張 穎 張曉良 綜述 趙 宇 審校

細(xì)胞衰老是一種以細(xì)胞周期永久性、不可逆性停滯為特征,受各種壓力因素誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng),這些因素包括DNA損傷、端粒功能障礙、自噬及氧化應(yīng)激等。細(xì)胞衰老扮演雙重角色,不僅對生理反應(yīng)起關(guān)鍵作用,如胎兒發(fā)育、組織修復(fù)、腫瘤抑制等,還參與慢性阻塞性肺疾病、椎間盤退變及糖尿病等衰老相關(guān)性疾病的調(diào)控過程[1]。衰老相關(guān)性疾病不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,還給社會帶來較為昂貴的醫(yī)療成本,因此研究細(xì)胞衰老在相關(guān)疾病中的機(jī)制具有重要意義。

糖尿病腎病(DN)是由糖尿病導(dǎo)致的一種慢性腎臟疾病,其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,目前認(rèn)為遺傳因素、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、自噬、晚期糖基化終產(chǎn)物的過度表達(dá)和代謝紊亂等多種致病因素參與DN的疾病進(jìn)展。越來越多證據(jù)表明細(xì)胞衰老在DN中的發(fā)生發(fā)展起著關(guān)鍵作用,引起研究者的廣泛關(guān)注。本文就DN與細(xì)胞衰老的相關(guān)性研究進(jìn)展及潛在治療靶點做一綜述。

細(xì)胞衰老

細(xì)胞衰老的概念細(xì)胞衰老包括復(fù)制性衰老和壓力誘導(dǎo)性早衰。復(fù)制性衰老是指端粒隨著DNA復(fù)制逐漸縮短,最終達(dá)到“Hayflick極限[1]”并引發(fā)DNA損傷反應(yīng),通過p16/RB或p53/p21途徑使細(xì)胞周期發(fā)生停滯的過程,壓力誘導(dǎo)性早衰是指由電離輻射、化療藥物等外界各種刺激引發(fā)的衰老。

細(xì)胞衰老的標(biāo)志物

細(xì)胞形態(tài) 衰老細(xì)胞會產(chǎn)生形態(tài)變化如細(xì)胞變扁平,胞體增大,這種變化與波形蛋白細(xì)胞骨架的重組有關(guān)。波形蛋白細(xì)胞骨架在衰老細(xì)胞中呈密集束狀,在生長活躍的細(xì)胞中則表現(xiàn)為不規(guī)則網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。衰老細(xì)胞中溶酶體和線粒體數(shù)量增加,并伴有核纖層蛋白B1(lamin B1)不同程度的丟失。

SA-β-gal 衰老相關(guān)-β-半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase,SA-β-gal)是目前使用最廣泛的衰老生物指標(biāo),主要在溶酶體中表達(dá),由于它作為單一檢測指標(biāo)容易產(chǎn)生假陽性,現(xiàn)在人們大多將其與其他標(biāo)志物聯(lián)合標(biāo)記,如脂褐素。脂褐素是與新陳代謝密切相關(guān)的新興指標(biāo),來源于蘇丹黑B的生物素化合物,對衰老細(xì)胞的鑒定具有高度特異性。

衰老相關(guān)分泌表型(SASP) 衰老細(xì)胞雖然處于周期永久性停滯狀態(tài),但仍具有代謝活性。衰老細(xì)胞可以產(chǎn)生多種分泌體包括促炎因子如白細(xì)胞介素(IL-8)、IL-6、生長因子、趨化因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等,來維持自身衰老特征,這些分泌體統(tǒng)稱為SASP。SASP具有雙向作用,一方面激活衰老細(xì)胞的免疫清除系統(tǒng),促進(jìn)傷口愈合和組織再生,抑制細(xì)胞癌變分化。另一方面介導(dǎo)慢性炎癥的發(fā)生,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖等。衰老細(xì)胞還可以通過旁分泌的方式改變周圍細(xì)胞的微環(huán)境,加速其他細(xì)胞的衰老[2]。

基因標(biāo)志物 P21CIP1/WAF1/SDI1和p16INK4A是兩種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinase,CDK)抑制劑,也是p53和Rb調(diào)控腫瘤抑制通路的組成部分,在衰老細(xì)胞中高度表達(dá)。P21CIP1/WAF1/SDI1和p16INK4A通過不同途徑導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯,參與細(xì)胞衰老進(jìn)展。p16INK4A主要通過抑制CDK4/6激酶活性及Rb磷酸化,阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。P21CIP1/WAF1/SDI1是一種p53依賴性蛋白,在應(yīng)激因子作用下, p53則可以通過介導(dǎo)p21-pRb通路誘導(dǎo)細(xì)胞衰老[2]。

細(xì)胞衰老與DN

DN腎臟中的衰老細(xì)胞新近研究顯示,細(xì)胞衰老廣泛存在于DN的腎組織中。腎活檢發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者的衰老細(xì)胞主要出現(xiàn)在近端小管中,少部分在足細(xì)胞,表現(xiàn)為SA-β-Gal和p16INK4A水平的升高,同時腎小球中p16INK4A表達(dá)與蛋白尿水平呈正相關(guān)[3]。Kitada等[4]研究顯示,高濃度葡萄糖可通過鈉-葡萄糖共轉(zhuǎn)運蛋白2(SGLT2)和p21途徑誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞的衰老[4]。經(jīng)ZDF-fa/fa誘導(dǎo)的糖尿病大鼠的足細(xì)胞變化表現(xiàn)為形態(tài)肥大、足突數(shù)量減少、足突間隙增加,并伴隨著p21、p27的高表達(dá)[5],提示DN與足細(xì)胞衰老密切相關(guān)。Cao等[6]研究發(fā)現(xiàn)高糖可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞過早衰老,表現(xiàn)為SA-β-gal陽性細(xì)胞率增加,端粒長度縮短,細(xì)胞周期阻滯于G1期,p53、p21表達(dá)增加。在STZ誘導(dǎo)的高糖模型中觀察到小鼠腎小球內(nèi)皮細(xì)胞IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1)等衰老表型水平的升高[7]。上述研究結(jié)果提示,細(xì)胞衰老可在多種腎臟細(xì)胞中發(fā)生。有研究報道細(xì)胞衰老表型出現(xiàn)在DN早期,因此深入研究細(xì)胞衰老在DN發(fā)病機(jī)制中的作用(圖1),可為DN的防治提供新的思路。

圖1 細(xì)胞衰老在DN中的發(fā)生機(jī)制mTOR:雷帕霉素靶蛋白；SASP：衰老相關(guān)分泌表型；DN：糖尿病腎病;Sirtuins:沉默信息調(diào)節(jié)因子

DN細(xì)胞衰老的機(jī)制

端粒損傷 端粒是位于真核細(xì)胞染色體末端的重復(fù)性DNA片段,其長度反映細(xì)胞的增殖能力。由于DNA聚合酶不能作用于單鏈3’末端,因此端粒會隨著每一次復(fù)制而縮短。端?？s短到臨界點或者發(fā)生功能障礙會導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯。敲除端粒酶基因EST1可以加速酵母細(xì)胞的衰老[8],而將端粒酶重新引入到端粒缺失的細(xì)胞中能夠使壽命延長,提示端粒縮短是細(xì)胞衰老的重要因素。體外研究發(fā)現(xiàn),高糖通過激活端粒p53-p21-Rb和JAK/STAT信號通路誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞的衰老[9]。除腎細(xì)胞外,端?？s短也發(fā)生在DN患者外周血白細(xì)胞中,白細(xì)胞端粒長度不僅與2型糖尿病患者腎小球濾過率(GFR)呈正相關(guān)[10],還能預(yù)測DN的全因死亡率[11],提示端?？s短與DN預(yù)后密切相關(guān)。

線粒體功能障礙 正常生理條件下,線粒體通過連續(xù)融合和裂變保持細(xì)胞的氧化和抗氧化平衡,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。伴隨著機(jī)體老化,線粒體會出現(xiàn)裂變失衡,釋放大量活性氧(ROS),引起線粒體外膜破裂、鈣過載、DNA損傷等,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死。線粒體影響細(xì)胞衰老與ROS的過量產(chǎn)生有關(guān)。ROS增多會破壞線粒體呼吸鏈中電子傳遞,誘發(fā)大量超氧化自由基形成,而超氧化自由基是加速衰老的重要因素。過量的ROS還會導(dǎo)致線粒體DNA突變,進(jìn)一步引起端粒功能障礙。Lee等[12]研究發(fā)現(xiàn),抗衰老蛋白Klotho通過保護(hù)腎臟線粒體來改善DN,與單獨使用高糖處理的腎小管細(xì)胞相比,添加Klotho處理的細(xì)胞中存在更多的功能性線粒體,同時ROS水平表達(dá)降低,線粒體復(fù)合物蛋白表達(dá)升高,這表明Klotho直接保護(hù)高糖暴露下腎小管細(xì)胞中的線粒體。通過調(diào)控線粒體氧化應(yīng)激延緩衰老可能為治療DN帶來新希望。

自噬缺陷 細(xì)胞自噬是指細(xì)胞利用自噬體或自噬溶酶體分解損傷的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分,避免有害物質(zhì)的積累。細(xì)胞自噬與生物的生長發(fā)育、疾病、衰老等密切相關(guān),隨著衰老的進(jìn)展,細(xì)胞表現(xiàn)出自噬水平的減弱,自噬蛋白Atg5、Atg7表達(dá)的下調(diào)。缺乏Atg5的近端小管表現(xiàn)出線粒體破壞、脂褐素堆積,提示自噬參與衰老的過程。自噬還可以通過炎癥、線粒體氧化應(yīng)激等調(diào)控衰老。DN進(jìn)展過程中,細(xì)胞自噬功能也有一定程度的損傷。2型糖尿病患者的腎活檢樣本觀察到p62蛋白在近端腎小管細(xì)胞中沉積,表明人類2型糖尿病患者存在自噬缺陷[13]。此外,線粒體自噬還通過參與腎組織細(xì)胞M1/M2表型轉(zhuǎn)化在DN中發(fā)揮重要作用[14],提示細(xì)胞衰老可能介導(dǎo)線粒體自噬參與DN的發(fā)生發(fā)展。

炎癥因子增加 衰老細(xì)胞可以分泌多種促炎因子和趨化因子,其中 IL-6、IL-8及MCP-1是SASP的核心組成部分。核因子κB(NF-κB)相關(guān)炎癥信號通路在調(diào)控衰老過程發(fā)揮重要作用,NF-κB亞基p50和p105的消融(使NF-κB激活)可導(dǎo)致小鼠端粒功能障礙,加速衰老[15]。炎癥的發(fā)生也是DN的發(fā)病機(jī)制之一,在持續(xù)高糖狀態(tài)下,促炎因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-6、細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)、MCP-1等通過糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)和蛋白激酶C(PKC)等通路激活炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腎小球基底膜增厚,腎小球硬化或間質(zhì)纖維化,引發(fā)DN。

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路激活 mTOR是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶,調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞周期變化,許多動物實驗表明mTOR通過NF-κB、STAT3和Akt等信號通路以及自噬參與細(xì)胞衰老。研究表明敲除mTOR基因可以延長秀麗隱桿線蟲、酵母及果蠅壽命[16]。mTOR抑制劑雷帕霉素通過抑制IL-1α的翻譯來減低NF-κB轉(zhuǎn)錄活性,調(diào)節(jié)細(xì)胞衰老。在一項前瞻性臨床試驗中,雷帕霉素可以降低人類皮膚p16INK4A,局部涂抹使皮膚細(xì)紋減少,膚色光亮均勻[17]。mTOR可以調(diào)控Akt/mTOR通路參與DN的發(fā)病機(jī)制,一項研究發(fā)現(xiàn)高糖能夠上調(diào)腎小球系膜細(xì)胞Akt和mTORC1復(fù)合體,導(dǎo)致系膜細(xì)胞肥大,加速DN進(jìn)展[18]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子(Sirtuins)表達(dá)減少 Sirtuins是高度保守的NAD+依賴性脫乙?；负虯DP-核糖基轉(zhuǎn)移酶,參與哺乳動物多種細(xì)胞和機(jī)體的調(diào)節(jié)過程,包括新陳代謝,免疫應(yīng)答和衰老。人們發(fā)現(xiàn)酵母中Sirtuins2(Sir2)表達(dá)的降低與酵母老化相關(guān)[19]。SIRT1可能調(diào)控線粒體氧化物合成影響細(xì)胞衰老。Lim等[20]發(fā)現(xiàn),SIRT1可調(diào)控自噬以抑制紫外線照射引起的皮膚成纖維細(xì)胞衰老。SIRT1對防治DN也有重要作用,SIRT1基因敲除的糖尿病小鼠出現(xiàn)足細(xì)胞數(shù)量減少,蛋白尿加重[21]。SIRT1水平的上調(diào)也可以抑制糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化,延緩DN進(jìn)展[22]。

凝血因子釋放 衰老細(xì)胞可以分泌凝血因子,包括纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)、尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(uPAR)和血小板凝血酶蛋白1(THBS1)等,這些指標(biāo)都與DN發(fā)病相關(guān)。隨著DN的進(jìn)展,PAI-1表達(dá)水平逐漸升高；減少PAI-1表達(dá)可減輕DN小鼠蛋白尿,抑制腎纖維化[23]。Zhou等[24]發(fā)現(xiàn)2型糖尿病患者腎臟uPAR水平升高,血清uPAR、IL-18水平與eGFR呈負(fù)相關(guān),提示uPAR可用于評估DN患者腎功能。THBS1在DN早期顯著增加,并隨著疾病進(jìn)展進(jìn)一步升高,提示THBS1參與DN進(jìn)展。

抗細(xì)胞衰老治療在DN的應(yīng)用

Senolytics藥物Senolytics是一類選擇性清除衰老細(xì)胞的藥物,包括達(dá)沙替尼和槲皮素(D+Q組合),ABT-263,FOXO4-DRI等。近期研究發(fā)現(xiàn)Senolytics在DN患者中具有明顯的治療作用,Mayo Hickson等[25]對11例DN患者使用100 mg達(dá)沙替尼+1 000 mg槲皮素3d,11d后患者脂肪、皮膚中表達(dá)p16INK4A、p21CIP1及SA-β-gal+的衰老細(xì)胞數(shù)量減少,血清中IL-1α、IL-6、MMP-9 等SASP水平也相應(yīng)降低,表明Senolytics藥物短期應(yīng)用可有較清除衰老細(xì)胞。Li等[26]發(fā)現(xiàn)D+Q組合還可減少小鼠腎小管上皮細(xì)胞衰老標(biāo)志物SA-β-gal、p16、p21及IL-6、MCP-1等炎性因子的表達(dá),提示Senolytics可能延緩DN的進(jìn)展。

ABT-263通過抑制抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤2(BCL-2)和BCL-XL的活性, 使衰老細(xì)胞發(fā)生凋亡,發(fā)揮抗衰老效應(yīng)。FOXO4-DRI是一種能夠干擾FOXO4蛋白質(zhì)功能的肽類,它可以競爭性抑制衰老細(xì)胞中FOXO4與p53的結(jié)合,促使衰老細(xì)胞凋亡。

Senomorphics干預(yù)療法Senomorphics干預(yù)療法主要是通過減少SASP的分泌抑制衰老進(jìn)展,并能同時保持細(xì)胞存活,這一類化合物包括二甲雙胍,芹菜素,山奈酚和白藜蘆醇等。二甲雙胍既是2型糖尿病的一線治療藥物,也具有延緩衰老的作用,二甲雙胍通過干擾IκB激酶(IKK)/NF-κB活化抑制IL-6、IL-8、趨化因子5(CXCL-5)等SASP表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),二甲雙胍通過MBNL1/miR-130a-3p/STAT3途徑降低DN腎小管上皮細(xì)胞SA-β-gal的水平[27]。一項關(guān)于2型糖尿病患者的回顧性研究發(fā)現(xiàn),與非二甲雙胍使用者相比,二甲雙胍使用者全因死亡率及ESRD 進(jìn)展發(fā)生率顯著降低,這提示二甲雙胍可能有助于改善DN患者的預(yù)后[28]。NAD+代謝與細(xì)胞衰老密切相關(guān),芹菜素和白藜蘆醇可以升高NAD+水平,激活SIRT,發(fā)揮抗炎抗氧化特性延緩衰老。Zhang等[29]發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可上調(diào)高糖環(huán)境中足細(xì)胞SIRT1的表達(dá),減輕糖尿病小鼠足細(xì)胞的氧化應(yīng)激與凋亡。

熱量限制熱量限制是指在不造成機(jī)體損害的條件下限制熱量攝入,是公認(rèn)的維持健康和延長壽命的有效策略。熱量限制已被證實能夠延長酵母細(xì)胞,秀麗隱桿線蟲及老鼠,獼猴等哺乳動物壽命,同時也能延緩糖尿病,慢性肺部疾病,神經(jīng)退行性病等慢性疾病的進(jìn)展。熱量限制可減少小鼠不同器官及人類結(jié)腸黏膜中衰老標(biāo)志物表達(dá),還可以通過調(diào)控ROS、SIRT及mTOR等信號通路延緩細(xì)胞衰老。研究顯示,對患有2型糖尿病的病態(tài)肥胖患者進(jìn)行熱量限制可有效提高其GFR水平,改善腎功能[30]。

其他藥物煙酰胺核苷(NR)和煙酰胺單核苷酸(NMN)是NAD+前體補充劑,NR和NMN已被證明在無脊椎動物和小鼠模型中具有抗衰老作用。動物研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)NMN治療后,糖尿病小鼠尿白蛋白排泄增加程度減弱,同時腎臟中SIRT1表達(dá)增加[31]。非甾體類抗炎藥(NSAIDs),包括阿司匹林和布洛芬等,其主要靶點為環(huán)氧合酶(COX),通過減輕炎癥和抗氧化發(fā)揮抗衰老作用。阿司匹林可以延長線蟲、果蠅及雄性小鼠的壽命。一項包括 76 名DN患者的隨機(jī)試驗表明,與對照組相比,短期使用大劑量阿司匹林(1000 mg)可使蛋白尿發(fā)生率降低15.9%[32]。

小結(jié):DN中細(xì)胞衰老相關(guān)的發(fā)病機(jī)制包括端?？s短、線粒體功能障礙、自噬、炎性反應(yīng)、mTOR信號及Sirtuins激活、凝血因子釋放等。這些因素相互作用,協(xié)同促進(jìn)DN細(xì)胞衰老的發(fā)生發(fā)展。深入研究DN與細(xì)胞衰老相關(guān)的分子機(jī)制,有望提供潛在可行的DN治療思路,例如Senolytics藥物、Senomorphics干預(yù)療法、熱量限制、NAD+補充劑、非甾體類抗炎藥等(圖2),但將其應(yīng)用于DN患者的治療還需要大量的動物實驗和臨床研究來證實。在未來的研究中,期望能夠發(fā)現(xiàn)更多針對與DN相關(guān)的細(xì)胞衰老的治療靶點,進(jìn)一步促進(jìn)相關(guān)藥物的研發(fā)與篩選,為DN的防治尋找新的切入點。

圖2 抗細(xì)胞衰老治療在糖尿病腎病中的應(yīng)用SASP：衰老相關(guān)分泌表型；ROS：活性氧；mTOR:雷帕霉素靶蛋白；NR：煙酰胺核苷；NMN：煙酰胺單核苷酸