李建興，楊睿寧，蔡 聰，沈 亮，羅 堪

(福建工程學(xué)院電子電氣與物理學(xué)院，福建 福州 350117)

0 引言

1985年，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR[1-2])技術(shù)由美國Cetus公司的Kary Mullis發(fā)明。此后，其迅速發(fā)展成為一種能夠廣泛應(yīng)用于擴增特定核酸片段的分子生物學(xué)技術(shù)[3-5]。PCR儀是通過控制樣品DNA在變性、退火與延伸三個步驟按預(yù)設(shè)的反應(yīng)流程進行溫度循環(huán)控制后,將DNA片段成倍擴增的儀器。目前，市場上較為常見的實時定量PCR儀價格昂貴，且大多為固定實驗室科研使用。小型化PCR儀的研發(fā)對現(xiàn)場應(yīng)急檢測及推進基礎(chǔ)醫(yī)療點建設(shè)有著深遠的意義[6]。因此，研發(fā)易操作、低成本、高精度的小型化PCR儀是當(dāng)下的迫切需求。

針對小型化PCR設(shè)計，美國賓夕法尼亞大學(xué)的Liao[7]等采用全新的基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification,LAMP[8])方案，通過化學(xué)發(fā)熱的方法提供相對恒定的溫度環(huán)境(60～65 ℃)進行DNA擴增反應(yīng)。但LAMP方法對引物有較高的要求，且LAMP的靈敏度反而大大低于PCR。VKD Oliveira[9]等為了降低儀器價格并簡化溫度單元結(jié)構(gòu)，將傳統(tǒng)的印刷電路板(printed circuit board,PCB)作為加熱元件，使用計算機風(fēng)扇進行制冷，設(shè)備成本約為350元，最大升/降溫速率可達到2.0 ℃/s，并可以完成對單個試管內(nèi)DNA樣品的檢測。該方案雖然可以大幅降低PCR儀成本，但其溫度單元設(shè)計方案僅可對單個樣品進行反應(yīng)且控制精度較低。PCR反應(yīng)體積減小后，更容易受到外界波動的影響。因此，要保證高精確度快速控溫，在溫度單元優(yōu)化以及控制算法設(shè)計等方面仍需進一步研究。

本文通過對PCR儀溫度單元進行小型化設(shè)計，并提出有限元結(jié)合遺傳算法對基座熱包覆結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。采用基于H橋驅(qū)動器的分段比例積分微分(proportional integral differential,PID)溫度控制方案實現(xiàn)小型化PCR溫度循環(huán)控制，搭建了圖形用戶界面(graphic user interface,GUI)以及小型化16孔PCR儀樣機。最終通過對樣機溫度單元性能指標(biāo)(快速性，即升/降溫速率；準(zhǔn)確性，即穩(wěn)態(tài)誤差；均勻性即基座表面溫度均勻性)設(shè)計相應(yīng)試驗，測試并驗證本文所采取優(yōu)化方案成效，對該樣機性能通過致病疫霉菌DNA擴增試驗進行了表征。

1 小型化PCR系統(tǒng)設(shè)計

本文設(shè)計了一款小型化16孔PCR樣機系統(tǒng)。系統(tǒng)架構(gòu)主要由溫度單元、控制器及GUI組成。

系統(tǒng)預(yù)制定指標(biāo)為升/降溫速率分別達到2.5 ℃/s與2 ℃/s，穩(wěn)態(tài)誤差在±0.4 ℃內(nèi)且基座試管孔間溫度均勻性<0.4 ℃。所設(shè)計的小型化PCR溫度單元包含了PCR基座、PT1000熱電阻、半導(dǎo)體制冷片及散熱裝置。通過NI myRIO獲得PT1000熱電阻測得的基座溫度，并利用所設(shè)計的分段PID控制算法對H橋驅(qū)動器脈沖寬度調(diào)劑(pulse width modulation,PWM)輸入占空比進行整定，實現(xiàn)對半導(dǎo)體制冷片的工作功率及電流方向控制。同時，設(shè)計GUI實現(xiàn)對PCR循環(huán)參數(shù)及控制器參數(shù)的設(shè)定與實時數(shù)據(jù)的分析。

小型化PCR樣機系統(tǒng)架構(gòu)如圖1所示。

圖1 小型化PCR樣機系統(tǒng)架構(gòu)圖Fig.1 Miniaturized PCR prototype system architecture diagram

1.1 小型化PCR溫度單元設(shè)計

小型化PCR儀溫度單元設(shè)計如圖2所示。

圖2 小型化PCR儀溫度單元設(shè)計Fig.2 Design of miniaturized PCR instrument temperature unit

圖2(a)為基座與溫度循環(huán)部分的3D結(jié)構(gòu)圖。該結(jié)構(gòu)總體尺寸為120 mm×120 mm×90 mm，質(zhì)量為0.5 kg，搭建成本約為600元,外接24 V電源進行工作。PCR儀基座選用傳熱性能良好、密度小、價格較低的鋁合金進行制造，尺寸為40 mm×40 mm×14 mm；于基座側(cè)壁中開相應(yīng)孔位，安裝PT1000熱電阻；反應(yīng)槽根據(jù)0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)試管尺寸進行設(shè)計，采用4×4陣列均勻分布于基座上表面，且反應(yīng)槽之間對稱分布著盡可能大的菱形孔，以減小其體積及質(zhì)量、獲得更小的熱容，最終使溫度單元的快速性得到提升。本系統(tǒng)選用由廣東偲瑞電子科技有限公司所研發(fā)的THC1-19912半導(dǎo)體作為執(zhí)行元件。其最大工作功率為130 W，額定最高溫度為200 ℃，尺寸為40 mm×40 mm×3.5 mm(與基座尺寸一致)，可避免因使用多片半導(dǎo)體制冷片所帶來的匹配誤差。半導(dǎo)體制冷片的制冷效率取決于其冷熱端溫度差，而高性能的散熱裝置[10]將對制冷速率的提升發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文根據(jù)制冷片尺寸設(shè)計一鰭片式熱管散熱器，通過將制冷片熱量經(jīng)均熱板由六根鋁制熱管快速傳遞至高密度鋁制散熱鰭片中，由下方轉(zhuǎn)速約為1 600 r/min的風(fēng)扇強制對流實現(xiàn)快速散熱。溫度單元之間各相應(yīng)傳熱單元間均需涂抹導(dǎo)熱硅脂，以確保傳熱效率。

本文所設(shè)計的基座熱包覆部分結(jié)構(gòu)如圖2(b)所示。熱蓋是防止試管內(nèi)試劑反應(yīng)過程中蒸發(fā)后遇冷再液化，對其溫度控制精度要求不高。因此，本文通過在鋁制熱蓋表面開凹槽放置空燒表面溫度穩(wěn)定在約105 ℃陶瓷加熱片可滿足樣機反應(yīng)需求。為提升所設(shè)計的小型化PCR溫度單元內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)定性，使儀器可面向更多工作場景，應(yīng)杜絕溫度單元與外部對流換熱[11]。本文通過在基座側(cè)壁包覆硅酸鋁棉作為保溫材料，并令熱蓋覆蓋于保溫材料四周，構(gòu)建穩(wěn)定熱場。但如基座熱包覆結(jié)構(gòu)厚度選取不適，反而會導(dǎo)致溫度單元動態(tài)性能變差。因此，需要對其進行優(yōu)化。

1.2 基座熱包覆優(yōu)化

為得到最優(yōu)基座熱包覆厚度，傳熱計算分析難以得到精確的結(jié)果，而采用試驗逐一測量將產(chǎn)生過大的時間成本與資源浪費。為此，本文采用有限元仿真結(jié)合遺傳算法，對基座熱包覆厚度進行參數(shù)尋優(yōu)，并使用有限元軟件Comsol Multiphysics對本系統(tǒng)所設(shè)計的溫度單元建立相應(yīng)的有限元模型。PCR溫度單元與包覆保溫材料屬性如表1所示。

表1 PCR溫度單元與包覆保溫材料屬性

通過小型化PCR溫度單元性能指標(biāo) (快速性：升/降溫速率vup、vdown；準(zhǔn)確性，即穩(wěn)態(tài)誤差△Tw；均勻性，即基座上表面中心溫度減去基座上表面邊緣溫度差△Tb)制定相應(yīng)適應(yīng)度函數(shù)ξ，如式(1)所示。各系數(shù)對應(yīng)權(quán)重根據(jù)系統(tǒng)預(yù)制定指標(biāo)比例進行修正。

0.2vdown+ΔTw+ΔTb

(1)

通過使用有限元軟件COMSOL Multiphysics中的MATLAB接口構(gòu)建溫度單元有限元模型，并使用內(nèi)置遺傳算法工具箱[12]完成對基座熱包覆結(jié)構(gòu)厚度的優(yōu)化。遺傳算法優(yōu)化流程如圖3所示。

圖3 遺傳算法優(yōu)化流程圖Fig.3 Genetic algorithm optimization flowchart

設(shè)置種群大小為20、最大迭代次數(shù)為100，并將預(yù)制定指標(biāo)vup≥2.5、vdown≤2、ΔTw≤0.4、ΔTb≤0.4作為約束條件，以1 mm步長在0～100 mm間進行仿真求解運算。最終得到的最優(yōu)熱包覆厚度為19 mm，其適應(yīng)度函數(shù)值為1.207 97。

1.3 分段PID溫度控制策略與實現(xiàn)

PCR反應(yīng)的實質(zhì)是根據(jù)預(yù)設(shè)循環(huán)過程使樣品DNA在變性(94 ℃)、退火(55 ℃)、延伸(72 ℃)三溫區(qū)進行循環(huán)控制。溫度控制的精確性和穩(wěn)定性不足會導(dǎo)致擴增效率降低、非特異性擴增等問題，從而影響試驗結(jié)果。而升溫和降溫速率若過慢，會導(dǎo)致整個PCR過程的反應(yīng)時間大大延長。這在現(xiàn)場快速檢測等應(yīng)用場合是不能被接受的。本文通過控制H橋驅(qū)動器PWM輸入與占空比D，實現(xiàn)對PCR溫度單元溫度循環(huán)的控制，完成對半導(dǎo)體制冷片電流方向及工作功率控制的過程。因此，本文根據(jù)所設(shè)計的PCR溫度單元特性，對工程實際中廣泛應(yīng)用的PID控制方法進行改進。本文設(shè)計的小型化PCR分段PID控制原理如圖4所示。

圖4 小型化PCR分段PID控制原理圖Fig.4 Schematic diagram of miniaturized PCR segmented PID control

本文基于半導(dǎo)體制冷片工作原理，設(shè)置分段控制功能開關(guān)。其工作原理是：當(dāng)循環(huán)過程中輸入溫度與PT1000測得溫度誤差ΔT在2 ℃內(nèi)時切換到升/降溫PID控制器，其余時間令H橋驅(qū)動器PWM輸入占空比D為0.9，即此時半導(dǎo)體制冷片以90%最大工作功率進行工作，從而獲得更快的升/降溫速率。由于半導(dǎo)體制冷片升/降溫最大工作功率存在差別，因此需要對升/降溫過程進行控制器切換。此時采用的PID控制規(guī)律如式(2)所示。

(2)

式中：Kp、Ki、Kd分別為比例、積分、微分參數(shù)；Tblock為PT1000測得基座實時溫度；Tset為設(shè)定溫度。

2 試驗與樣機性能測試

基于上述設(shè)計工作，完成小型化16孔PCR系統(tǒng)的樣機搭建，并設(shè)計相應(yīng)的GUI界面。樣機通過USB連接到計算機，可外接24 V電源進行工作。用戶可通過GUI完成對PCR循環(huán)及控制參數(shù)的設(shè)定，并可對運行過程中實時數(shù)據(jù)進行導(dǎo)出分析。通過設(shè)計結(jié)合有限元仿真溫度場與紅外熱成像儀測試樣機實時熱場對比、試管內(nèi)50 μL試劑實時溫度測試、小鼠基因組鑒定等試驗，分別對樣機優(yōu)化后溫度單元性能指標(biāo)、樣機性能進行驗證。

2.1 優(yōu)化模型準(zhǔn)確性驗證

對基座熱包覆優(yōu)化前后的有限元模型進行仿真。基座變性(94 ℃)仿真穩(wěn)態(tài)熱場如圖5所示。優(yōu)化前，基座表面最高溫為93.733 ℃、最低溫為92.845 ℃。通過對基座熱包覆進行優(yōu)化設(shè)計，最高溫為94.022 ℃、最低溫為93.835 ℃。該結(jié)果表明，優(yōu)化設(shè)計后樣機溫度單元均勻性及穩(wěn)定性均得到大幅提升。

圖5 基座變性(94 ℃)仿真穩(wěn)態(tài)熱場圖Fig.5 Steady-state thermal field diagram of basedenaturation (94 ℃) simulation

使用Flir E6-xt紅外熱成像儀，對樣機在相同參數(shù)下優(yōu)化前后的情況進行采集?；冃?94 ℃)樣機穩(wěn)態(tài)熱場如圖6所示。

圖6 基座變性(94 ℃)樣機穩(wěn)態(tài)熱場圖Fig.6 Steady-state thermal field diagram of base denatured(94 ℃) prototype

基于所測得優(yōu)化前后各孔溫度與設(shè)定值94 ℃的方差進行計算，結(jié)果分別為1.379 3與 0.006 2，孔內(nèi)溫度與設(shè)定值偏離程度得到大幅降低，且基座穩(wěn)態(tài)熱場圖與圖5有限元仿真結(jié)果基本一致。該結(jié)果表明，本文所構(gòu)建的溫度單元有限元模型及優(yōu)化方法是正確且能夠有效提升溫度單元性能指標(biāo)的。

2.2 試劑溫度性能指標(biāo)驗證

本文通過用移液槍加入50 μL水代替試劑，在0.2 mL標(biāo)準(zhǔn)試管蓋處開孔插入PT1000熱電阻測量試管內(nèi)液體溫度。循環(huán)過程中，94 ℃、55 ℃和72 ℃這3個溫區(qū)的維持時間分別設(shè)置為30 s、30 s和60 s。循環(huán)試管內(nèi)液體溫度曲線如圖7所示。

圖7 循環(huán)試管內(nèi)液體溫度曲線Fig.7 Circulating liquid temperature curves in test tube

該結(jié)果表明，樣機試管內(nèi)液體穩(wěn)態(tài)誤差可保持在±0.2 ℃，與有限元分析及紅外熱場結(jié)果相對應(yīng)。升/降溫速率分別可達到2.7 ℃/s及2.2 ℃/s，僅需170 s即可完成一次循環(huán)，符合預(yù)制定指標(biāo)且能大幅縮短PCR反應(yīng)所需時間。

2.3 致病疫霉菌DNA擴增試驗

為驗證樣機性能，本文在該樣機分別放置15個裝有20 μL小鼠DNA樣本進行基因組鑒定，并在反應(yīng)完成后進行凝膠電泳。樣機凝膠電泳結(jié)果如圖8所示。該結(jié)果表明，15份DNA樣品在瓊脂糖凝膠上均有顯示亮帶，證明所開發(fā)樣機可成功實現(xiàn)對DNA樣品的擴增與鑒定，為該樣機的后續(xù)實時化以及商業(yè)化開發(fā)奠定堅實的基礎(chǔ)。

圖8 樣機凝膠電泳結(jié)果示意圖Fig.8 Sample gel electrophoresis results

3 結(jié)論

本文針對所設(shè)計的小型化PCR儀溫度單元進行熱包覆結(jié)構(gòu)優(yōu)化，采用基于H橋驅(qū)動器的分段PID控制方法，搭建了GUI以及16孔PCR儀樣機。樣機溫度單元成本約600元，可外接24 V電源進行工作。該樣機在50 μL反應(yīng)體系下升/降溫速率可分別達到2.7 ℃/s及2.2 ℃/s，穩(wěn)態(tài)誤差小于±0.2 ℃，基座表面溫度均勻性小于0.1 ℃，并可成功對小鼠基因組DNA樣品完成鑒定。該結(jié)果表明，本文所研發(fā)的小型化PCR儀樣機具有低成本、便攜帶、易操作、高性能的特點，能夠為后續(xù)實時化和商業(yè)化的開發(fā)奠定基礎(chǔ)，并對現(xiàn)場快速檢測與推進基礎(chǔ)醫(yī)療點建設(shè)提前部署作好應(yīng)急準(zhǔn)備。