張 濤,劉先姜,江 澄,孫克偉

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,國家中醫(yī)(肝病)臨床研究基地,長沙 410007)

慢加急(亞急)性肝功能衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)是我國肝衰竭中的主要類型,它是在慢性肝病病理損傷(包括慢性炎癥損傷、肝纖維化、肝硬化)基礎(chǔ)上,發(fā)生新的程度不等的肝細(xì)胞壞死性病變[1],如何模擬符合其病理特征的動物模型仍是難點(diǎn)[2]。 本研究通過改進(jìn)目前國內(nèi)公認(rèn)經(jīng)典ACLF 動物造模法,模擬在肝組織纖維化免疫損傷基礎(chǔ)上,腸源性內(nèi)毒素血癥對肝的二次打擊,所導(dǎo)致的肝細(xì)胞大片狀壞死性病變的病理特性。 從肝與腸組織的病理與形態(tài)學(xué)評判該模型是否符合人類慢加急性肝功能衰竭病理特征,為臨床研究構(gòu)建動物模型。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取健康、成年清潔級SD 雄性大鼠85 只,體重(180±10) g,8 周齡,購自長沙市天勤生物科技有限公司[SCXK(湘)2019-0004],飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(湘)2020-0010],研究方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)(ZYFY20190215),并按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA,批號:B150402),購自北京博爾西科技有限公司;脂多糖每支10 mg(SigmaL2880,批號:20170702)購自合肥博美生物科技有限公司;D-半乳糖胺鹽酸鹽每瓶1 g(RuibioG7219,批號:20170812)購自合肥博美生物科技有限公司;完全福氏佐劑F5881、不完全福氏佐劑F5506(批號:SLBL9742V)購自美國Sigma 公司;多聚賴氨酸(批號:SL24191402)購自上海甘源實(shí)業(yè)有限公司;10%福爾馬林溶液(批號:180601)、二甲苯Ⅰ、Ⅱ(批號:061204)、 蘇木精(批號:180301)、2.5%戊二醛(批號:180328)、丙酮(批號:00120727)及硝酸鉛(批號:20180722)購自南昌雨露實(shí)驗(yàn)器材有限公司。 超薄切片機(jī)(廠家:德國萊卡(Leica),型號:EM UC-7);日立透射電鏡(廠家:日立高新技術(shù)公司,型號:HT7700);電子顯微鏡(CX21 FSI 日本奧林巴斯公司);病理圖像分析儀(美國Ewgle Eye Ⅱ型USA)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 生活條件

保持溫度24℃~28℃(最大日溫差距<4℃),相對濕度60%~75%環(huán)境,換氣次數(shù):每小時>15 次,動物籠具處氣流速度:≤0.2 m/s,噪聲:≤60 dB/(A),普通光照:最低工作照度≥200 lx,定期紫外殺菌,晝夜明暗交替時間為12/12 h。 SPF 級顆粒飼料,大鼠滅菌刨花墊料(長沙市天勤生物科技有限公司);飲水為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物房純凈用水。

1.3.2 溶液及藥品配制

(1)牛血清白蛋白乳化液

牛血清白蛋白5 g+0.9% Nacl 5 mL,混勻配制為1000 mg/mL。 取0.5 mL 加入30.75 mL 的0.9%Nacl,配成31.25 mL。 乳化:取牛血清白蛋白液20 mL(320 mg),與20 mL 的福氏不完全佐劑置燒杯內(nèi),超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)上乳化,成乳化液(含牛血清白蛋白8 mg/mL)。

(2)D-氨基半乳糖+脂多糖液(D-Gal+LPS)制備

稱取D-Gal 4000 mg 溶于80 mL 的0.9%的無菌生理鹽水中,然后用pH 值為6.8 的1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)。 精確稱量LPS 2000 μg,加入D-Gal液中,混勻,生理鹽水調(diào)總?cè)莘e為100 mL,負(fù)壓吸引泵過濾,用孔徑0.22 μm 濾紙過濾除菌,處理后的溶液放入無菌瓶中備用,現(xiàn)用現(xiàn)配,腹腔注射劑量為0.5 mL/100 g。 以上操作均在超凈臺中完成。

1.3.3 造模

(1)免疫致敏階段

85 只8 周齡SD 雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分為空白對照大鼠10 只,正常喂食、飲水,余75 只納入造模組,開始實(shí)驗(yàn)動物造模實(shí)驗(yàn)。 選異體牛血清用無菌生理鹽水稀釋(與福氏佐劑乳化),參照Blackwell[3]實(shí)驗(yàn)方法,大鼠免疫致敏階段(34 d),每次0.5 mL 乳化液(內(nèi)含白蛋白4 mg)皮下多點(diǎn)注射。 皮下注射具體時間:為第1 次(實(shí)驗(yàn)第1天):20%牛血清白蛋白+等體積完全福氏佐劑;第2次(實(shí)驗(yàn)第14 天):20%牛血清白蛋白+等體積不完全福氏佐劑;第3 次(實(shí)驗(yàn)第24 天):20%牛血清白蛋白+1/2 體積不完全福氏佐劑;第4 次(實(shí)驗(yàn)第34天):20%牛血清白蛋白不加佐劑。 第4 次注射后10 d,大鼠尾靜脈取血,瓊脂雙向擴(kuò)散法檢測牛血清白蛋白抗體。

(2)免疫攻擊階段

取有陽性抗體的大鼠,尾靜脈注射牛血清白蛋白,2 次/周,每次0.2 mL。 牛血清白蛋白從每次0.5 mg,漸加到每次2 mg,最后至每次5 mg,維持此劑量,共6 周(次)。 6 周末處死2 只大鼠模型,取肝組織做病理觀察,評價肝纖維程度,以臨床相關(guān)指南中有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)為參考,達(dá)到肝纖維化S3-S4 級[4],來判定免疫型肝纖維化造模是否成功。

(3)急性攻擊階段

肝纖維化造模成功后,在此模型基礎(chǔ)上采用一次性腹腔注射LPS+D-Gal 構(gòu)建ACLF 大鼠模型,給藥劑量為:LPS100 μg/kg+D-Gal 200 mg/kg。 隨機(jī)抽取4 只ACLF 大鼠模型及4 只空白對照大鼠,進(jìn)行肝病理切片,HE 染色,光鏡下觀察肝的病理變化,鏡下每個樣本隨機(jī)選取5 個10×20 倍視野,輸入北航病理圖片分析系統(tǒng)測量肝壞死面積、計(jì)算比值,取其平均值。 根據(jù)有關(guān)ACLF 肝組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn):肝細(xì)胞廣泛壞死、溶解壞死≥1/2 肝實(shí)質(zhì)[1],評判造模是否符合人類肝衰竭病理特征。

1.3.4 檢測指標(biāo)及方法

(1)一般情況

各大鼠每天分別稱重,按相應(yīng)體重調(diào)整飲食及飲水量,在給予相應(yīng)飼料后,每天觀察動物進(jìn)食、飲水、行為、活動、精神狀態(tài)、毛發(fā)及二便等情況。

(2)肝組織病理檢測

分離大鼠肝,取距離肝邊緣0.5 cm 處肝左葉組織小塊,大小0.5×0.5×0.5 cm,PBS 涮洗后,于10%福爾馬林溶液中固定12~24 h,石蠟包埋、切片。

(3)腸組織病理檢測

在不中斷血液供應(yīng)時用手術(shù)剪迅速剪下約1 cm 腸管,將其對半剪成兩半,并剪開腸管,用生理鹽水沖洗,放在EP 管中,在戊二醛中固定,4℃保存。

(4)HE 染色病理檢測

取材組織標(biāo)本,4%多聚甲醛中固定,脫水、透明、浸泡、包埋制成石蠟組織塊,超薄切片機(jī)切成4~6 μm 薄片。 進(jìn)行常規(guī)HE 染色,觀察大鼠肝及腸道在光學(xué)顯微鏡下的表現(xiàn)。

(5)透射電鏡觀察腸粘膜超微結(jié)構(gòu)

腸粘膜組織經(jīng)2.5%戊二醛經(jīng)磷酸緩沖液配制固定、脫水、浸泡、包埋、固化,切片50~100 nm,3%醋酸鈾以及硝酸鉛雙染色,日立HT7700 透射電鏡觀察、拍片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

HE 染色和電鏡圖片均通過Image J 圖像分析軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫致敏階段

75 只實(shí)驗(yàn)大鼠,其中66 只尾靜脈血清標(biāo)本產(chǎn)生沉淀線,成功率為88%,與牛血清白蛋白抗體組對照所產(chǎn)生的沉淀線吻接成一線,與文獻(xiàn)[3]相符。

2.2 免疫攻擊階段

使用牛血清白蛋白尾靜脈攻擊6 周后,2 只大鼠肝組織評估均達(dá)到肝纖維化S3-S4 級。 與正常大鼠比較,形成肝纖維化的大鼠在體重、毛發(fā)光澤度、攝食、對外界刺激反應(yīng)靈敏度等方面無明顯差異。 經(jīng)免疫攻擊造后,大鼠肝組織HE 染色光鏡下觀察,可見肝細(xì)胞排列紊亂,部分炎性細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞索破壞,肝細(xì)胞呈片狀壞死,大量纖維間隔形成,分隔并破壞肝小葉至小葉結(jié)構(gòu)異常,部分標(biāo)本可見假小葉形成,如圖1A。 正常大鼠形態(tài)如圖1B。

圖1 肝纖維化HE 染色病理圖片Note. A, Arrangement of hepatocytes was irregular, a little fibrous tissue hyperplasia could be seen around the sinuses,linear short fibrous septa could be seen in the portal area,separated hepatocyte masses showed different degrees of regeneration and pseudolobular formation. B, Arrangement of hepatocytes was regular, the morphology of hepatocytes was normal, the size of hepatocytes was uniform,the hepatic venules and portal areas were normal, and there was no obvious inflammatory infiltration.Figure 1 Pathological picture of hepatic fibrosis with HE staining

2.3 ACLF 大鼠模型評價

2.3.1 大鼠死亡情況

75 只納入模型組實(shí)驗(yàn)大鼠,在免疫致敏階段死亡2 只,模型組大鼠與正常組大鼠在體重、活動度、毛發(fā)光澤度等一般情況方面無明顯差異。 至免疫攻擊階段完成,處死2 只大鼠用于病理評判,死亡5只;6 周末成模59 只,大鼠肝纖維化成模率,與文獻(xiàn)報(bào)道[5]相近。 再予以一次性腹腔注射LPS+D-Gal急性攻擊后,大鼠可見精神萎靡,活動度逐漸減低,部分大鼠有肢體扭曲,呈衰弱貌。 12 h 后,處死4 只大鼠用于病理評判,死亡15 只。 故ACLF 大鼠模型造模成功時,總體死亡率為29.3%(22/75)。

2.3.2 肝組織病理學(xué)評估

肝組織病理結(jié)果顯示,與正常大鼠比較,模型大鼠肝組織出現(xiàn)肝細(xì)胞廣泛性壞死、溶解壞死(≥2/3 肝小葉),肝小葉結(jié)構(gòu)已完全破壞,可以判定肝衰竭造模成功,如圖2A、圖2B。

圖2 肝衰竭大鼠肝HE 染色病理圖片Note. A, Extensive necrosis and dissolution of hepatocytes with a range of more than 2/3, destruction of hepatic cord and diffuse infiltration of red blood cells. B, Disordered arrangement of hepatocytes, extensive fusion necrosis and formation of pseudolobules. A large number of red blood cells with partial inflammatory cell infiltration were found in the portal area.Figure 2 HE staining pathological picture of liver in rats with liver failure

2.3.3 腸粘膜組織光鏡下評估

大鼠腸粘膜組織HE 染色光鏡下觀察,可見腸粘膜結(jié)構(gòu)破壞,細(xì)胞廣泛溶解壞死,大量炎性細(xì)胞浸潤,如圖3A。 正常大鼠形態(tài),如圖3B。

圖3 肝衰竭大鼠腸粘膜組織HE 染色Note. A, Structure of intestinal mucosa is seriously damaged,cells are widely dissolved and necrotic, and a large number of inflammatory cells are infiltrated. B, Structure of intestinal mucosa is intact, cells are arranged in order, scattered goblet cells can be seen, intestinal glands are rich, and lumen is regular. No obvious inflammatory cell infiltration is found.Figure 3 HE staining of intestinal mucosa in rats with liver failure

2.3.4 透射電鏡評估小腸粘膜超微結(jié)構(gòu)

大鼠腸粘膜結(jié)構(gòu)明顯破壞,腸微絨毛排列紊亂,甚至斷裂,細(xì)胞質(zhì)染色變淺,細(xì)胞間隙增寬、線粒體腫脹、基質(zhì)變淺、部分形成空泡,嵴減少、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張、甚至部分裂解,如圖4。

圖4 大鼠腸粘膜透射電鏡病理圖片Note. Normal group (A/B), Intestinal mucosal hairs were arranged orderly, dense, without defect, with complete cell connection, different shapes of mitochondria, endoplasmic reticulum and other organelles. Liver failure model group (C/D), Intestinal mucosal cell structure was destroyed, microvilli arranged disorderly or even fell off, intercellular space widened, cells lost normal structure, mitochondria swelled, matrix became shallow, part of the formation of vacuoles, cristae decreased, or not developed, endoplasmic reticulum expanded, or even partially disintegrated.Figure 4 Pathological images of transmission electron microscopy of intestinal mucosa in rats

3 討論

近年來的“腸-肝軸”理論,認(rèn)為腸粘膜組織功能受損及其所導(dǎo)致的易位細(xì)菌介導(dǎo)的免疫反應(yīng)加劇了ACLF 病情進(jìn)展[6]。 故在著重于肝組織靶臟器本身變化過程的同時,腸道粘膜組織病理改變亦成為研究ACLF 動物模型的新關(guān)注點(diǎn)。

目前國內(nèi)公認(rèn)經(jīng)典ACLF 大鼠造模方法,是劉旭華等[5]在人血白蛋白誘導(dǎo)免疫型肝纖維化大鼠基礎(chǔ)上,一次性腹腔注射LPS 100 μg/kg+D-Gal 400 mg/kg 聯(lián)合誘導(dǎo)建立的大鼠模型,該模型較好地模擬了在肝組織慢性炎癥、纖維化免疫損傷基礎(chǔ)上,腸源性內(nèi)毒素血癥對肝的二次打擊所導(dǎo)致的肝細(xì)胞大片狀壞死性病變的病理特性,故是目前國內(nèi)最主要的ACLF 大鼠造模方法。 然而,該造模方法在完成LPS+D-Gal 的急性攻擊后12 h 死亡率可高達(dá)90%,平均存活時間為(16.1±3.7) h,限制了在長期藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用[7]。 同時該動物模型的評估著眼于肝組織病理生理過程,缺乏對其腸粘膜組織學(xué)評估。

本實(shí)驗(yàn)研究借鑒劉旭華等[5]的造模方法,大鼠34 d 內(nèi)間斷經(jīng)皮下多點(diǎn)注射牛血清白蛋白乳化液后,88%產(chǎn)生牛血清抗體,予以尾靜脈進(jìn)一步注射6周后,肝組織病理學(xué)證實(shí)形成明顯肝纖維化表現(xiàn);再將Gal 由400 mg/kg 減至200 mg/kg,聯(lián)合一次性腹腔注射LPS 100 μg/kg 加以急性攻擊的造模方法,12 h 死亡率降至為29.3%。 通過病理組織學(xué)檢測,光鏡下肝組織呈現(xiàn)大塊、亞大塊壞死,肝小葉結(jié)構(gòu)不清,肝竇明顯擴(kuò)張并充血,肝細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死、甚至凋亡;腸粘膜出現(xiàn)絨毛斷裂、脫落或相互融合,上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤。 運(yùn)用透射電鏡觀察腸粘膜組織超微結(jié)構(gòu),顯示腸粘膜上皮結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重,微絨毛排列紊亂、脫落、甚至壞死,細(xì)胞間隙增寬,細(xì)胞質(zhì)溶解,線粒體腫脹,嵴紊亂并模糊、部分空泡狀等;肝與腸組織的病理與形態(tài)學(xué)表現(xiàn)與ACLF 患者病理表現(xiàn)接近,較好地模擬肝衰竭病理變化過程[8]。 同時,本實(shí)驗(yàn)ACLF 大鼠造模方法簡便易于操作、成模率高、死亡率低,值得進(jìn)一步應(yīng)用推廣。