李 磊,孟紅旭,付建華,金 龍,馬彥雷,史 躍,劉建勛

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,國(guó)家中醫(yī)心血管病研究中心,中藥藥理北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100091)

冠心病是嚴(yán)重威脅現(xiàn)代人類生命和健康、危害極大的疾病,隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)迅速發(fā)展,人口老齡化及城鎮(zhèn)化進(jìn)程加速,我國(guó)冠心病發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加。 長(zhǎng)期以來(lái),冠狀動(dòng)脈主干狹窄所致的心肌供血不足被認(rèn)為是冠心病的主要病因,經(jīng)皮冠脈造影檢查被認(rèn)為是診斷冠心病的“金標(biāo)準(zhǔn)”,然而約20%~30%因胸痛接受冠脈造影檢查的患者并無(wú)明顯的冠狀動(dòng)脈主干和主要分支狹窄或閉塞,這種胸痛被認(rèn)為與冠狀動(dòng)脈微血管功能異常有關(guān),故稱為微血管性心絞痛或心臟X 綜合征[1]。 雖然經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)可以重建心外膜冠狀動(dòng)脈血流供應(yīng),明顯改善急性心肌梗死降低冠心病死亡率,但是PCI 術(shù)后常伴隨出現(xiàn)冠脈緩慢血流(slow flow)或無(wú)復(fù)流(no reflow),臨床觀察這部分患者并未從PCI 治療中受益,梗死區(qū)域冠狀動(dòng)脈微血管病變被認(rèn)為是心肌無(wú)法恢復(fù)正常血液灌注的主要限制因素[2]。 在對(duì)微血管性心絞痛、PCI 術(shù)后無(wú)復(fù)流現(xiàn)象以及肥厚性心肌病等疾病研究的深入,研究者發(fā)現(xiàn)這類疾病的共同發(fā)病機(jī)制與冠狀動(dòng)脈微循環(huán)功能障礙(coronary microvascular dysfunction,CMD)密切相關(guān)[3]。 冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙通常是指發(fā)生于直徑小于300 μm 心臟血管的結(jié)構(gòu)和功能改變[4]。 目前,CMD 發(fā)病機(jī)制仍然沒(méi)有完全被闡明,一般認(rèn)為血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌功能異常,機(jī)械性壓迫、冠脈微栓塞以及缺血再灌注損傷等與CMD 的發(fā)生密切相關(guān)。 不論何種原因?qū)е碌腃MD,最終也會(huì)和心外膜冠脈狹窄一樣導(dǎo)致心肌耗氧的供需失衡,引起臨床癥狀并影響心血管疾病的診療和預(yù)后[5]。

冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙模型動(dòng)物是研究冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙類疾病發(fā)展轉(zhuǎn)歸及評(píng)價(jià)藥物治療作用必不可少的工具。 根據(jù)冠脈微循環(huán)障礙的類型不同和實(shí)驗(yàn)操作的可能,冠脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型的建立常見(jiàn)的方法有在冠脈內(nèi)或心室內(nèi)注射微栓塞劑、缺血再灌注損傷、糖尿病或高血壓等心肌病伴隨微循環(huán)障礙等[6-7]。 栓塞劑注射法具有治病因素單一、可控的優(yōu)勢(shì),常常用于建立急性期的冠脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型,根據(jù)栓塞劑的不同可分為微球機(jī)械性栓塞法、自體微血栓法和化學(xué)損傷內(nèi)皮法[8]。 化學(xué)損傷法一般在大鼠上應(yīng)用,通過(guò)心室內(nèi)或主動(dòng)脈根部注射月桂酸鈉,由于月桂酸鈉具有強(qiáng)烈的內(nèi)皮損傷作用,能夠誘發(fā)血小板黏附、聚集、形成微血栓,而較大動(dòng)脈內(nèi)無(wú)明顯血栓形成[9]。 微球栓塞法多在小型豬、犬等大動(dòng)物上應(yīng)用,多在介入造影輔助下,采用超選擇性冠脈內(nèi)注射微球[10-11]。自體血栓栓塞法由于制備過(guò)程較復(fù)雜,發(fā)病機(jī)理較復(fù)雜,使用并不是很廣泛。 目前,應(yīng)用大鼠建立冠脈微循環(huán)障礙模型的報(bào)道較少,月桂酸鈉損傷法與微球栓塞法建立模型比較研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 因此,本研究旨在比較月桂酸鈉損傷內(nèi)皮法與微球栓塞法冠脈微循環(huán)障礙模型的差異,確定病變程度適合的造模條件,為疾病發(fā)生過(guò)程及治療藥物作用機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF 級(jí)雄性SD 大鼠30 只,體重(340±20)g,由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010]提供。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作及飼養(yǎng)均在中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(京)2018-0018]。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)步驟符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。 該研究經(jīng)中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動(dòng)管理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)(2020XLC007-2),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處置均符合國(guó)家科委2011 年修訂的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》,并遵循:“減少、替他和優(yōu)化”3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

月桂酸鈉購(gòu)于美國(guó)SIGMA 公司;40~120 μm栓塞微球購(gòu)于美國(guó)Merit Medical 公司;肌酸激酶(CK)、肌酸激酶MB 同工酶(CK-MB)以及乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)定試劑盒購(gòu)于和光純耀(上海)化學(xué)有限公司;硫酸阿托品注射液購(gòu)買于上海禾豐制藥有限公司;肝素鈉注射液購(gòu)于常州千紅生化制藥股份有限公司;本實(shí)驗(yàn)其他藥物及器材均為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)器材。

DW-3000S 型雙通道小動(dòng)物呼吸機(jī),安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司;Visual Sonics Vevo2100 系高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)、MS-201 高頻線陣探頭(Fujifilm,日本)公司;MP-150 型多導(dǎo)生理記錄儀、TSD104 型血壓換能器、 DA100C 放大器及AcqKonwleage 4.1 數(shù)據(jù)采集軟件(BioPac,美國(guó));LABOSPECT003 型全自動(dòng)生化分析儀(Hitachi,日本)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物模型制備

30 只SD 雄性大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、月桂酸鈉組和微球栓塞組,每組10 只動(dòng)物。 大鼠常規(guī)麻醉后胸前區(qū)備皮。 為防止分泌物對(duì)呼吸管影響,于術(shù)前10 min 腹腔硫酸注射阿托品注射液。 大鼠取仰臥位固定于手術(shù)板上,把頭頸部拉直固定,先將手術(shù)板底部固定,將大鼠頭部側(cè)上臺(tái)至45°傾角并固定,用小兒麻醉咽喉鏡(壓舌板前段切去一半寬度)觀察大鼠聲門,用心血管介入用導(dǎo)引鋼絲趁大鼠吸氣聲門打開(kāi)時(shí)插入氣管,在導(dǎo)引鋼絲的導(dǎo)引下將氣管插管送入起到氣道,退出導(dǎo)引鋼絲。 將一面小鏡子放于氣管插管口,若見(jiàn)鏡面上隨大鼠呼吸運(yùn)動(dòng)有水霧出現(xiàn),則為插管在氣道內(nèi),將氣管插管與小動(dòng)物呼吸機(jī)連結(jié)。

于左前外側(cè)沿胸骨左側(cè)緣縱向切開(kāi)皮膚,鈍性分離肌層,打開(kāi)大鼠胸腔,暴露第4 肋中部并縱向剪斷,以垂直肋骨方向放置大鼠開(kāi)胸器,輕輕剪開(kāi)心包膜的心臟部位充分暴露[9]。 仔細(xì)分離主動(dòng)脈弓,并在其下穿一棉線,令大鼠穩(wěn)定10 min 后,將棉線兩端提起并用血管夾夾閉主動(dòng)脈,迅速以注射器從心尖部直接向左心室注射0.2 mL 的栓塞微球(微球直徑40~120 μm,約含1000 個(gè)微球)或月桂酸鈉(1 g/L,生理鹽水溶解),注射前要回抽血以確保針尖在心腔中,夾閉20 s 后,松開(kāi)血管夾,待呼吸心跳穩(wěn)定后,徹底止血、逐層縫合肌肉和皮膚,最后關(guān)閉胸腔,見(jiàn)圖1。 拔除氣管插管,術(shù)畢腹腔注射80 萬(wàn)單位青霉素,普通飼養(yǎng)。 假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程采用同樣的操作,區(qū)別僅在于心室內(nèi)注射0.2 mL 生理鹽水。 術(shù)后24 h 再次麻醉動(dòng)物測(cè)定相關(guān)指標(biāo)處死取材。

圖1 大鼠冠脈微循環(huán)障功能礙模型建立Figure 1 Establishment of rat model of coronary microcirculation dysfunction

1.3.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能

動(dòng)物術(shù)后24 h,按1 mL/100 g 劑量腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉溶液麻醉,大鼠麻醉后取仰臥位固定。 當(dāng)大鼠心律趨于持續(xù)性、穩(wěn)定性時(shí)開(kāi)始檢測(cè),在進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查時(shí)要注意觀察大鼠的呼吸狀態(tài),如出現(xiàn)明顯呼吸抑制應(yīng)終止檢查,進(jìn)行呼吸支持。 以高頻探頭進(jìn)行定位,在左室長(zhǎng)軸及胸骨旁短軸各切面應(yīng)用M 模式超聲心動(dòng)圖觀察心臟運(yùn)動(dòng),選用左室長(zhǎng)軸切面計(jì)算左室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末期容積(LVEDV)、左室收縮末期容積(LVESV)、左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室縮短率(FS),各項(xiàng)指標(biāo)均選取連續(xù)測(cè)量5 個(gè)心動(dòng)周期測(cè)量值的平均值[12]。

1.3.3 血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)

將麻醉穩(wěn)定的大鼠仰臥位固定,頸部備皮,分離右頸總動(dòng)脈,結(jié)扎遠(yuǎn)心端,動(dòng)脈夾夾住近心端,經(jīng)右頸動(dòng)脈穿刺插入20 G 靜脈留置針,撤去動(dòng)脈夾,將肝素化留置針?biāo)腿氪笫箢i總動(dòng)脈。 留置針連接壓力換能器,經(jīng)MP-150 型多導(dǎo)生理記錄儀連接電腦,通過(guò)AcqKnowledge 軟件實(shí)時(shí)顯示壓力變化曲線。 待大鼠狀態(tài)穩(wěn)定后,測(cè)定動(dòng)脈收縮壓(SBP)和舒張壓(SDP),計(jì)算平均動(dòng)脈(MAP)。 測(cè)定完動(dòng)脈血壓后,輕柔將留置針插入右心室腔,當(dāng)留置針突然隨心臟搏動(dòng)抖動(dòng)明顯時(shí),應(yīng)減緩?fù)扑退俣取?當(dāng)軟件顯示由血壓波變?yōu)橄逻_(dá)0 mmHg 附近時(shí),表明留置針已經(jīng)通過(guò)主動(dòng)脈瓣進(jìn)入左心室腔內(nèi)[13]。 記錄心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo):左室峰壓(LVSP)、左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(LV+dp/dtmax)、左室內(nèi)壓最大下降速率(LV-dp/dtmax)。 體表標(biāo)準(zhǔn)II 導(dǎo)心電圖計(jì)算心率(HR)。

1.3.4 血清CK、CK-MB 和LDH 活性檢測(cè)

大鼠測(cè)定完血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及超聲心動(dòng)圖之后,腹主動(dòng)脈取血4 mL,室溫靜置1 h 后,2500 r/min,離心10 min,取上清,采用生化分析法檢測(cè)肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脫氫酶LDH 活性。

1.3.5 病理HE 染色

取大鼠心臟組織于4 %多聚甲醛中固定24 h,石蠟包埋,連續(xù)切片(5 μm),蘇木精-伊紅染色,光鏡下觀察心肌組織改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差() 表示,應(yīng)用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,采用One-way ANOVA(單因素方差分析)方法,方差齊性應(yīng)用Student-Newman-Keuls(SNK)檢驗(yàn),方差不齊采用Tamhane’s T2 檢驗(yàn)。P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠超聲心動(dòng)圖的影響

與假手術(shù)組比較,微球栓塞組左室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)明顯增加、LVIDs,左室收縮末期容積(LVESV)明顯增加,每搏輸出量(SV)顯著減少(P<0.05),見(jiàn)表1;左室射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室縮短率FS顯著降低約(P<0.01)。 提示經(jīng)左心室注射40~120 μm 栓塞微球,造模24 h 后可以明顯降低動(dòng)物心功能。 與假手術(shù)組比較月桂酸鈉組各項(xiàng)超聲心動(dòng)圖指標(biāo)未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2、表1)。

表1 大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)的變化Table 1 Changes of echocardiography parameters in rats

圖2 對(duì)大鼠超聲心動(dòng)圖變化Note. A, Sham group. B, Laurate group. C, Microsphere group.Figure 2 Changes of echocardiography in rats

2.2 對(duì)大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)的影響

月桂酸鈉組和微球栓塞組大鼠動(dòng)脈收縮壓、舒張壓及平均動(dòng)脈壓略低于假手術(shù)組,各組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;大鼠心率在各組間未見(jiàn)明顯差異(數(shù)據(jù)略)。 月桂酸鈉組和微球栓塞組大鼠左室峰壓略低于假手術(shù)組,各組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;各組間左室舒張末壓未明顯差異;微球栓塞組左室內(nèi)壓最大上升速率明顯低于假手術(shù)組,兩組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05,月桂酸鈉組與假手術(shù)組未見(jiàn)明顯差異。各組間左室內(nèi)壓最大下降速率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3、圖4)。

圖3 大鼠左室內(nèi)壓變化速率Note. Anterior portion indicate the change rate of arterial blood pressure, posterior portion indicate the change rate of left ventricular internal pressure. A, Sham group. B, Laurate group.C, Microsphere group.Figure 3 Changes rate of left ventricular pressure in rats

圖4 大鼠心室內(nèi)壓改變Note. A, Sham group. B, Laurate group. C, Microsphere group. Compared with the sham group,?P<0.05.Figure 4 Changes of left ventricular pressure in rats

2.3 對(duì)大鼠血清CK、CK-MB 和LDH 的影響

與假手術(shù)比較,兩種造模方法均可以升高大鼠血清CK、CK-MB、LDH 活性,然而月桂酸鈉組與假手術(shù)組比較未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 微球栓塞組可以顯著升高CK-MB 與LDH 活性與假手術(shù)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 大鼠心肌酶的變化Table 2 Changes of myocardial enzymes in rats

2.4 對(duì)大鼠心肌HE 染色影響

HE 染色見(jiàn)假手術(shù)組大鼠心肌纖維排列整齊,心肌細(xì)胞胞漿豐富,細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則。 月桂酸鈉組大鼠心肌細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的溶解、斷裂;心肌間不同程度的淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),心肌內(nèi)微血栓形成。 微球栓塞組心臟病變同月桂酸鈉組相似,均出現(xiàn)不同程度的心肌溶解、斷裂;心肌間淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和纖維組織增生,心臟外膜可見(jiàn)不同程度的充血,炎細(xì)胞浸潤(rùn),并可見(jiàn)微球栓塞(圖5)。

圖5 大鼠心臟組織HE 染色變化Note. A, Sham group. B, Laurate group. C, Microsphere group. Black arrow indicates microthrombosis. Red arrow indicates microsphere embolism.Figure 5 Changes of HE staining in rat heart tissue

3 討論

冠狀動(dòng)脈微栓塞是引起冠脈微循環(huán)障礙的重要原因,建立冠脈微栓塞的動(dòng)物模型是探討冠脈微循環(huán)障礙發(fā)生、發(fā)展病理生理過(guò)程、研究藥物作用及機(jī)制的重要實(shí)驗(yàn)平臺(tái)[14]。 本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)兩種不同造模方法建立的冠脈微循環(huán)障礙模型進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示通過(guò)心室內(nèi)注射月桂酸鈉注射后可以損傷血管內(nèi)皮形成微血栓,栓塞微球則直接以物理栓塞的方式導(dǎo)致微血管栓塞,兩種造模方法均可以造成冠脈微循環(huán)障礙,對(duì)大鼠心臟功能有一定影響。 栓塞微球較月桂酸鈉造模更加穩(wěn)定,在模型建立后24 h 可見(jiàn)明顯心功能降低、血流動(dòng)力學(xué)改變及心肌酶升高。

制作冠脈微栓塞動(dòng)物模型的栓塞劑(致栓劑)主要有月桂酸鈉、栓塞微球、自體血栓等。 自體血栓雖然符合臨床微血栓栓子特點(diǎn),但制備相對(duì)復(fù)雜,且凝固后研磨成的顆粒狀栓子的數(shù)量和大小不均,不能模擬血管內(nèi)皮損傷后始動(dòng)的病變,在實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用并不多。 月桂酸鈉可導(dǎo)致血管內(nèi)膜損傷、脫落、穿孔,促進(jìn)血小板粘附、聚集,形成閉塞性血栓造成冠脈微循環(huán)阻塞,而較大的動(dòng)脈內(nèi)無(wú)明顯血栓形成,較自體血栓法更加接近實(shí)際病理發(fā)展過(guò)程[15];該法的主要缺點(diǎn)在于不是臨床上冠脈微循環(huán)血栓形成的常見(jiàn)病因。 有文獻(xiàn)報(bào)道,100 μg 月桂酸鈉冠脈內(nèi)注射時(shí)幾乎形成不了冠脈微血栓,而200 μg 月桂酸鈉在冠脈注射1 h 后即有微小動(dòng)脈血栓形成,3 h 后達(dá)到高峰,在此后的12~24 h 逐漸降低[16]。 本研究采用的月桂酸鈉劑量為200 μg,注射24 h 后在100 μm 以下的微血管可見(jiàn)微血栓形成,而模型24 h 時(shí)血流動(dòng)力學(xué)、心功能及心肌酶等指標(biāo)與假手術(shù)組比較未見(jiàn)明顯差異,這可能與微血管血栓形成減少有關(guān)。

經(jīng)冠脈內(nèi)注射栓塞微球是建立大動(dòng)物冠脈微循環(huán)障礙的常用方法,栓塞微球形成微栓塞機(jī)制與臨床上冠脈血運(yùn)重建術(shù)后微血栓、內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮脫落、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂碎片脫落后,隨血流至冠脈微血管致栓塞原理類似。 由于大鼠心臟較小無(wú)法使用臨床心導(dǎo)管介入技術(shù)將栓塞微球超選擇注射到冠脈里,通常使用心室內(nèi)注射栓塞微球,暫短夾閉主動(dòng)脈的方法建立冠脈微栓塞導(dǎo)致的冠脈微循環(huán)障礙模型[17-18]。 臨床尸檢顯示心臟性猝死中微血管栓塞89%發(fā)生于小120 μm 的血管,在小于120 μm 的血管栓塞中39%發(fā)生于小于40 μm 的微血管,46%發(fā)生于40~80 μm 的微血管,15%發(fā)生于81~120 μm 的微血管[19]。 因此,冠脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型通常采用42 μm 微球或40~120 μm 混合微球冠脈內(nèi)注射模擬臨床冠脈微血管栓塞,大鼠實(shí)驗(yàn)中常采用心室內(nèi)注射1000~3000 個(gè)微球進(jìn)行造模[20-21]。 本研究采用了40~120 μm 混合栓塞微球約1000 個(gè)進(jìn)行了心室內(nèi)注射造模,造模術(shù)后24 h后可見(jiàn)栓塞微球阻塞,與假手術(shù)比較可以明顯降低左室內(nèi)壓最大上升速率、降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心功能降低超聲心動(dòng)圖EF 和FS 值等,升高心肌損傷指標(biāo)CKMB 和LDH。

與假手術(shù)組比較,月桂酸鈉組與微球栓塞組動(dòng)物心臟組織病理HE 染色,并未見(jiàn)大量的壞死心肌細(xì)胞、炎細(xì)胞浸潤(rùn)等嚴(yán)重的心肌組織受損,這可能與造模為微血管損傷并未損傷大血管的血供,組織可以從鄰近的微血管獲取血供,以及造模時(shí)間較短(24 h)有關(guān),之后研究將進(jìn)一步探索適合冠脈微循環(huán)障礙評(píng)價(jià)的病理染色方法。

綜上所述,本研究所用的心室內(nèi)注射月桂酸鈉及栓塞微球兩種造模方法均可以造成冠脈微循環(huán)障礙,對(duì)大鼠心臟功能有一定影響。 兩種造模方式導(dǎo)致冠脈微循環(huán)障礙的程度有所不同,微球栓塞法較月桂酸鈉法建立的動(dòng)物模型關(guān)鍵指標(biāo)更加穩(wěn)定,可廣泛應(yīng)用于冠脈微循環(huán)障礙的發(fā)病機(jī)制、藥物治療作用等研究。