謝麗蓉 顧青 尹莉莉

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種進(jìn)行性中心視力損害性疾病，是發(fā)達(dá)國家老年人不可逆盲的主要原因。由于經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的老齡化，近年來在國內(nèi)的發(fā)病率也不斷攀升[1]。AMD的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，流行病學(xué)調(diào)查顯示，多種脂質(zhì)生物學(xué)功能相關(guān)的遺傳變異與AMD相關(guān)[2]；代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝通路是AMD發(fā)生發(fā)展相關(guān)通路[3]。此外，干性AMD的重要病理特征-玻璃膜疣內(nèi)富含脂質(zhì)，提示脂質(zhì)代謝紊亂是AMD病理改變的重要因素[4]。脂質(zhì)代謝失調(diào)引起視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)和Bruch膜內(nèi)脂質(zhì)堆積，在黃斑的高氧化應(yīng)激環(huán)境下氧化為氧固醇[5]，進(jìn)一步沉積形成玻璃膜疣[6]。氧固醇具有促炎作用，炎癥反之促進(jìn)玻璃膜疣的形成和RPE細(xì)胞變性，加快AMD的發(fā)生發(fā)展[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氧固醇的一種7-酮膽固醇沉積于視網(wǎng)膜，引起視網(wǎng)膜炎癥和感光細(xì)胞功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致AMD樣變的發(fā)生和發(fā)展[8]。

LXR屬于核受體超家族，包括LXRα和LXRβ，是哺乳動(dòng)物脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，調(diào)控各個(gè)組織膽固醇的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、外排[9]，對炎癥的調(diào)節(jié)也有重要作用[10]。已有研究表明激活LXR可以上調(diào)ABCA1、ApoE等載脂蛋白的表達(dá)，增加膽固醇外流，促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)LXR激活后可抑制腫瘤壞死因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白1、一氧化氮合酶等炎癥因子表達(dá)[12]，LXR激動(dòng)劑可通過NF-κB信號(hào)通路減少Amyloid β對視網(wǎng)膜的炎癥作用[13]。本研究擬探討LXR激動(dòng)劑對視網(wǎng)膜過氧化脂質(zhì)堆積的調(diào)節(jié)和炎癥改善作用，并探究其機(jī)制，為視網(wǎng)膜脂質(zhì)沉積變性的治療提供更多可能性。

資料與方法

一、材料

實(shí)驗(yàn)研究。(1)ARPE-19細(xì)胞：購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；(2)藥物試劑：胎牛血清、抗菌素(Gibco，德國)；GW3965(Selleck公司，美國)；7-酮膽固醇、油紅O、DMSO、Trition X-100(Sigma公司，美國)；LXRα、LXRβ、ABCA1抗體(Abcam公司，英國)；lipo2000(Thermo公司，美國)；7-酮膽固醇抗體(Novus biologics公司，美國)；siLXRα、si LXRβ(河馬生物，浙江)；micro syringe、needle(Hamilton，美國)；CY3標(biāo)記山羊抗兔二抗(Jackson，美國)；山羊血清(博士德生物，武漢)；DAPI(碧云天)；Annexin-V/PI試劑盒(Biosharp，中國)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，中國南京)

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：ARPE-19細(xì)胞購自ATCC，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、2 mmol / l谷氨酰胺、100 IU / ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。更換培養(yǎng)基并及時(shí)傳代，取生長狀態(tài)良好的第5～8代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.CCK-8篩選藥物最佳濃度：將ARPE-19細(xì)胞懸液(100 μl/孔)接種于96孔板中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；分別加入不同濃度激動(dòng)劑GW3965(1.5 μM、2 μM、2.5 μM、3 μM)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育48 h；取出后，CCK-8作用2 h，用酶標(biāo)儀測定各組在450 nm處的吸光度。

3.7-酮膽固醇免疫熒光染色：ARPE-19細(xì)胞懸液加入24孔板中，分為4組，control、DMSO、GW3965、7 kCh組，待細(xì)胞生長融合至70%，更換無血清培養(yǎng)基24 h，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，除control組以外添加7 kCh(20 μM)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，無菌PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3遍。10%山羊血清室溫封閉2 h，PBS洗3次，孵育7 kCh(1:100)一抗4 ℃過夜。CY3標(biāo)記熒光二抗(1:500)室溫孵育2 h，DAPI復(fù)染30 min，萊卡共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS NT，Wetzlar，Germany)拍照。

4.油紅O染色：ARPE-19細(xì)胞懸液加入放好爬片的24孔板中，分為4組，control、DMSO、GW3965、7 kCh組，待細(xì)胞生長融合至70%，更換無血清培養(yǎng)基24 h，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，實(shí)驗(yàn)組均置于含7 kCh(20 μM)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，4%4 ℃多聚甲醛固定20 min。PBS再次漂洗2次，油紅O(0.3 g/mL)37 ℃染色20～30 min。60%異丙醇漂洗5 s，然后立刻PBS漂洗2～3次。蘇木素復(fù)染40 s，水洗2～3 min，顯微鏡(Olympus BX53，日本)下觀察。

5.siRNA轉(zhuǎn)染分別敲低LXRα、LXRβ表達(dá)：ARPE-19分為6組，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ組，待細(xì)胞生長融合至50%，更換無血清培養(yǎng)基，分別加入混有siLXRα或siLXRβ RNA與lipo2000的試劑，轉(zhuǎn)染6 h后更換血清培養(yǎng)基作用24 h，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，將后四組置于含7 kCh(20 μM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

6.qPCR檢測ARPE-19細(xì)胞內(nèi)IL-1β、Caspase 1的表達(dá)：ARPE細(xì)胞分為6組，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ組，如前所述轉(zhuǎn)染，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，于含7 kCh(20 μM)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。Trizol提取各組RNA，用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix逆轉(zhuǎn)并擴(kuò)增。檢測時(shí)每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)副孔，并計(jì)算平均Ct值作為最終Ct值，以actin作為內(nèi)參將數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，引物序列見表1。

7.Annexin-V/PI染色檢測ARPE-19細(xì)胞凋亡：ARPE細(xì)胞分為6組，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ組，如前所述轉(zhuǎn)染，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，置于7 kCh(20 μM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。胰酶消化得到6組單細(xì)胞懸液(106/ml)，加入熒光染料37 ℃孵育30 min，流式細(xì)胞儀(CYTOFLEX；貝克曼庫爾特公司，美國)檢測，激發(fā)光波長488 nm，515 nm濾器檢測FITC熒光，570 nm濾器檢測PI。

結(jié) 果

一、篩選激動(dòng)劑最佳濃度

CCK8結(jié)果顯示：GW3965濃度在1.5、2 μM時(shí)對RPE細(xì)胞的增殖活力沒有明顯影響，當(dāng)濃度大于2.5時(shí)細(xì)胞增殖活力隨濃度上升而下降(圖1)。

不同濃度GW3965作用下ARPE-19細(xì)胞CCK-8檢測

二、LXRs激活減少RPE細(xì)胞7-酮膽固醇堆積

C、O：7 kCh染色陰性；G、K：7 kCh染色陽性；D：RPE細(xì)胞內(nèi)無脂滴沉積；H、L：RPE細(xì)胞內(nèi)大量脂滴沉積；P：RPE細(xì)胞內(nèi)幾乎無脂滴沉積。

ARPE-19細(xì)胞免疫熒光染色顯示：與未經(jīng) 7 kCh處理的control組相比，7 kCh組RPE細(xì)胞內(nèi)免疫陽性細(xì)胞增加(圖2C、K)，表明7 kCh沉積在RPE細(xì)胞中；用激動(dòng)劑GW3965處理的細(xì)胞與DMSO處理的對照組相比，細(xì)胞內(nèi)陽性顆粒減少，說明GW3965減少7 kCh在RPE細(xì)胞中堆積(圖2G、O)。油紅染色也證實(shí)了這一點(diǎn)：control組細(xì)胞內(nèi)脂滴較7 kCh組少(圖2D、L)，DMSO組與7 kCh組細(xì)胞內(nèi)脂滴無明顯差異(圖2H、L)，GW3965組細(xì)胞內(nèi)脂滴比7 kCh、DMSO組明顯減少(圖2H、L、P)，表明LXR激動(dòng)劑處理減少7 kCh在RPE細(xì)胞中堆積。

圖2 免疫熒光及油紅O染色檢測RPE細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況

三、LXRs激活減少RPE細(xì)胞凋亡

LL，活細(xì)胞：Annexin V陰性/PI陽性；LR，早期凋亡細(xì)胞：Annexin V陽性/PI陰性；UR，晚期凋亡細(xì)胞：Annexin V陽性/PI陽性;UL，壞死細(xì)胞：Annexin V陰性/PI陽性。每個(gè)象限中的數(shù)字代表細(xì)胞出現(xiàn)在該象限的百分比。

ARPE-19細(xì)胞Annexin V/PI檢測顯示：與control組相比，7 kCh、DMSO組凋亡細(xì)胞分別上調(diào)9.94%、9.62%(圖3A、B、C)；GW3965與7 kCh共同作用RPE細(xì)胞后，凋亡細(xì)胞較control組僅上調(diào)1.92%(圖3D)，表明GW3965減少7 kCh誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞早期凋亡；敲低LXRα同時(shí)7 kCh培養(yǎng)RPE細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞增加19.46%(圖3E)，而敲低LXRβ同時(shí)7 kCh培養(yǎng)RPE細(xì)胞，早期凋亡細(xì)胞與7 kCh組無明顯差異，但晚期凋亡細(xì)胞明顯增加(圖3F)。

圖3 Annexin V/PI染色檢測ARPE-19細(xì)胞早期凋亡

LXRs激活A(yù)BCA1、減少7 kCh引起的IL-1β和Caspase 1上調(diào)

A-E：DMSO、7 kCh、GW3965、siLXRα、siLXRβ分別與control組比較

q-PCR結(jié)果顯示：LXR激動(dòng)劑增加LXRα、LXRβ、ABCA1表達(dá)量(圖4A、B、E)，說明LXR激動(dòng)劑可以增加ABCA1的表達(dá)；7 kCh作為LXRs的配體，對LXRs同樣有激活作用(圖4A、B)；7 kCh增加RPE細(xì)胞內(nèi)Caspase1、IL-1β表達(dá)，而LXR激動(dòng)劑減少7 kCh引起的這種反應(yīng)(圖4C、D)；抑制LXRβ表達(dá)后，Caspase1、IL-1β表達(dá)量增加，而抑制LXRα后，與7 kCh組相比，Caspase1、IL-1β表達(dá)量無明顯變化(圖4C、D)，說明在此炎癥通路中LXRβ起主要抑制作用。

圖4 RT-PCR檢測ARPE-19細(xì)胞LXRα、LXRβ、ABCA1、caspase1、IL-1β表達(dá)

討 論

脂質(zhì)異常與AMD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。脂質(zhì)代謝在視網(wǎng)膜受到精密的調(diào)節(jié)，其失調(diào)可引起RPE細(xì)胞和Bruch膜內(nèi)脂質(zhì)蓄積[4]。RPE細(xì)胞內(nèi)氧化脂質(zhì)累積引起炎癥發(fā)生，POS吞噬代謝受阻，誘發(fā)RPE細(xì)胞功能障礙，感光細(xì)胞凋亡。黃斑區(qū)高氧化環(huán)境促進(jìn)過度蓄積的脂質(zhì)過氧化，RPE的抗氧化能力隨著年齡的增長逐漸降低，進(jìn)而誘發(fā)炎癥，導(dǎo)致AMD進(jìn)展[5]。RPE細(xì)胞在眼內(nèi)脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。RPE細(xì)胞表達(dá)多種脂蛋白，加工、修飾、降解來自全身和眼內(nèi)局部的脂質(zhì)。RPE細(xì)胞分泌apoB100，避免脂質(zhì)積累引起凋亡損傷[15，16]。同時(shí)，RPE細(xì)胞具備主動(dòng)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，線粒體膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TPSO)增加膽固醇從RPE細(xì)胞到ApoE、ApoI和HDL的流出，并且隨年齡增長，TPSO分泌減少[17]。過度蓄積的氧化脂質(zhì)可以誘導(dǎo)一系列炎癥因子合成，包括TNFα、IL-1β、IL-6等[18]，并顯著增強(qiáng)1-42淀粉樣蛋白對人神經(jīng)元的促凋亡和壞死作用[19]。我們以往報(bào)道了玻璃膜疣的重要成分7-酮膽固醇致炎作用并導(dǎo)致感光細(xì)胞功能障礙，促進(jìn)視網(wǎng)膜發(fā)生AMD樣病理改變[8]。

LXR是一種配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于全身各個(gè)細(xì)胞、器官。研究發(fā)現(xiàn)，LXR參與脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，同時(shí)也調(diào)控體內(nèi)多種炎癥因子的表達(dá)而參與炎癥反應(yīng)，與AMD發(fā)生關(guān)系密切[20]。LXR調(diào)節(jié)RPE頂端和基底膜的ABCA1表達(dá)，參與RPE脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，維持RPE脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)，該通路受損可引發(fā)視網(wǎng)膜膜脂紊亂[21]。LXRα缺失導(dǎo)致小鼠視功能受損，視網(wǎng)膜外層脂質(zhì)累積和炎癥因子的上調(diào)[22]。另外，LXRα-ABCA1軸可緩解Aβ1-40誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞炎癥和衰老反應(yīng)[13]。過氧化脂質(zhì)誘導(dǎo)RPE細(xì)胞炎癥發(fā)生，我們推測LXR是RPE細(xì)胞脂質(zhì)代謝與炎癥調(diào)節(jié)的中心，可能成為干性AMD的潛在治療靶點(diǎn)。

本研究證實(shí)，GW3965通過同時(shí)激活LXRα、LXRβ，上調(diào)ABCA1表達(dá)，促進(jìn)RPE細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝與清除。LXRs的激活不僅減少過氧化脂質(zhì)堆積，并減少RPE細(xì)胞凋亡。同時(shí)，GW3965通過調(diào)節(jié)LXRβ-Caspase1-IL-1β，導(dǎo)致RPE細(xì)胞晚期凋亡、壞死，而LXRα則與RPE細(xì)胞早期凋亡關(guān)系更密切。綜上所述，LXRs通過調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞脂質(zhì)代謝，改善氧化脂質(zhì)對RPE細(xì)胞的損傷，并通過LXRβ-Caspase1-IL-1β通路減少RPE保護(hù)RPE細(xì)胞。但LXRα通過何種途徑減少RPE早期凋亡的機(jī)制仍不清楚，兩種分型對脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用有何異同也暫不清楚，有待進(jìn)一步觀察和研究。