李 偉 程 豐 綜述 王鎖剛 審校

隨著器官移植技術(shù)精益求精和圍手術(shù)期的管理精細化,對適應性和固有免疫應答的深入了解,移植物和器官移植受者短期存活率得到顯著提高。然而,如何減少免疫抑制的藥物不良反應,降低器官移植慢性排斥反應及感染的發(fā)生率仍然面臨著巨大挑戰(zhàn)。目前,器官移植受者的免疫抑制治療通常是按照傳統(tǒng)方案進行,根據(jù)移植物的功能或組織學評估和(或)藥物毒性或感染的跡象進行調(diào)整,這樣使患者暴露于較高的感染率和藥物毒性,或因排斥反應而增加急性和慢性移植物損傷的風險。因此,需要開發(fā)可靠的生物標志物用于免疫監(jiān)測,評價患者免疫風險。

免疫系統(tǒng)是由免疫細胞,細胞因子,趨化因子,抗體和補體系統(tǒng)組成的復雜網(wǎng)絡。因此,免疫監(jiān)測所基于的生物標記必須在分析上具有可靠性、敏感度、特異度及可適用性強的特點[1]。單純藥物濃度的監(jiān)測,不能反映受者機體的免疫狀態(tài),結(jié)合免疫狀態(tài)的指標更有利于藥物濃度的調(diào)整。淋巴細胞亞群/百分比只能反映其數(shù)量而非功能。本文擬簡述在器官移植中常用的免疫監(jiān)測指標。

T淋巴細胞亞群計數(shù)及功能

活化T細胞表面抗原T細胞的活化涉及特定受體蛋白、黏附分子、趨化因子受體、共刺激分子和主要組織相容性復合體Ⅱ(MHCⅡ)類分子的表達?？扇苄钥乖璼CD30與移植排斥反應和長期移植功能相關(guān)[2]。CD28調(diào)節(jié)T細胞增殖和分化,并在體內(nèi)免疫反應途徑中發(fā)揮重要作用,CD95與早期排斥反應相關(guān)[3],CD28和CD95在這方面是似乎很有前途,但CD28可能并不反映T細胞活化,CD95與感染也有關(guān)系。

濾泡輔助T細胞和調(diào)節(jié)T細胞濾泡輔助T細胞(Tfh)與移植中的供者特異性抗體(DSA)形成有關(guān)[4], 濾泡調(diào)節(jié)T細胞(Tfr)能防止DSA形成,降低抗體介導的排斥反應(ABMR)發(fā)生率[5]。有研究表明[6],在小鼠皮膚移植模型中,Tfh對移植中DSA生成具有良好的預測作用。因此,監(jiān)測 Tfh/Tfr比值有望為ABMR風險的患者提供個性化的免疫抑制藥物治療,但目前經(jīng)驗有限,需要進一步理論研究。

T淋巴細胞免疫功能和記憶性細胞毒性T細胞功能20世紀美國食品和藥物管理局(FDA)批準T淋巴細胞免疫功能檢測試驗(Cylex ImmuKnow)用于測量有絲分裂原刺激的CD4淋巴細胞產(chǎn)生的ATP,測得的ATP值即代表細胞免疫的活性,《Cylex指南》將弱免疫應答分類為ATP水平<225 ng/ml,提示免疫抑制過度;ATP水平226～524 ng/ml,中度免疫抑制;ATP水平>525 ng/ml,免疫高危[7]。研究發(fā)現(xiàn),當ATP水平<130 ng/ml或者ATP水平>450 ng/ml時,免疫應答處于高排斥反應狀態(tài),這一結(jié)果提示可能的最佳目標治療范圍[8]。在移植前評估中,該檢測作為一種一次性檢測可能有助于確定誘導治療的必要性,以及制訂腎移植后免疫治療和排斥反應監(jiān)測的個性化方案。

記憶性細胞毒性T細胞功能測定是一種細胞功能測定法,測定受者淋巴細胞在細胞培養(yǎng)中對供者淋巴細胞的免疫反應。將供者/受者外周血單核細胞(PBMC)混合培養(yǎng)16h,用流式細胞儀檢測表達炎癥標志物CD154的T細胞[9]。Rohan等[10]發(fā)現(xiàn),供者CD154+記憶性細胞毒性T細胞反應與急性細胞性排斥反應的組織嚴重性呈正相關(guān)。該方法評估腎移植后急性細胞排斥反應的可能性,確定移植器官是否引起移植受者的免疫反應增強。

細胞因子研究表明除了Th1和Th2細胞的分化和細胞因子的產(chǎn)生外,幼稚的人CD4 T細胞通過白細胞介素6(IL-6)和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的作用,也能分化為Th17細胞[11]。Th17細胞可能通過分泌IL-17和IL-22在排斥反應和慢性移植物損傷中發(fā)揮作用。此外,在同種異體排斥反應和免疫耐受中,Th17和Treg細胞之間的平衡似乎是至關(guān)重要[12]。IL-17的檢測僅僅被認為是器官移植中急性排斥反應風險的預測性生物標志物,需要進一步的研究。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制的功能效應,可通過實時聚合酶鏈反應定量分析全血樣本中干擾素γ(IFN-γ)和IL-2的基因表達來監(jiān)測[13],酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)(ELISPOT)實驗方法在腎移植術(shù)前使用,與急性排斥反應、慢性排斥反應以及移植物功能之間有明確的相關(guān)性[14],同時也有研究發(fā)現(xiàn),器官移植術(shù)后使用ELISPOT實驗方法有助于監(jiān)測感染[15],通過ELISPOT、細胞內(nèi)流式細胞術(shù)或殘余活化T細胞核因子(NFAT)基因表達監(jiān)測IFN-γ的產(chǎn)生,可能有助于評估患者的排斥反應風險和個人反應,并預測移植結(jié)果,這有助于腎臟和肝移植受者制訂免疫抑制治療。需要進一步的臨床試驗來證明基于細胞因子的免疫檢測用于預測排斥反應、感染和移植物損傷的作用。

B淋巴細胞

DSADSA是B細胞在免疫應答中的標志物。DSA升高與同種異體移植物長期預后不良有關(guān),DSA結(jié)合補體可能會提高預測能力[16]。DSA的數(shù)量和分型是其結(jié)合補體的兩個決定因素。不同亞型、不同補體結(jié)合意義不同,其中IgG1是最主要的亞型并能反映IgG的總體水平,無ABMR的患者大多數(shù)單獨存在IgG1或未檢測到亞類,IgG3有更強的C1q結(jié)合能力,并激活補體級聯(lián)。盡管IgG2激活補體能力很弱,IgG4根本不能激活補體,但是兩者均可通過Fc受體募集效應細胞,IgG4與排斥反應的晚期階段有關(guān)。無論是術(shù)前還是術(shù)后出現(xiàn)C1q和C3d DSA都明顯增加腎移植受者急性排斥反應、移植物丟失等不良臨床預后的風險[17-18]。隨著補體結(jié)合DSA分析和IgG亞類分析的進步,提高了評估患者免疫學風險的能力。

CD19+CD24hiCD38hi過渡性B細胞B淋巴細胞在免疫排斥中的標志物CD19+CD24hiCD38hi過渡性B細胞已經(jīng)引起許多學者的興趣。一項前瞻性研究[19],納入73例初次腎移植受者,收集受者移植前/后B細胞分型以及移植后48±6個月臨床免疫學及生物化學相關(guān)數(shù)據(jù),此類過渡性特殊類型B淋巴細胞與急性排斥反應之前存在負相關(guān)。該研究支持過渡特殊類型B細胞作為生物標志物和移植治療干預的潛在相關(guān)性。但仍需要進一步研究該標志物在預測急性排斥反應中的靈敏度和特異度。

CD20+CD24hiCD38hi過渡性B細胞和CD20+CD28loCD24lo幼稚B細胞B淋巴細胞在免疫耐受中的標志物CD20+CD24hiCD38hi過渡性B細胞和CD20+CD28loCD24lo幼稚B細胞可能有助于評估患者免疫狀態(tài),Chesneau等[20]研究證實,通過對比自愿受試者(18例)、撤除免疫抑制劑的免疫耐受腎移植受者(9例)和免疫抑制劑支持的穩(wěn)定腎移植受者(15例)的移植后第0天、第2天、第4天、第6天的B淋巴細胞亞型,可以發(fā)現(xiàn)CD20+CD24hiCD38hi過渡性B細胞和CD20+CD28loCD24lo幼稚B細胞在免疫耐受受者有更高的表達頻率,并且大量分泌IL-10,同時減少體液中漿細胞分化因子的釋放。然而,這種類型細胞對長期移植功能狀態(tài)的預測有待研究。

自然殺傷細胞(NK細胞)

NK細胞在免疫耐受的形成過程中起著重要的作用,同時可介導器官移植排斥反應,造成移植物損傷。它與急性排斥反應存在正相關(guān)性[21],但在急性移植物抗宿主病中的機制和免疫調(diào)節(jié)作用仍不清楚,值得深入研究。

尿液生物標志物

尿液生物標志物的發(fā)展2001年Li等[22]納入急性排斥反應(22例)和無急性排斥反應(63例)腎移植受者的尿液樣本發(fā)現(xiàn),穿孔素mRNA和顆粒酶B的mRNA水平在急性排斥反應患者的尿液標本中表達更高。2005年Muthukumar等[23]納入83例腎移植受者的尿液樣本發(fā)現(xiàn),尿液中的叉頭狀螺旋因子3(FOXP3)mRNA水平,除了診斷急性細胞介導排斥反應(ACR)外還可預測對抗排斥治療的反應和ACR發(fā)作后移植腎的結(jié)局。2013年Suthanthiran等[24]納入485例腎移植受者,從移植后第3天到第12個月的尿液樣本,分別監(jiān)測移植受者尿液中穿孔素、顆粒酶B、CD3、CD103,干擾素誘導蛋白10(IP-10)和FOXP中的表達水平,發(fā)現(xiàn)與急性細胞排斥反應相關(guān),似乎這些指標可作為診斷生物標志物。據(jù)報道,一組六種miRNA(miRNA-9、miRNA-10a、miRNA-21、miRNA-29a、miRNA-221和miRNA-429)可預測同種異體腎移植受者的移植物功能延遲[25]?？梢?miRNA作為腎臟同種異體移植狀態(tài)的生物標志物具有相當大的前景。

特定的蛋白譜α1微球蛋白(α1-MG)在健康的腎臟中自由地穿過腎小球膜,幾乎被近端腎小管細胞分解代謝及重新吸收。尿液中高水平的α1-MG表明近端腎小管功能障礙并且與間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮和炎癥相關(guān),已知這些是長期移植物丟失的指標。觸珠蛋白(HP)主要與游離血紅蛋白相結(jié)合。Shen等[26]在心臟移植小鼠模型中發(fā)現(xiàn),在IL-6和巨噬細胞炎性蛋白2的高水平表達下,HP可修飾同種異體移植物中的炎癥環(huán)境,增強樹突狀細胞移植物募集并增強抗供體T細胞應答,同時免疫抑制性細胞因子IL-10的水平會受到影響。α1-MG和HP在排斥反應預測方面非常有前途的。

趨化因子趨化因子是小分子分泌蛋白組成的一個龐大的細胞因子超家族,在移植物內(nèi)的免疫細胞募集和定位中發(fā)揮重要作用,大量文獻表明,尿液趨化因子表達的增加與排斥反應有密切相關(guān)性(表1)[27-30]。

表1 尿液趨化因子與器官移植相關(guān)性

綜上所述,尿液CXCL9和CXCL10預測急性排斥反應、短期移植物功能以及多瘤病毒(BKV)感染的能力較強;雖然尿液CXCL9能鑒別急性T細胞介導的排斥反應,尿液CXCL10在抗體介導的排斥反應中的有著重要的相關(guān)性。但是,尿CXCL9和CXCL10仍然無法區(qū)分排斥反應和BKV相關(guān)腎病(BKVN)。

供者/移植物來源細胞游離DNA

人體內(nèi)的大多數(shù)DNA都位于細胞內(nèi),在排斥反應發(fā)生之前或期間,同種異體移植細胞受到損傷會導致DNA釋放到受者的血液中,從而導致供者來源細胞游離DNA (dd-cfDNA)水平升高。Dale等[31]研究證實，dd-cfDNA的檢測在腎移植領(lǐng)域應用優(yōu)于腎功能檢測。當dd-cfDNA<1%,提示未發(fā)生ABMR,dd-cfDNA>1%,提示可能發(fā)生ABMR(靈敏度59%,特異度85%)[32],BKVN和尿路感染/腎盂腎炎均使dd-cfDNA水平升高,所以添加降鈣素原作為感染標志物可提高dd-cfDNA在腎移植排斥反應中的特異度。dd-cfDNA無法區(qū)分AMR與BKVN。利用dd-cfDNA進行準確風險分層，對可能發(fā)生不良事件的患者進行篩查,有可能改善移植受者的存活率和腎功能預后。

移植物來源的游離DNA (GcfDNA)檢測在肝移植領(lǐng)域應用優(yōu)于肝功能檢測和免疫抑制藥物監(jiān)測,而且該值可以通過百分比或絕對拷貝數(shù)值進行跟蹤[33]。監(jiān)測GcfDNA具有直接反映移植器官健康的優(yōu)點。

展 望

免疫狀態(tài)監(jiān)測研究方法很多,但尚無公認在敏感度和特異度方面均令人滿意的診斷工具。多數(shù)研究局限于回顧性或單中心,可復制性差,有些實驗方法難以建立統(tǒng)一的標準,或者非常費時費力。目前免疫學監(jiān)測技術(shù)及指標尚未完全滿足臨床需要,通常需結(jié)合多項指標及臨床表現(xiàn)進行綜合評估。最近一項前瞻性研究[34],納入72例肝移植受者,收集移植當日到術(shù)后21d的外周血,分別監(jiān)測移植受者外周血中的單核細胞HLA-DR表達、CD4+、CD8+、CD45+、CD64+、IgA、IgG、IgM及NK細胞。術(shù)后第3天IgA、IgG和循環(huán)單核細胞的增加與感染的發(fā)生有相關(guān)性。其他指標變化與感染和排斥有關(guān),如移植后第3天和第7天的中性粒細胞。但是這一組普遍的標準化的生物標志物似乎也并不能更好地指導個性化免疫制劑使用。因此,為了滿足患者的個性化預測的需求,必須開發(fā)可靠的生物標志物用于免疫監(jiān)測,讓高低危排斥反應風險的分層更簡便、準確。有助于平衡療效與不良反應,為移植受者的治療提供更好的指導,對于提高移植物存活率的個體化治療至關(guān)重要。