廖 楊 易 瓊 丁 燦 戴飛躍

1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南省長沙市 410208； 2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是臨床上常見的消化系統(tǒng)危重癥，多指急性胰腺炎(Acute pancreatitis,AP)持續(xù)進(jìn)展至伴有單個或多個器官功能障礙，伴有胰腺或胰周組織液體積滯、壞死甚至形成假性囊腫或膿腫形成[1]。該病進(jìn)展快，可迅速累及全身多個系統(tǒng)，甚至危及生命，病死率高達(dá)20%以上[2]。目前研究證實中醫(yī)藥治療重癥急性胰腺炎具有顯著療效。深入研究中醫(yī)藥對SAP的作用機(jī)制，對進(jìn)一步采用中醫(yī)藥干預(yù)治療胰腺炎提供客觀依據(jù)具有重大意義。目前認(rèn)為重癥急性胰腺炎中醫(yī)病名當(dāng)屬“腹痛”，可劃歸“胃心痛、脾心痛、胰癉”等范疇，而腑氣不通、瘀毒內(nèi)蘊(yùn)是其主要病機(jī)，攻里通下是主要治則[3]。在具有鮮明的陽明腑實證候重癥急性胰腺炎患者中，主張應(yīng)用承氣湯類攻下通腑[4]。“大黃—枳實”藥對見于眾多用于治療SAP的通腑瀉下方劑中，如大承氣湯、小承氣湯、大柴胡湯、復(fù)方清胰湯等。大黃具有攻積導(dǎo)滯、清熱解毒、涼血逐瘀等功效，枳實能破氣消積，二者合用具有促進(jìn)胃蠕動，保護(hù)腸道的生物、免疫、機(jī)械屏障，預(yù)防腸源性內(nèi)毒素血癥[5]，此外還具有抗炎、改善胰腺微循環(huán)等作用[6]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，深入挖掘藥物、疾病相關(guān)靶點信息，搭建藥物—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)，挖掘其深層微觀聯(lián)系，進(jìn)而探析“大黃—枳實”藥對用于治療重癥急性胰腺炎的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大黃、枳實主要活性成分的篩選 通過使用TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php/)平臺對大黃、枳實2味中藥進(jìn)行藥物有效活性成分檢索，并對檢索結(jié)果進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(Drug-likeness,DL)≥0.18。將符合篩選標(biāo)準(zhǔn)的活性成分用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計。

1.2 藥物活性成分和疾病靶點預(yù)測 使用PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫獲取活性成分的2D化學(xué)結(jié)構(gòu)式，無法獲取結(jié)構(gòu)式的成分則剔除；將獲取的2D化學(xué)結(jié)構(gòu)式依次導(dǎo)入Swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)平臺進(jìn)行“鉤靶”，無法獲取相應(yīng)靶點信息的成分則從本研究中剔除，最后將各成分檢索到的靶點信息使用Excel 2016進(jìn)行匯總并刪重。

使用GeneCards(https://www.genecards.org)數(shù)據(jù)庫以“Severe Acute Pancreatitis”為關(guān)鍵詞檢索，即可獲取重癥急性胰腺炎的相關(guān)靶點信息，同樣采用Excel 2016進(jìn)行匯總。限定篩選標(biāo)準(zhǔn)為Relevance score≥20，最后得到本研究使用的疾病靶點信息。

1.3 疾病—藥物共同靶點篩選 使用在線作圖(http://bioinfo.genotoul.fr/jvenn/example.html)對疾病與藥物靶點進(jìn)行構(gòu)建韋恩圖，用D-Z代表大黃—枳實活性成分靶點、SAP代表重癥急性胰腺炎靶點，兩者取交集得到大黃—枳實可能作用于SAP的靶點信息。

1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將共同靶點信息導(dǎo)入到STRING 11.0 (https://string-db.org/cgi/input.pl)在線數(shù)據(jù)庫，選擇Multiple proteins項目，物種選擇為Homo sapiens，設(shè)定置信度為>0.9，其他參數(shù)為默認(rèn)值,從而獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(Protein-protein interaction,PPI)。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的TSV格式數(shù)據(jù)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件得到各共同靶點的Degree值，將得到的數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel 2016并繪制條形圖。

1.5 共同靶點的GO功能分析和KEGG富集分析 運用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html)平臺對疾病—藥物共同靶點進(jìn)行GO功能分析和KEGG通路富集分析，參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值，將結(jié)果導(dǎo)出至Excel 2016進(jìn)行匯總并將各個項目按所富集的靶點數(shù)量排序，對排序靠前的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.6 藥物—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以KEGG富集分析結(jié)果為基礎(chǔ)使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建藥物—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)合運行數(shù)據(jù)結(jié)果得到大黃—枳實藥對治療重癥急性胰腺炎的關(guān)鍵活性成分及關(guān)鍵靶點。

2 結(jié)果

2.1 篩選大黃—枳實藥對活性成分 通過使用TCMSP數(shù)據(jù)庫對大黃、枳實2味中藥進(jìn)行活性成分檢索，共檢索到大黃92種、枳實65種，經(jīng)篩選標(biāo)準(zhǔn)(OB≥30%和DL≥0.18)選擇后得到大黃16種、枳實22種；再將無法在PuBChem獲取化學(xué)結(jié)構(gòu)式以及無法在SWISS Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測靶點的活性成分剔除，最終得到活性成分大黃8種、枳實21種，如圖1所示。

圖1 大黃—枳實藥對各活性成分

2.2 活性成分和疾病靶點預(yù)測 將以上所獲取到的活性成分在PuBChem數(shù)據(jù)庫獲取其SDF格式的化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖片，再將圖片提交至SWISS Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測相關(guān)靶點，共預(yù)測到有效靶點1 344個，經(jīng)合并刪重后得到大黃—枳實藥對活性成分靶點335個。

在GeneCards平臺以“Severe Acute Pancreatitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行靶標(biāo)檢索，經(jīng)篩選條件后，最后得到本研究使用的疾病靶點604個。

2.3 構(gòu)建韋恩圖 將重癥急性胰腺炎相關(guān)靶點及大黃—枳實藥對活性成分靶點導(dǎo)入在線作圖平臺構(gòu)建韋恩圖。如圖2所示，D-Z表示大黃—枳實藥對活性成分靶點、SAP表示重癥急性胰腺炎靶點，兩者取交集得到藥物疾病共同靶點信息共86個。

圖2 大黃—枳實藥對與SAP韋恩圖(PPI)

2.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將86個共同靶點信息導(dǎo)入String 11.0平臺以構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置Minimum required interaction score為0.9(highest confidence)，并選擇隱藏單獨游離靶點，最后得到PPI圖，其中包含73個節(jié)點，307條互作邊，如圖3所示。同時將PPI數(shù)據(jù)結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出至Cytoscape 3.7.2運算出各靶點的Degree，將結(jié)果用Excel 2016進(jìn)行統(tǒng)計、整理，并繪制簇狀條形圖(Degree值排序前20)，如圖4所示。

圖3 共同靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 Degree值排序前20的相關(guān)共同靶點簇狀條形圖

2.5 共同靶點的GO功能分析 將86個共同靶點

信息導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫平臺Metascape進(jìn)行GO功能分析，默認(rèn)設(shè)定值。GO功能分析由細(xì)胞組成(CC)、生物過程(BP)、分子功能(MF)三部分組成。將結(jié)果導(dǎo)出后按各項目靶點數(shù)量排序，各取前15條使用微生信在線作圖平臺(http://www.bioinformatics.com.cn)進(jìn)行可視化處理，如圖5所示。由下圖可知，靶點在生物過程主要富集于positive regulation of cell migration、positive regulation of cell motility、positive regulation of kinase activity等；在分子功能主要富集于kinase activity、phosphotransferase activity、alcohol group as acceptor、protein kinase activity、protein domain specific binding等；在細(xì)胞組成主要富集于receptor complex、membrane microdomain、membrane raft、membrane region等。

2.6 共同靶點的KEGG通路富集分析 將86個共同靶點信息導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫行KEGG通路富集分析。將結(jié)果導(dǎo)出并按靶點富集數(shù)量排序，對前20條通路運用imageGP在線作圖(http://www.ehbio.com/ImageGP/)進(jìn)行可視化處理。得到KEGG通路富集氣泡圖(圖6)。X軸表示富集于某通路的靶點在該富集通路總靶點中的所占比，Y軸表示各通路名稱，顏色變化與negLog10_Qvalue相關(guān)，氣泡大小與Count值相關(guān)。由圖可知，共同靶點富集于Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway等信號通路上。

2.7 藥物—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)KEGG分析結(jié)果，結(jié)合篩選到的活性成分及共同靶點信息，基于KEGG通路富集分析結(jié)果中前20條通路，使用Cytoscape 3.7.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析后構(gòu)建藥物—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)，見圖7(注：圖中黃色倒三角形為信號通路，正八邊形為藥物活性成分，藍(lán)色菱形為共同靶點)。同時將網(wǎng)絡(luò)分析數(shù)據(jù)文件以CSV格式導(dǎo)出(表略)。結(jié)果顯示蘆薈大黃素—大黃素—二蒽(palmidin A)、甜橙黃酮(Sinensetin)、澤蘭黃醇(EUPATIN)、異橙黃酮(Isosinensetin)、5,7,4-三甲氧基黃酮(5,7,4’-Trimethylapigenin)、木犀草素(Luteolin)等可能是大黃—枳實藥對中治療重癥急性胰腺炎的主要活性成分；AKT1、EGFR、MAPK1、PIK3R1、MAP2K1可能是大黃—枳實藥對治療重癥急性胰腺炎的關(guān)鍵靶點。

圖6KEGG通路富集氣泡圖

圖7 活性成分—靶點—通路網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

在重癥急性胰腺炎中存在胰腺組織的壞死與凋亡、局部微循環(huán)障礙、胃腸道功能紊亂甚至腸源性內(nèi)毒素血癥，以上可形成惡性循環(huán)， 促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生、放大，誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征，在大量炎癥介質(zhì)作用下，累及多個器官系統(tǒng)時可進(jìn)展為多臟器功能障礙綜合征。因此在SAP早期予以合適地抑制炎癥反應(yīng)，改善胰腺局部微循環(huán)，保護(hù)腸道屏障功能，調(diào)節(jié)胃腸蠕動等是治療的關(guān)鍵。中醫(yī)認(rèn)為重癥急性胰腺炎病機(jī)為腑氣不通、瘀毒內(nèi)蘊(yùn)。迄今為止，有諸多中藥方劑用于SAP的治療，相關(guān)臨床研究也不在少數(shù)，方中大都使用大黃枳實配伍，但其具體作用機(jī)制仍有待完善，本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，檢索出大黃—枳實藥對的主要活性成分、疾病—藥物靶點信息及相關(guān)通路，試分析其可能的機(jī)制。

蘆薈大黃素—大黃素—二蒽(palmidin A)是蘆薈大黃素與大黃素形成的復(fù)合物，具有二者的相同活性，有很強(qiáng)的抗炎抑菌作用。研究表明它能降低SAP大鼠模型血清中的TNF-α、IL-6水平，減輕胰腺組織損傷，且得到病理切片結(jié)果支持[7]。大黃素可通過作用于NF-κB信號通路抑制炎癥反應(yīng)、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)揮改善微循環(huán)作用[8]。陳銀芳等[9]使用富含有蘆薈大黃素溶液腹腔給藥作用于AP大鼠模型，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素等可能通過NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎效應(yīng)而對胰腺炎具有治療作用。此外，大黃素能通過調(diào)節(jié)腸黏膜細(xì)胞的凋亡，在SAP中起到保護(hù)其腸道屏障、減少腸道毒素吸收的作用[10]。甜橙黃酮(Sinensetin)同樣具有很好的抗炎活性。甜橙黃酮通過調(diào)節(jié)NF-κB信號通路中抑制蛋白IκB-α水平，降低下游炎癥介質(zhì)表達(dá)而抑制炎癥反應(yīng)[11]。木犀草素(Luteolin)具有抗炎、抗氧化等廣泛作用。王小春等[12]研究表明木犀草素可通過作用NF-κB、MAPK通路，下調(diào)炎癥因子表達(dá)，發(fā)揮抗炎和保護(hù)胰腺組織作用。研究認(rèn)為5,7,4-三甲氧基黃酮是一種良好的擴(kuò)血管物質(zhì)，可通過NO介導(dǎo)而實現(xiàn)[13]。篩選結(jié)果中排名靠前的澤蘭黃醇(EUPATIN)、異橙黃酮(Isosinensetin)的臨床藥理研究國內(nèi)外暫少見，或可由此作為切入點開展新的研究。

AKT1又稱蛋白激酶B，和PIK3R1均是PI3K-Akt信號通路中的重要組分，可以調(diào)節(jié)增殖、分化、凋亡等細(xì)胞功能。AKT1在SAP中具有雙向調(diào)節(jié)作用，據(jù)研究AKT1的活化可能對促進(jìn)胰腺組織再生和胰腺功能恢復(fù)有作用[14]，通過抑制AKT1活性能夠降低NF-κB核異位并抑制胰蛋白酶活性，減輕胰腺炎癥和局部組織損傷[15]。EGFR參與了多個信號通路過程，如在NSCLC中EGFR參與激活了PI3K/Akt、NF-κB、JAK/STAT、MAPK等信號通路[16]。MAPK1、MAPK3作為MAPK通路中的重要組分，參與了調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯等生物過程進(jìn)而可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化等。

根據(jù)研究結(jié)果分析得出大黃—枳實藥對通過多成分、多靶點、多通路在重癥急性胰腺炎中發(fā)揮抗炎、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)胃腸功能等作用，還可通過調(diào)控胰腺細(xì)胞的增殖與凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。目前關(guān)于大黃—枳實治療SAP臨床試驗眾多，已取得諸多成果，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法為研究其作用機(jī)制補(bǔ)充新的線索，但限于數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)統(tǒng)計、網(wǎng)絡(luò)運算、軟件功能等不可控因素，研究結(jié)果仍需進(jìn)行大量實驗客觀論證。