謝麗蓉 顧青 尹莉莉

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是一種進行性中心視力損害性疾病，是發(fā)達國家老年人不可逆盲的主要原因。由于經濟的發(fā)展和人口的老齡化，近年來在國內的發(fā)病率也不斷攀升[1]。AMD的發(fā)病機制錯綜復雜，流行病學調查顯示，多種脂質生物學功能相關的遺傳變異與AMD相關[2]；代謝組學分析發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝通路是AMD發(fā)生發(fā)展相關通路[3]。此外，干性AMD的重要病理特征-玻璃膜疣內富含脂質，提示脂質代謝紊亂是AMD病理改變的重要因素[4]。脂質代謝失調引起視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium，RPE)和Bruch膜內脂質堆積，在黃斑的高氧化應激環(huán)境下氧化為氧固醇[5]，進一步沉積形成玻璃膜疣[6]。氧固醇具有促炎作用，炎癥反之促進玻璃膜疣的形成和RPE細胞變性，加快AMD的發(fā)生發(fā)展[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)氧固醇的一種7-酮膽固醇沉積于視網膜，引起視網膜炎癥和感光細胞功能障礙，進而導致AMD樣變的發(fā)生和發(fā)展[8]。

LXR屬于核受體超家族，包括LXRα和LXRβ，是哺乳動物脂質穩(wěn)態(tài)的關鍵調節(jié)因子，調控各個組織膽固醇的攝取、轉運、外排[9]，對炎癥的調節(jié)也有重要作用[10]。已有研究表明激活LXR可以上調ABCA1、ApoE等載脂蛋白的表達，增加膽固醇外流，促進膽固醇逆向轉運[11]。此外，研究發(fā)現(xiàn)LXR激活后可抑制腫瘤壞死因子-α、單核細胞趨化蛋白1、一氧化氮合酶等炎癥因子表達[12]，LXR激動劑可通過NF-κB信號通路減少Amyloid β對視網膜的炎癥作用[13]。本研究擬探討LXR激動劑對視網膜過氧化脂質堆積的調節(jié)和炎癥改善作用，并探究其機制，為視網膜脂質沉積變性的治療提供更多可能性。

資料與方法

一、材料

實驗研究。(1)ARPE-19細胞：購自美國模式菌種收集中心(ATCC)；(2)藥物試劑：胎牛血清、抗菌素(Gibco，德國)；GW3965(Selleck公司，美國)；7-酮膽固醇、油紅O、DMSO、Trition X-100(Sigma公司，美國)；LXRα、LXRβ、ABCA1抗體(Abcam公司，英國)；lipo2000(Thermo公司，美國)；7-酮膽固醇抗體(Novus biologics公司，美國)；siLXRα、si LXRβ(河馬生物，浙江)；micro syringe、needle(Hamilton，美國)；CY3標記山羊抗兔二抗(Jackson，美國)；山羊血清(博士德生物，武漢)；DAPI(碧云天)；Annexin-V/PI試劑盒(Biosharp，中國)；ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(諾唯贊，中國南京)

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：ARPE-19細胞購自ATCC，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、2 mmol / l谷氨酰胺、100 IU / ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于5%CO2的濕潤培養(yǎng)箱中。更換培養(yǎng)基并及時傳代，取生長狀態(tài)良好的第5～8代細胞進行后續(xù)實驗。

2.CCK-8篩選藥物最佳濃度：將ARPE-19細胞懸液(100 μl/孔)接種于96孔板中，置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；分別加入不同濃度激動劑GW3965(1.5 μM、2 μM、2.5 μM、3 μM)，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中孵育48 h；取出后，CCK-8作用2 h，用酶標儀測定各組在450 nm處的吸光度。

3.7-酮膽固醇免疫熒光染色：ARPE-19細胞懸液加入24孔板中，分為4組，control、DMSO、GW3965、7 kCh組，待細胞生長融合至70%，更換無血清培養(yǎng)基24 h，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，除control組以外添加7 kCh(20 μM)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，無菌PBS清洗3遍，4%多聚甲醛固定20 min，PBS清洗3遍。10%山羊血清室溫封閉2 h，PBS洗3次，孵育7 kCh(1:100)一抗4 ℃過夜。CY3標記熒光二抗(1:500)室溫孵育2 h，DAPI復染30 min，萊卡共聚焦熒光顯微鏡(Leica TCS NT，Wetzlar，Germany)拍照。

4.油紅O染色：ARPE-19細胞懸液加入放好爬片的24孔板中，分為4組，control、DMSO、GW3965、7 kCh組，待細胞生長融合至70%，更換無血清培養(yǎng)基24 h，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，實驗組均置于含7 kCh(20 μM)培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)基，PBS漂洗3次，4%4 ℃多聚甲醛固定20 min。PBS再次漂洗2次，油紅O(0.3 g/mL)37 ℃染色20～30 min。60%異丙醇漂洗5 s，然后立刻PBS漂洗2～3次。蘇木素復染40 s，水洗2～3 min，顯微鏡(Olympus BX53，日本)下觀察。

5.siRNA轉染分別敲低LXRα、LXRβ表達：ARPE-19分為6組，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ組，待細胞生長融合至50%，更換無血清培養(yǎng)基，分別加入混有siLXRα或siLXRβ RNA與lipo2000的試劑，轉染6 h后更換血清培養(yǎng)基作用24 h，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，將后四組置于含7 kCh(20 μM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

6.qPCR檢測ARPE-19細胞內IL-1β、Caspase 1的表達：ARPE細胞分為6組，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ組，如前所述轉染，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，于含7 kCh(20 μM)培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。Trizol提取各組RNA，用HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)和ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix逆轉并擴增。檢測時每個樣品設置兩個副孔，并計算平均Ct值作為最終Ct值，以actin作為內參將數(shù)據(jù)標準化,每組實驗重復3次，引物序列見表1。

7.Annexin-V/PI染色檢測ARPE-19細胞凋亡：ARPE細胞分為6組，control、DMSO、GW3965、7 kCh、siLXRα、siLXRβ組，如前所述轉染，然后分別加入GW3965(2 μM)、DMSO(0.2%)，置于7 kCh(20 μM)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。胰酶消化得到6組單細胞懸液(106/ml)，加入熒光染料37 ℃孵育30 min，流式細胞儀(CYTOFLEX；貝克曼庫爾特公司，美國)檢測，激發(fā)光波長488 nm，515 nm濾器檢測FITC熒光，570 nm濾器檢測PI。

結 果

一、篩選激動劑最佳濃度

CCK8結果顯示：GW3965濃度在1.5、2 μM時對RPE細胞的增殖活力沒有明顯影響，當濃度大于2.5時細胞增殖活力隨濃度上升而下降(圖1)。

不同濃度GW3965作用下ARPE-19細胞CCK-8檢測

二、LXRs激活減少RPE細胞7-酮膽固醇堆積

C、O：7 kCh染色陰性；G、K：7 kCh染色陽性；D：RPE細胞內無脂滴沉積；H、L：RPE細胞內大量脂滴沉積；P：RPE細胞內幾乎無脂滴沉積。

ARPE-19細胞免疫熒光染色顯示：與未經 7 kCh處理的control組相比，7 kCh組RPE細胞內免疫陽性細胞增加(圖2C、K)，表明7 kCh沉積在RPE細胞中；用激動劑GW3965處理的細胞與DMSO處理的對照組相比，細胞內陽性顆粒減少，說明GW3965減少7 kCh在RPE細胞中堆積(圖2G、O)。油紅染色也證實了這一點：control組細胞內脂滴較7 kCh組少(圖2D、L)，DMSO組與7 kCh組細胞內脂滴無明顯差異(圖2H、L)，GW3965組細胞內脂滴比7 kCh、DMSO組明顯減少(圖2H、L、P)，表明LXR激動劑處理減少7 kCh在RPE細胞中堆積。

圖2 免疫熒光及油紅O染色檢測RPE細胞內脂質沉積情況

三、LXRs激活減少RPE細胞凋亡

LL，活細胞：Annexin V陰性/PI陽性；LR，早期凋亡細胞：Annexin V陽性/PI陰性；UR，晚期凋亡細胞：Annexin V陽性/PI陽性;UL，壞死細胞：Annexin V陰性/PI陽性。每個象限中的數(shù)字代表細胞出現(xiàn)在該象限的百分比。

ARPE-19細胞Annexin V/PI檢測顯示：與control組相比，7 kCh、DMSO組凋亡細胞分別上調9.94%、9.62%(圖3A、B、C)；GW3965與7 kCh共同作用RPE細胞后，凋亡細胞較control組僅上調1.92%(圖3D)，表明GW3965減少7 kCh誘導的RPE細胞早期凋亡；敲低LXRα同時7 kCh培養(yǎng)RPE細胞，早期凋亡細胞增加19.46%(圖3E)，而敲低LXRβ同時7 kCh培養(yǎng)RPE細胞，早期凋亡細胞與7 kCh組無明顯差異，但晚期凋亡細胞明顯增加(圖3F)。

圖3 Annexin V/PI染色檢測ARPE-19細胞早期凋亡

LXRs激活ABCA1、減少7 kCh引起的IL-1β和Caspase 1上調

A-E：DMSO、7 kCh、GW3965、siLXRα、siLXRβ分別與control組比較

q-PCR結果顯示：LXR激動劑增加LXRα、LXRβ、ABCA1表達量(圖4A、B、E)，說明LXR激動劑可以增加ABCA1的表達；7 kCh作為LXRs的配體，對LXRs同樣有激活作用(圖4A、B)；7 kCh增加RPE細胞內Caspase1、IL-1β表達，而LXR激動劑減少7 kCh引起的這種反應(圖4C、D)；抑制LXRβ表達后，Caspase1、IL-1β表達量增加，而抑制LXRα后，與7 kCh組相比，Caspase1、IL-1β表達量無明顯變化(圖4C、D)，說明在此炎癥通路中LXRβ起主要抑制作用。

圖4 RT-PCR檢測ARPE-19細胞LXRα、LXRβ、ABCA1、caspase1、IL-1β表達

討 論

脂質異常與AMD的發(fā)生發(fā)展密切相關[14]。脂質代謝在視網膜受到精密的調節(jié)，其失調可引起RPE細胞和Bruch膜內脂質蓄積[4]。RPE細胞內氧化脂質累積引起炎癥發(fā)生，POS吞噬代謝受阻，誘發(fā)RPE細胞功能障礙，感光細胞凋亡。黃斑區(qū)高氧化環(huán)境促進過度蓄積的脂質過氧化，RPE的抗氧化能力隨著年齡的增長逐漸降低，進而誘發(fā)炎癥，導致AMD進展[5]。RPE細胞在眼內脂質代謝調節(jié)中起重要作用。RPE細胞表達多種脂蛋白，加工、修飾、降解來自全身和眼內局部的脂質。RPE細胞分泌apoB100，避免脂質積累引起凋亡損傷[15，16]。同時，RPE細胞具備主動膽固醇逆向轉運系統(tǒng)，線粒體膽固醇逆向轉運蛋白(TPSO)增加膽固醇從RPE細胞到ApoE、ApoI和HDL的流出，并且隨年齡增長，TPSO分泌減少[17]。過度蓄積的氧化脂質可以誘導一系列炎癥因子合成，包括TNFα、IL-1β、IL-6等[18]，并顯著增強1-42淀粉樣蛋白對人神經元的促凋亡和壞死作用[19]。我們以往報道了玻璃膜疣的重要成分7-酮膽固醇致炎作用并導致感光細胞功能障礙，促進視網膜發(fā)生AMD樣病理改變[8]。

LXR是一種配體激活的核轉錄因子，廣泛存在于全身各個細胞、器官。研究發(fā)現(xiàn)，LXR參與脂質代謝的調節(jié)，同時也調控體內多種炎癥因子的表達而參與炎癥反應，與AMD發(fā)生關系密切[20]。LXR調節(jié)RPE頂端和基底膜的ABCA1表達，參與RPE脂質代謝的調節(jié)，維持RPE脂質代謝穩(wěn)態(tài)，該通路受損可引發(fā)視網膜膜脂紊亂[21]。LXRα缺失導致小鼠視功能受損，視網膜外層脂質累積和炎癥因子的上調[22]。另外，LXRα-ABCA1軸可緩解Aβ1-40誘導的RPE細胞炎癥和衰老反應[13]。過氧化脂質誘導RPE細胞炎癥發(fā)生，我們推測LXR是RPE細胞脂質代謝與炎癥調節(jié)的中心，可能成為干性AMD的潛在治療靶點。

本研究證實，GW3965通過同時激活LXRα、LXRβ，上調ABCA1表達，促進RPE細胞內脂質代謝與清除。LXRs的激活不僅減少過氧化脂質堆積，并減少RPE細胞凋亡。同時，GW3965通過調節(jié)LXRβ-Caspase1-IL-1β，導致RPE細胞晚期凋亡、壞死，而LXRα則與RPE細胞早期凋亡關系更密切。綜上所述，LXRs通過調節(jié)RPE細胞脂質代謝，改善氧化脂質對RPE細胞的損傷，并通過LXRβ-Caspase1-IL-1β通路減少RPE保護RPE細胞。但LXRα通過何種途徑減少RPE早期凋亡的機制仍不清楚，兩種分型對脂質代謝的調節(jié)作用有何異同也暫不清楚，有待進一步觀察和研究。