼內(nèi)液病毒核酸，其結(jié)果可能受到眼內(nèi)液標(biāo)本量較少、反應(yīng)體系中存在擴(kuò)增抑制物、微生物多態(tài)性等因素的影響而出現(xiàn)假陰性結(jié)果[29]。在眼內(nèi)病毒感染的后期，由于眼內(nèi)病原體被機(jī)體自身免疫系統(tǒng)清除或病毒載量降低至檢測(cè)下限以下，也可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果與臨床診斷不符。因此，如單次病毒核酸檢測(cè)結(jié)果不能判斷是否為活動(dòng)性病原體，臨床醫(yī)師應(yīng)動(dòng)態(tài)觀察患者的眼部體征，并結(jié)合患者的病史、全身情況及其他實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行綜合判斷。

5 總 結(jié)

病毒核酸檢測(cè)是眼內(nèi)液檢測(cè)最常涉及的項(xiàng)目之一，本共識(shí)涵蓋了眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)應(yīng)用于臨床病例的標(biāo)本采集、運(yùn)輸、保存、檢測(cè)及臨床應(yīng)用規(guī)范，有助于實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行規(guī)范化的檢測(cè)，可為臨床眼科醫(yī)師提供精準(zhǔn)可靠的檢測(cè)數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)受檢患者進(jìn)行針對(duì)性診斷及精準(zhǔn)治療的目的。隨著檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)流程的細(xì)節(jié)及步驟仍需不斷更新及補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與臨床眼科醫(yī)師就檢測(cè)病例的選擇、眼內(nèi)液取樣途徑、標(biāo)本送檢方式及檢測(cè)技術(shù)的選擇等進(jìn)行實(shí)時(shí)溝通，以提高實(shí)驗(yàn)室在眼內(nèi)液病毒核酸檢測(cè)方面的能力，為早日實(shí)現(xiàn)眼科精準(zhǔn)檢測(cè)及治療貢獻(xiàn)力量。

執(zhí)筆：李堅(jiān)(杭州市第一人民醫(yī)院眼科)

終審：陶勇(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科)，鄭美琴(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院檢驗(yàn)科)

專家組成員(按姓名拼音順序排列)：常青(復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院眼科)，丁小燕(中山大學(xué)中山眼科中心)，馮云(北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科)，高磊(濰坊眼科醫(yī)院/煙臺(tái)正大光明眼科醫(yī)院)，高磊(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所)，高玲(中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院眼科)，侯婧(北京大學(xué)人民醫(yī)院眼科)，黃德光(臺(tái)灣臺(tái)北榮民總醫(yī)院眼科)，黃厚斌(解放軍總醫(yī)院眼科)，孔文君(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院眼科)，李堅(jiān)(杭州市第一人民醫(yī)院眼科)，李甦雁(徐州市第一人民醫(yī)院眼科)，李自強(qiáng)(北京智德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)，梁丹(中山大學(xué)中山眼科中心)，梁慶豐(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院眼科中心/北京市眼科研究所)，梁燕(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院檢驗(yàn)科)，鹿秀海(山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院檢驗(yàn)科)，錢竹韻(北京智德醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所)，蘇文如(中山大學(xué)中山眼科中心)，孫揮宇(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院眼科)，陶勇(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院眼科)，王海燕(陜西省眼科醫(yī)院，西安市人民醫(yī)院眼科)，王輝(北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科)，王逸軒(香港養(yǎng)和醫(yī)院)，王毓琴(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院眼科)，王志良(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院眼科)，吳開力(中山大學(xué)中山眼科中心)，夏涵(予果生物科技(北京)有限公司)，許松濤(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所)，姚進(jìn)(南京醫(yī)科大學(xué)附屬眼科醫(yī)院)，趙潺(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院眼科)，鄭美琴(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院檢驗(yàn)科)